Summary
8 oxoguanine डीएनए glycosylase की glycosylase गतिविधि के लिए समय पाठ्यक्रमों उत्पाद गठन और एक रेखीय स्थिर राज्य चरण का फट प्रदर्शन biphasic हैं. क्रमशः, 8 oxoguanine और उत्पाद डीएनए से glycosylase की रिहाई की छांटना के अनुरूप जो बुझाना प्रवाह तकनीक, फट और स्थिर राज्य दरों मापा जा सकता है, का उपयोग.
Abstract
मानव 8 oxoguanine डीएनए glycosylase (OGG1) डीएनए से mutagenic oxidative डीएनए घाव 8-oxo-7, 8-dihydroguanine (8 oxoG) excises. OGG1 की काइनेटिक लक्षण वर्णन 8 oxoG छांटना और उत्पाद जारी करने की दर को मापने के लिए किया जाता है. OGG1 एकाग्रता सब्सट्रेट डीएनए से कम है, उत्पाद के गठन के समय पाठ्यक्रम biphasic हैं, उत्पाद निर्माण की एक तेजी घातीय चरण (यानी फट) एक रेखीय स्थिर राज्य चरण के बाद है. उत्पाद गठन की प्रारंभिक फट ठीक सब्सट्रेट पर लगे एंजाइम की एकाग्रता से मेल खाती है, और फट आयाम एंजाइम की एकाग्रता पर निर्भर करता है. फट से लगातार पहली आदेश दर 8 oxoG छांटना की आंतरिक दर से मेल खाती है और धीमी गति से स्थिर राज्य दर उत्पाद जारी (निरंतर उत्पाद डीएनए हदबंदी दर, कश्मीर बंद) की दर के उपाय. यहाँ, हम स्थिर राज्य, पूर्व स्थिर राज्य, और एकल कारोबार दृष्टिकोण सपा को अलग करने और मापने के लिए वर्णनOGG1 उत्प्रेरक साइकिल चालन के दौरान ecific कदम. एक फ्लोरोसेंट लेबल घाव युक्त oligonucleotide और शुद्ध OGG1 सटीक गतिज माप की सुविधा के लिए उपयोग किया जाता है. कम एंजाइम सांद्रता स्थिर राज्य माप, प्रतिक्रिया के अभिकर्मकों के मिश्रण का मार्गदर्शन और शमन बनाने के लिए उपयोग किया जाता है के बाद से स्थिर राज्य दर (कश्मीर बंद) का पता लगाने के लिए किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, शून्य समय में तालमेल पर एक बिंदु पर स्थिर राज्य दर के निष्कर्षों उत्पाद गठन के एक फट पहले कारोबार (यानी Y-अवरोधन सकारात्मक है) के दौरान हुई कि इंगित करता है. घातीय फट चरण की लगातार पहली आदेश दर स्थिर राज्य चरण से पहले कम समय के अंतराल (<1 सेकंड) पर गठित उत्पाद की मात्रा की जाँच और 8 की दर से मेल खाती है कि एक तेजी से मिश्रण और शमन तकनीक का उपयोग करके मापा जा सकता है -oxoG छांटना (यानी रसायन शास्त्र). उत्प्रेरक सायकलिंग है जहां रासायनिक कदम भी एक एकल कारोबार के दृष्टिकोण का उपयोग करके मापा जा सकता हैएंजाइम (ई> एस) के साथ saturating सब्सट्रेट डीएनए से रोका. इन तरीकों एक डीएनए घाव को हटाने की दक्षता को प्रभावित करती है कि प्राथमिक दर स्थिरांक उपाय कर सकते हैं.
Introduction
एक एरोबिक वातावरण जीनोमिक अस्थिरता उतावली. Oxidative तनाव से उत्पन्न एक प्रमुख promutagenic डीएनए घाव 7,8-Dihydro-8-oxoguanine (8 oxoG) है. यह 8 oxoG की अस्पष्ट कोडिंग की क्षमता की वजह से है. मानव 8 oxoguanine डीएनए glycosylase (OGG1) 8 oxoG के आधार काटना की मरम्मत शुरू करने के लिए जिम्मेदार है. OGG1 की glycosylase गतिविधि एक apurinic साइट (एपी साइट पर) के साथ उत्पाद डीएनए में जिसके परिणामस्वरूप 8 oxoG आधार excises. OGG1 की एक कमजोर lyase गतिविधि कुछ उदाहरणों में एपी साइट काटकर अलग कर सकते हैं.
डीएनए glycosylases की काइनेटिक लक्षण वर्णन आम तौर पर वे biphasic समय पाठ्यक्रमों कि प्रदर्शन पाता है. उत्पाद गठन की एक शुरुआती तेजी चरण (यानी फट) के बाद, एक रेखीय स्थिर राज्य चरण 1-3 मनाया जाता है. यह व्यवहार बर, जबकि रसायन शास्त्र (यानी गठनात्मक परिवर्तन या उत्पाद विज्ञप्ति) समय पाठ्यक्रम के रैखिक भाग के दौरान दर सीमित किया जा रहा है के बाद एक कदम का संकेत हैअक्सर क्षणिक चरण के रूप में भेजा सेंट चरण,, प्रतिक्रिया के पहले चक्र के दौरान एंजाइम सक्रिय स्थल पर उत्पाद गठन से मेल खाती है. उत्पाद जारी स्थिर राज्य चरण के दौरान सीमित दर है, जब गतिविधि माप उत्पाद डीएनए बंधन आत्मीयता की एक गुणात्मक उपाय प्रदान करते हैं, लेकिन एंजाइम सक्रिय साइट (यानी रसायन शास्त्र) में घटनाओं के विषय में गतिज जानकारी प्रदान नहीं करते हैं. तदनुसार, घातीय पूर्व स्थिर राज्य फट चरण अलग करने और मापने के लिए तरीकों एंजाइम सक्रिय साइट 4 में पहले enzymatic कारोबार के दौरान की घटनाओं की जांच के लिए आवश्यक हैं.
(1) स्थिर राज्य, (2) पूर्व स्थिर राज्य, और (3) एकल कारोबार OGG1 का उत्प्रेरक व्यवहार को चिह्नित करने के लिए तीन मानक गतिज दृष्टिकोण, वहाँ रहे हैं. इन तरीकों प्रतिक्रिया मिश्रण में एंजाइम की एकाग्रता और प्रत्येक दृष्टिकोण में उपयोग किया सब्सट्रेट के अनुपात में एंजाइम द्वारा एक दूसरे से अलग. एक ठेठ स्थिर राज्य दृष्टिकोण में,कभी कभी कई कारोबार कैनेटीक्स के रूप में भेजा, एंजाइम की कम मात्रा उत्पाद गठन का पालन करने के लिए उपयोग किया जाता है. कई एंजाइमी टर्नओवर काफी सब्सट्रेट एकाग्रता प्रभावित नहीं करते कि इतना सब्सट्रेट एकाग्रता बहुत एंजाइम एकाग्रता से अधिक है. इस स्थिति में, समय पाठ्यक्रम रैखिक होना चाहिए और यह एक फट इस दृष्टिकोण में इस्तेमाल कम एंजाइम एकाग्रता की वजह से पहले कारोबार के दौरान हुई कि क्या विचार करने के लिए कई बार मुश्किल है, ध्यान दें फट आयाम एंजाइम एकाग्रता के बराबर है. यह एक उच्च एंजाइम एकाग्रता का उपयोग करते हुए और पहले enzymatic कारोबार जल्दी हुआ कि क्या पता लगाने के लिए शून्य समय रैखिक समय पाठ्यक्रम extrapolating द्वारा दूर किया जा सकता है. तालमेल पर अवरोधन (शाफ़्ट) एंजाइम एकाग्रता के लिए आनुपातिक होना और सक्रिय रूप से सब्सट्रेट के साथ लगे हुए एंजाइम का एक उपाय प्रदान करना चाहिए. इस दृष्टिकोण के सिद्धांत में एक फट चरण के अस्तित्व के लिए सबूत है, एक अलग प्रदान कर सकते हैंअलग दृष्टिकोण फट चरण के कैनेटीक्स को मापने के लिए आवश्यक है. कई मामलों में फट चरण मार्गदर्शन मिला और शमन तकनीक से मापने के लिए भी तेजी है. इस स्थिति में, पूर्व स्थिर राज्य और एकल कारोबार गतिज (यानी क्षणिक गतिज) अक्सर एक प्रतिक्रिया 5 के शुरुआती समय बिंदुओं का पालन करने के लिए एक तेजी से मिश्रण और शमन साधन की आवश्यकता दृष्टिकोण. एक पूर्व स्थिर राज्य दृष्टिकोण में एंजाइम की उच्च सांद्रता उत्पाद का एक महत्वपूर्ण राशि पहले कारोबार के दौरान गठन किया गया है ताकि उपयोग किया जाता है. कई टर्नओवर उत्प्रेरक साइकिल चालन (यानी फट है कि इस प्रकार रैखिक चरण) का निरीक्षण करने के लिए पीछा कर रहे हैं, सब्सट्रेट एकाग्रता एंजाइम एकाग्रता ([एंजाइम] <[सब्सट्रेट]) से अधिक है. उत्प्रेरक साइकिल चालन के बिना एंजाइम सक्रिय स्थल पर घटनाओं को अलग करने के लिए, एकल कारोबार शर्तों का उपयोग किया जाता है. इस मामले में, सब्सट्रेट सब्सट्रेट के सभी मैं भाग लेने के लिए इतना है कि (ई >> एस) एंजाइम के साथ संतृप्त हैएन 'एकल कारोबार' और आम तौर पर एक एकल घातीय समय पाठ्यक्रम प्रदर्शन करेंगे.
एक फट चरण, उत्पाद जारी (कश्मीर बंद) है कि प्रदर्शन एंजाइमों के लिए ऊपर के रूप में विख्यात अक्सर समय निश्चित रूप से स्थिर राज्य चरण की दर को सीमित करता है. उत्पाद जारी (वी एस एस, सान्द्र. / समय) की दर रैखिक स्थिर राज्य चरण की ढलान से निर्धारित किया जा सकता है. सक्रिय एंजाइम एकाग्रता (ई) लगातार एक आंतरिक मूल्यांकन करने के लिए उत्पाद की रिहाई की दर बदलने की जरूरत है जहां कश्मीर बंद = वी एस एस / [ई]. महत्वपूर्ण बात है, सक्रिय एंजाइम एकाग्रता दोष के कारण मापा प्रोटीन एकाग्रता, निष्क्रिय एंजाइम, एंजाइम गैर उत्पादक सब्सट्रेट करने के लिए बाध्य है, और प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण किया जाता विधि की तुलना में आम तौर पर कम है. उत्पाद जारी धीमी है जब सक्रिय एंजाइम एकाग्रता फट आयाम से निर्धारित किया जा सकता है. इस प्रकार, के लिए एक स्थिर राज्य समय पाठ्यक्रम extrapolatingशून्य समय मनाया स्थिर राज्य दर से कश्मीर बंद (उत्पाद जारी) की गणना करने के लिए आवश्यक रूप से सक्रिय एंजाइम के एक अनुमान प्रदान करता है.
पटाखे के कैनेटीक्स को मापने के लिए, एक पूर्व स्थिर राज्य दृष्टिकोण रैखिक स्थिर राज्य चरण से पहले होता है कि पहले कारोबार के दौरान उत्पाद गठन का पालन करने के लिए आवश्यक है. फट कैनेटीक्स एंजाइम उत्पाद मध्यवर्ती के गठन इस प्रकार है. प्रतिक्रिया सब्सट्रेट के साथ मिश्रण एंजाइम द्वारा शुरू की है एक बार प्रतिक्रिया एक स्थिर राज्य चरण तक पहुँच जाता है, जब तक एंजाइम उत्पाद की मात्रा तेजी से बढ़ जाती है. कटैलिसीस और अधिक तेजी से उत्पाद जारी करने से है, तो फट के आयाम को संभालने, उत्पाद के लिए सब्सट्रेट के रासायनिक रूपांतरण की दर से मेल खाती है संतुलन के लिए सक्रिय रूप से लगे हुए एंजाइम और मनाया घातीय दृष्टिकोण (कश्मीर ओ बीएस) के बराबर है कि रिवर्स दर रसायन शास्त्र नगण्य है.
कुछ उदाहरणों उत्प्रेरक cy मेंचिपकी इस तरह के रसायन शास्त्र और उत्पाद जारी करने के लिए दरों का परिमाण काफी अलग नहीं कर रहे हैं के रूप में एक पूर्व स्थिर राज्य विश्लेषण, के साथ हस्तक्षेप. इस मामले में, सब्सट्रेट करने के लिए अतिरिक्त एंजाइम रिश्तेदार को रोजगार एक भी कारोबार के लिए एंजाइम के साथ ही उत्प्रेरक साइकिल और सीमा सब्सट्रेट से बचाता है. पहली आदेश दर लगातार कश्मीर (ओ बीएस) के रूप में तदनुसार प्रतिक्रिया की पहली रासायनिक कदम अलग किया जा सकता है और इसे सही निर्धारित की. लगातार इस दर ओ बीएस कश्मीर के समान ऊपर वर्णित पूर्व स्थिर राज्य दृष्टिकोण से निर्धारित किया जाना चाहिए.
यहाँ हम इन गतिज दृष्टिकोण OGG1 की glycosylase गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है वर्णन कैसे.
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Protocol
1. एनजाइम और डीएनए सब्सट्रेट की तैयारी
- ई. में जीएसटी संलयन प्रोटीन के रूप में अधिक व्यक्त OGG1 कोली, शुद्धि के लिए जीएसटी टैग का उपयोग, और फिर HRV -3 सी प्रोटीज (चित्रा 1) 6 के साथ दरार से जीएसटी टैग हटा दें.
- एक भी 8 oxoG अवशेषों से युक्त रासायनिक संश्लेषित 5'-6 carboxyfluorescein (6 परिवार) लेबल oligonucleotide और उसके पूरक unlabeled oligonucleotide किनारा खरीद. 34 पूर्व oligonucleotides के 5'-अंत से स्थिति 17 पर एक 8 oxoG होते हैं. जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा इन oligonucleotides के शुद्ध.
- Annealing बफर में 1:1.2 की एक दाढ़ अनुपात (10 मिमी Tris-एचसीएल, 7.5 पीएच, 50 मिमी NaCl, 1 पर इसकी पूरक किनारा साथ मिश्रण 5'-6 परिवार लेबल oligonucleotide द्वारा 8 oxoG युक्त डबल असहाय डीएनए सब्सट्रेट तैयार एक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब में मिमी EDTA). 5 मिनट के लिए उबलते पानी में एक नाव में ट्यूब रखें. अनुसंधान करने के लिए धीरे धीरे पानी ठंडा करते हैं तो जगह में ट्यूब छोड़ दो औरoom तापमान (यह लगभग 2 घंटे लगते हैं).
- फ्लोरोसेंट लेबल की photobleaching कम से कम करने के रूप में इतनी कम या कम से कम प्रकाश परिस्थितियों में नमूना तैयार करने और प्रयोग.
2. स्थिर राज्य टाइम कोर्स और OGG1 की सक्रिय साइट अनुमापन का मापन
2.1. नमूना तैयार करने और स्थिर राज्य समय पाठ्यक्रम
- बर्फ पर 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब में (50 मिमी HEPES, 7.5 पीएच, 20 मिमी KCl, 0.5 मिमी EDTA, और 0.1% गोजातीय सीरम albumin) प्रतिक्रिया बफर में अलग डीएनए सब्सट्रेट और OGG1 समाधान तैयार है. डीएनए की एकाग्रता 400 एनएम है और OGG1 के स्पष्ट एकाग्रता, 60 30, 90, या 120 एनएम के रूप में एक ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख द्वारा निर्धारित की. 37 में एक गर्मी ब्लॉक सेट में प्रतिक्रिया ट्यूबों प्लेस डिग्री सेल्सियस 37 में पूर्व सेते एंजाइम और अलग डीएनए सब्सट्रेट समाधान ° 1 मिनट के लिए सी.
- Pipetting द्वारा OGG1 और डीएनए सब्सट्रेट समाधान के बराबर मात्रा में मिलाकर रिएक्शन शुरू. इन समाधान मिश्रण के बादमाहौल 1:1 (v / v), अंतिम सांद्रता 200 एनएम डीएनए और 15, 30, 45, या 60 एनएम OGG1, क्रमशः रहे हैं. समय के अंतराल पर aliquots (10 μl) निकालें और 1 एम NaOH के 1 μl के साथ मिश्रण से प्रतिक्रिया बुझाने. समय पाठ्यक्रम, एंजाइम के बिना प्रतिक्रिया मिश्रण के 10 μl के लिए नियंत्रण 1 एम NaOH के 1 μl के साथ मिलाया जाता है.
- फोड़ना करने के लिए 5 मिनट परिणामी उत्पाद एपी साइट के लिए एक 90 डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक में प्रतिक्रिया नमूने रखें. गर्म करने के बाद, प्रत्येक नमूना बेअसर करने के लिए 1 एम एचसीएल के 1 μl जोड़ें.
- प्रत्येक प्रतिक्रिया नमूना को जेल लोड बफर के एक बराबर मात्रा (12 μl) (95% formamide, 20 मिमी EDTA, 0.02% bromophenol, और 0.02% xylene cyanol) जोड़ें, और फिर 95 डिग्री सेल्सियस पर सेट एक गर्मी ब्लॉक में मिश्रण जगह 2 मिनट के लिए, तो तुरंत बर्फ पर ट्यूब जगह.
- 89 मिमी Tris-एचसीएल, पीएच 8.8, 89 मिमी बोरिक एसिड, और 2 मिमी EDTA में 8 एम यूरिया युक्त 15% denaturing polyacrylamide जेल पर नमूने (5 μl) लोड. सब्सट्रेट और cleaved उत्पादों के बाद अच्छी तरह से अलग हो रहे हैंजेल चल रहा है.
2.2. जेल की इमेजिंग
- Fluorescently लेबल डीएनए का पता लगाने और सब्सट्रेट और उत्पाद बैंड कल्पना कर सकते हैं कि एक इमेजर का उपयोग कर जेल स्कैन करें.
- इमेजिंग जेल के बाद बैंड यों. कुछ पृष्ठभूमि दरार NaOH (2A चित्रा) के साथ सब्सट्रेट खुद के इलाज के बाद देखा जा सकता है कि ध्यान दें. प्रत्येक प्रतिक्रिया उत्पाद का मापा राशि से इस पृष्ठभूमि घटाना.
2.3. डेटा विश्लेषण
- प्रत्येक प्रतिक्रिया समय (टी) (चित्रा 2 बी) पर गठित उत्पाद की राशि प्लॉट. फट (ए 0, y अवरोधन) और रैखिक स्थिर राज्य चरण (वी एस एस) की ढलान के आयाम को निर्धारित करने के लिए समीकरण 1 का उपयोग कच्चे डेटा का विश्लेषण.
- भूखंड, एंजाइम सक्रिय अंश का एक उपाय प्रदान करने, y-अवरोधन कुल प्रोटीन एकाग्रता (चित्रा -2 यानी स्पष्ट एंजाइम एकाग्रता) के सापेक्ष. सक्रिय एंजाइम के अंश का निर्धारण करने के लिए सुधार कारक प्रदान करने के लिए एक शून्य अवरोधन के साथ एक रेखीय फिट का उपयोग करें.
- उत्पाद हदबंदी दर लगातार प्रदान करने, सक्रिय एंजाइम एकाग्रता (चित्रा 2 डी) के सापेक्ष स्थिर राज्य दर प्लॉट (सज्जित लाइन यानी ढलान).
3. पूर्व स्थिर राज्य टाइम कोर्स का मापन
जैसा कि चित्र 2, फट चरण के दौरान उत्पाद गठन में दिखाया पुस्तिका मिश्रण और शमन से मापने के लिए भी तेजी है. इसलिए, एक तेजी से बुझाना प्रवाह साधन मिलीसेकंड समय के पैमाने (चित्रा 3) 5 पर होती है कि तेजी से प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए एक शक्तिशाली तरीका प्रदान कर सकते हैं. साधन तेजी से एक मिश्रण करने के लिए एक कंप्यूटर नियंत्रित ड्राइव मोटर का उपयोग करता हैएन डी निर्दिष्ट प्रतिक्रिया समय के बाद प्रतिक्रियाओं बुझाना. उदाहरण के लिए, प्रारंभिक फट चरण और OGG1 द्वारा उत्प्रेरित उत्पाद गठन के बाद स्थिर राज्य चरण को मापने के लिए एक kintek RQF -3 रैपिड बुझाना फ्लो साधन का उपयोग करें. रैपिड बुझाना फ्लो उपकरण कई निर्माताओं से उपलब्ध हैं.
3.1. नमूने की तैयारी
उधर 2-1 में वर्णित के रूप में 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में डीएनए सब्सट्रेट और OGG1 समाधान तैयार करते हैं. डीएनए और सक्रिय OGG1 की सांद्रता क्रमश: 400 एनएम और 80 एनएम हैं. अंतिम 200 एनएम डीएनए की सांद्रता और 40 एनएम मिश्रण 1:1 (v / v) के बाद सक्रिय OGG1 में यह परिणाम है.
3.2. तेजी से बुझाना प्रवाह साधन की तैयारी
- तापमान नियंत्रण के लिए तेजी से बुझाना प्रवाह साधन (37 डिग्री सेल्सियस) के लिए एक परिसंचारी पानी के स्नान से कनेक्ट करें.
- साधन मापदंडों को समायोजित करने और वांछित समय के लिए उचित प्रतिक्रिया पाश चयन निर्माता के निर्देश के अनुसार अंकमाहौल. प्रतिक्रिया छोरों वैकल्पिक प्रतिक्रिया समय प्रदान करने के लिए चर लंबाई के हैं.
- प्रतिक्रिया बफर तैयार करें और NaOH के 10 मिलीलीटर Luer ताला डिस्पोजेबल सीरिंज में समाधान बुझाने और ड्राइव बंदरगाहों के लिए इन सीरिंज देते हैं और प्रतिक्रिया बफर (सीरिंज बी) और 142 मिमी NaOH (सिरिंज क्यू) (लोड स्थिति में सिरिंज लोड वाल्व) के साथ ड्राइव जलाशयों लोड . सिरिंज से हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए, कई बार आगे पीछे समाधान काम करते हैं.
- Stepper मोटर लोअर यह संपर्क सीरिंज के शीर्ष (फायर स्थिति में सिरिंज लोड वाल्व और नमूना लोड वाल्व) तक.
- नमूना लूप्स, रिएक्शन लूप, और पानी और मेथनॉल के साथ बाहर निकलें पंक्ति फ्लश. पूरी तरह से प्लावित क्षेत्रों (फ्लश स्थिति में वाल्व) सूखी.
3.3. पूर्व स्थिर राज्य समय पाठ्यक्रम
- एक 16 गेज सुई का उपयोग कर एक छाया 1.5 मिलीलीटर ट्यूब के शीर्ष में एक छेद बनाओ. बुझती प्रतिक्रिया इकट्ठा करने के लिए बाहर निकलें पंक्ति में एक ट्यूब देते हैं.
- वांछित reactio सेटकीपैड का उपयोग n समय (सेकंड में). लगातार बुझाना मात्रा बनाए रखने के लिए के रूप में Stepper मोटर तो पाश मात्रा के लिए समायोजित करने के लिए वापस होगा. ड्राइव बंदरगाहों से जुड़ी डिस्पोजेबल सीरिंज के साथ बफर जोड़कर Stepper मोटर मंच के खिलाफ सिरिंज बी के लिए स्थिति plungers.
- डीएनए सब्सट्रेट के साथ 1 मिलीलीटर Luer ताला डिस्पोजेबल सीरिंज और OGG1 समाधान, क्रमशः (लोड स्थिति में नमूना वाल्व) भरें. नमूना लोड बंदरगाहों में से प्रत्येक के लिए डीएनए सब्सट्रेट और OGG1 समाधान के साथ सीरिंज देते हैं, और तब (लोड स्थिति में नमूना लोड वाल्व) क्रमश: डीएनए सब्सट्रेट और OGG1 समाधान के साथ नमूना लूप्स भरें.
- आग की स्थिति के लिए सभी सिरिंज लोड वाल्व और नमूना लोड वाल्व सेट करें. एक कीपैड स्ट्रोक ("जी" या "स्टार्ट" कुंजी का उदाहरण प्रेस) द्वारा रिएक्शन शुरू. डीएनए सब्सट्रेट और OGG1 समाधान (18 μl प्रत्येक) तुरंत रिएक्शन लूप में मिश्रित कर रहे हैं.
- प्रतिक्रिया स्वतः आर के 36 μl मिश्रण से वांछित प्रतिक्रिया समय पर बुझती है जब तक प्रतीक्षा करें142 मिमी NaOH के 86 μl के साथ eaction मिश्रण. शमन प्रतिक्रिया के बाद, नमूना निकलें रेखा से छुट्टी दे दी है.
- लोड स्थिति और फ्लश स्थिति के लिए नमूना लोड वाल्व के लिए सिरिंज लोड वाल्व सेट करें. नमूना लूप्स, रिएक्शन लूप, और पानी और मेथनॉल के साथ बाहर निकलें पंक्ति फ्लश और 3.2 में वर्णित के रूप में सूखी. हर बार बात के लिए ऊपर प्रक्रिया को दोहराएँ.
- मैन्युअल रूप से या तेजी से बुझाना साधन के साथ किया जा सकता है, जो एक पृष्ठभूमि सुधार, निर्धारित करने के लिए एंजाइम के बिना किसी नियंत्रण के प्रयोग को पूरा करें. तेजी से बुझाना साधन के साथ एक नियंत्रण करने के लिए, डीएनए सब्सट्रेट के साथ डीएनए के लिए नमूना लूप भरने लेकिन OGG1 खाली के लिए नमूना लूप रखना. प्रतिक्रिया समय निर्धारित करें, मिश्रण प्रदर्शन और के रूप में 3.3.4-3.3.6 में वर्णित बुझाना.
- 2 एम NaOH, 2 एम एचसीएल, पानी, और मेथनॉल के साथ नमूना लूप्स और रिएक्शन लूप धो लें और फिर धोया लाइनें सूखी. घर की स्थिति को Stepper मोटर स्थापित करने के बाद, लोड पदों के लिए सिरिंज लोड वाल्व स्विचn और पानी के साथ ड्राइव जलाशयों धो लो.
- तो बुझती प्रतिक्रिया गर्मी के साथ नमूने, और 2.1 में वर्णित के रूप में जेल वैद्युतकणसंचलन denaturing 15% से अलग सब्सट्रेट और उत्पाद डीएनए समझो.
- कल्पना और 2.2 में वर्णित के रूप में जेल पर बैंड यों.
3.4. डेटा विश्लेषण
लगातार पहली आदेश दर (कश्मीर ओ बीएस), फट (ए 0) के आयाम प्रदान करने के एक बढ़ती घातीय और रैखिक शर्तों (2 समीकरण) के साथ एक समीकरण के लिए गैर रेखीय प्रतिगमन विश्लेषण द्वारा उत्पाद के गठन के समय पाठ्यक्रम फ़िट, और एक रेखीय दर (वी एस एस).
4. एकल कारोबार टाइम कोर्स
- 2-1 में वर्णित के रूप में अलग 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में डीएनए सब्सट्रेट और OGG1 तैयार. concentraडीएनए और सक्रिय OGG1 का माहौल क्रमश: 100 एनएम और 500 एनएम रहे हैं, इस पैदावार मिश्रण 1:1 (v / v) के बाद 50 एनएम डीएनए और 250 एनएम OGG1 के अंतिम सांद्रता.
- तेजी से बुझाना प्रवाह साधन तैयार है और 3.2 और 3.3 में वर्णित के रूप में प्रतिक्रिया के नमूने तैयार करते हैं.
- गर्मी के साथ बुझती प्रतिक्रिया नमूने समझो और 2.1 में वर्णित के रूप में 15% अलग सब्सट्रेट और उत्पादों को जेल वैद्युतकणसंचलन denaturing उन्हें विषय.
- कल्पना और 2.2 में वर्णित के रूप में जेल पर बैंड यों.
- 3 समीकरण में दिए गए पहले के आदेश दर लगातार कश्मीर (ओ बीएस) निर्धारित करने के लिए एक एकल घातीय के लिए उत्पाद के गठन के समय पाठ्यक्रम फ़िट.
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Representative Results
स्थिर राज्य गतिज विश्लेषण एक ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख 2 द्वारा निर्धारित 200 एनएम डीएनए सब्सट्रेट और OGG1 के चार अलग अलग स्पष्ट सांद्रता (15, 30, 45, और 60 एनएम) का उपयोग करके किया गया था. उत्पाद गठन के समय पाठ्यक्रम 2.2 थे जो y-अवरोधन, 11, 15, और प्रत्येक प्रोटीन एकाग्रता (चित्रा 2 बी) के सापेक्ष क्रमश: 26 एनएम, यह निर्धारित करने के लिए एक रेखीय समीकरण को फिट किया गया. y के अवरोध के आगे हर वास्तविक प्रोटीन एकाग्रता (चित्रा -2) के सापेक्ष प्लॉट किए जाते थे. सक्रिय एंजाइम के अंश चित्रा -2 में लाइन की ढलान से 38% होने के लिए निर्धारित किया गया था. स्थिर राज्य दर, चित्रा 2B में रेखीय फिट से निर्धारित वी एस एस निर्धारित करने के लिए y के अवरोध (चित्रा 2 डी) के सापेक्ष प्लॉट किए जाते थे. चित्रा 2 डी में लाइन की ढलान लगातार हदबंदी दर के बराबर है जो 0.0028 सेकंड -1, थाउत्पाद के लिए एपी साइट और छिन्न एपी साइट डीएनए glycosylase / lyase गतिविधियों द्वारा गठित.
एक पूर्व स्थिर राज्य समय पाठ्यक्रम 200 एनएम डीएनए सब्सट्रेट और OGG1 सक्रिय 40 एनएम का उपयोग करके किया गया. उत्पाद गठन के समय पाठ्यक्रम बढ़ती घातीय और रैखिक शर्तों के साथ एक समीकरण के लिए फिट किया जा सकता है. के रूप में चित्रा 4 में दिखाया गया है, कश्मीर ओ बीएस और कश्मीर बंद क्रमशः 0.75 सेकंड -1 और 0.0055 सेकंड -1, 2 होने के लिए निर्धारित किया गया है. फट चरण (33 एनएम) के लिए आयाम (40 एनएम) जोड़ा सक्रिय OGG1 की एकाग्रता से भविष्यवाणी की तुलना में थोड़ा कम था. इस एंजाइम अणुओं की उपलब्ध संख्या कम कर देता है कि डीएनए सब्सट्रेट OGG1 की अविशिष्ट बंधन के कारण हो सकता है.
एकल कारोबार शर्तों के तहत, 8 oxoG छांटना प्रतिक्रिया 6 सेकंड (चित्रा 5) 2 के भीतर समाप्त हो गया था. उत्पाद गठन के समय पाठ्यक्रम एक एकल घातीय को फिट किया जा सकता हैसेकंड -1 0.74 की ओ बीएस कश्मीर समीकरण और झुकेंगे. विशेष रूप से, उत्पाद गठन के लिए आयाम की उम्मीद 50 एनएम डीएनए सब्सट्रेट जोड़ी की तुलना में कम थी. इस भाग में NaOH उपचार (2A चित्रा) या प्रतिक्रिया मिश्रण में unannealed सब्सट्रेट oligonucleotides की मौजूदगी से डीएनए की पृष्ठभूमि दरार की वजह से हो सकता था.
चित्रा 1. ई. से मानव OGG1 का शोधन कोलाई. मानव OGG1 जीन pGEX-6P-1 में क्लोन और BL21 (DE3) कोशिकाओं में overexpressed था. लेन 1; uninduced कोशिकाओं, 2 लेन, IPTG प्रेरित कोशिकाओं, 3 लेन, घुलनशील प्रोटीन अंश, 4 लेन, घुलनशील प्रोटीन अंश, 5 लेन के साथ ऊष्मायन के बाद glutathione sepharose 4 बी, HRV 3 के साथ glutathione sepharose 4 बी के ऊष्मायन के बाद अंश के माध्यम से प्रवाहसी प्रोटीज, 6 लेन, मोनो क्यू स्तंभ से दूषित पदार्थों को हटाने के बाद अंश के माध्यम से प्रवाह. Coomassie ब्लू दाग जेल की एक तस्वीर दिखाई है.
चित्रा 2. स्थिर राज्य कैनेटीक्स और OGG1 2 शुद्ध सक्रिय साइट अनुमापन OGG1 (15 एनएम, ○, 30 एनएम, □, 45 एनएम, ◊, या 60 एनएम, ×). 200 एनएम डीएनए सब्सट्रेट (5'-CTGCAGCTGATGCGCC एक्स TACGGATCCCCGGGTAC साथ incubated था -3 ', एक्स संकेत के रूप में 8 oxoG 1-30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस से कम) सी के साथ रखा है, जहां. ये एंजाइम सांद्रता एक बीएसए मानक वक्र से quantitated एक ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख के आधार पर स्पष्ट प्रोटीन सांद्रता का प्रतिनिधित्व करते हैं. ए, अलग substrates (एस) और उत्पादों (पी) दिखा polyacrylamide जैल denaturing. OGG1 (30 एनएम) और 200 एनएम डी एनए सब्सट्रेट प्रतिक्रिया के लिए इस्तेमाल किया गया था. बी, उत्पाद गठन के समय पाठ्यक्रम. डेटा फट चरण (Y-अवरोधन) और उत्पाद जारी (ढलान) की एक स्पष्ट दर के आयाम को निर्धारित करने के लिए एक रेखीय समीकरण को फिट किया गया. सी, पैनल बी में रेखीय फिट से निर्धारित अवरोध का प्लॉट निर्धारित किया है कि के सापेक्ष ब्रैडफोर्ड परख द्वारा. लाइन की ढलान सक्रिय एंजाइम के अंश से मेल खाती है. त्रुटि बार रेखीय फिट से पैनल बी. डी, सक्रिय एंजाइम एकाग्रता के सापेक्ष पैनल बी में रेखीय फिट से निर्धारित ढलानों के प्लॉट में उत्पाद गठन के लिए inferred आयाम में त्रुटि को इंगित करती है. त्रुटि बार रेखीय फिट से पैनल बी में उत्पाद गठन के लिए बाधित की ढलान में त्रुटि को इंगित करती है. लाइन की ढलान स्थिर राज्य दर (कश्मीर बंद), 0.0028 सेकंड -1 से मेल खाती है.
चित्रा 3. रैपिड बुझाना फ्लो साधन का अवलोकन.
4 चित्रा. OGG1 2 से 8 oxoG छांटना के पूर्व स्थिर राज्य कैनेटीक्स. OGG1 (40 एनएम सक्रिय एंजाइम) 200 एनएम डीएनए सब्सट्रेट के साथ incubated था (5'-CATGGGCGGCATGAACC एक्स GAGGCCCATCCTCACC -3 'एक्स 8 oxoG सी के साथ बनती है) 37 में 0-100 सेकंड के लिए डिग्री सेल्सियस. बिंदीदार रेखा स्थिर राज्य चरण की एक एक्सट्रपलेशन इंगित करता है. डेटा 0.75 के बराबर 33 के बराबर एक आयाम ± 0.89 एनएम, कश्मीर ओ बीएस साथ फट समीकरण के लिए फिट थे ± 0.083सेकंड -1, वी एस एस .0055 के लिए रवाना बराबर 0.18 ± 0.018 एनएम सेकंड -1 और कश्मीर के बराबर ± 0.020 सेकंड -1.
चित्रा 5. OGG1 2 से 8 oxoG छांटना के एकल कारोबार कैनेटीक्स. OGG1 (250 एनएम सक्रिय एंजाइम) 37 में 50 एनएम डीएनए सब्सट्रेट (5'-CTGCAGCTGATGCGCC एक्स TACGGATCCCCGGGTAC -3 'एक्स 8 oxoG सी के साथ बनती है) के साथ incubated था ° 0-60 सेकंड के लिए सी. डेटा 0.74 के बराबर कश्मीर ओ बीएस साथ एक घातीय समीकरण ± 0.015 सेकंड -1 के लिए फिट थे. बिंदीदार रेखा extrapolated आयाम (अनंत समय पर यानी उत्पाद) इंगित करता है.
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Discussion
गतिज दृष्टिकोण प्राथमिक गतिज स्थिरांक को परिभाषित करने के तरीकों की रूपरेखा यहाँ वर्णित है. उत्पाद गठन के एक समय के पाठ्यक्रम पहले enzymatic कारोबार तेजी से होने वाली साथ biphasic है, तो रसायन शास्त्र के बाद एक कदम के बाद उत्प्रेरक टर्नओवर दौरान दर सीमित है. OGG1 के मामले में प्रथम कारोबार या तो (एस <E) या (S> ई उच्च) डीएनए सांद्रता को सीमित करने के साथ उच्च एंजाइम सांद्रता का उपयोग करके मापा जा सकता है. पहले मामले में, प्रतिक्रिया एक 'एकल कारोबार' तक ही सीमित है और एंजाइम सक्रिय स्थल पर उत्प्रेरक दर का एक उपाय प्रदान करता है. उत्तरार्द्ध मामले में, कई एंजाइमी टर्नओवर मूल्यांकन कर रहे हैं. बाद में टर्नओवर उत्प्रेरक साइक्लिंग की सीमा उस कदम का एक उपाय प्रदान करते हैं, जबकि पहले कारोबार के दौरान होने वाली उत्पाद के गठन के फट, एंजाइम सक्रिय स्थल पर रासायनिक घटना के एक उपाय प्रदान करता है. इसके अलावा, उत्पाद गठन के फट के आयाम को सक्रिय रूप से लगे हुए एंजाइम का एक उपाय प्रदान करता है. यह स्थिर राज्य वेग (कश्मीर बंद = वी एस एस / ई) से लगातार उत्पाद हदबंदी दर की गणना के क्रम में पता होना चाहिए. OGG1 के लिए, उत्पाद डीएनए (यानी उत्पाद डीएनए हदबंदी दर लगातार) की रिहाई उत्प्रेरक साइकिल और इसके स्थिर राज्य दर 7,8 सीमा. के रूप में चित्रा 4 में दिखाया गया है, OGG1 के लिए डीएनए उत्पाद हदबंदी दर लगातार (कश्मीर = 0.0055 सेकंड -1 बंद) मनाया उत्प्रेरक दर (कश्मीर ओ बीएस = 0.75 सेकंड -1) से परिमाण कम के दो आदेश है. यह आबकारी क्षतिग्रस्त डीएनए अड्डों कसकर ताकि उत्पाद जारी स्थिर राज्य माप 1,8-10 दौरान सीमित दर है कि (एक abasic साइट के साथ डीएनए) अपने उत्पादों को बाध्य करने के लिए कि डीएनए glycosylases के एक आम गतिज सुविधा है. महत्वपूर्ण बात है, स्थिर राज्य गतिविधि माप जिससे उत्पाद डीएनए बंधन आत्मीयता निर्धारित करने के लिए एक सरल और सीधा रास्ता प्रदान करते हैं, कम गतिविधि तंग उत्पाद ख चलता हैinding.
चित्रा 2 और प्रतिनिधि परिणाम में वर्णित है, एंजाइम सक्रिय अंश 38% होना निर्धारित है. सक्रिय अंश तैयार एंजाइम> 95% सजातीय (चित्रा 1) है, भले ही प्रोटीन एकाग्रता से निर्धारित की तुलना में कम है. इस सब्सट्रेट और / या सही (जैसे ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख आम तौर पर एक नहीं हो सकता है कि एक मानक के रूप में एल्बुमिन गोजातीय सीरम का उपयोग करता है सच प्रोटीन एकाग्रता का आकलन नहीं हो सकता है कि प्रोटीन दृढ़ संकल्प की विधि के लिए एंजाइम की गैर विशिष्ट बंधन की वजह से हो सकता है अच्छा) ब्याज की एंजाइम के लिए नकल. वैकल्पिक रूप से, प्रोटीन एकाग्रता अन्य तरीकों से निर्धारित या ऐसे गिल और वॉन Hippel 11 से विकसित की है कि के रूप में 280 एनएम पर एक गणना दाढ़ विलुप्त होने के गुणांक से अनुमान लगाया जा सकता है.
आंकड़े में दिखाया गया है 4 और 5, कश्मीर की भयावहता ओ बीएस आने निर्धारितमीटर पूर्व स्थिर राज्य समय बेशक एक एकल कारोबार के प्रयोग से निर्धारित किया है कि के अनुरूप होना चाहिए. कश्मीर बंद का मूल्य भी वैकल्पिक गतिज तरीकों के बीच प्रयोगात्मक अनुरूप होना चाहिए. बहरहाल, इन दर स्थिरांक अलग कर रहे हैं (जैसे कश्मीर बंद स्थिर राज्य और पूर्व स्थिर राज्य की स्थिति के बीच अलग है), विभिन्न चरणों प्रत्येक विधि द्वारा मापा जा सकता है और एक नए मॉडल पर विचार किया जाना चाहिए. वैकल्पिक रूप से, उत्पाद निषेध या सब्सट्रेट कमी रेखीय भाग contaminates है कि एक पूर्व स्थिर राज्य समय के पाठ्यक्रम में स्पष्ट स्थिर राज्य दर को प्रभावित कर सकते हैं.
फट और स्थिर राज्य चरणों में अच्छी तरह से (यानी कश्मीर ओ बीएस ~ कश्मीर बंद) अलग नहीं हैं जहां स्थिति में, फट के आयाम और मनाया दर स्थिरांक कई कदम 12 के लिए प्राथमिक दर स्थिरांक की कंपोजिट हैं. इसके अलावा, अगर उत्पाद जारी (तेजी हैयानी कश्मीर बंद> कश्मीर ओ बीएस), उत्पाद गठन के समय पाठ्यक्रम biphasic नहीं है (पहले कारोबार और बाद के टर्नओवर में एक ही कदम से सीमित कर रहे हैं, रसायन शास्त्र). इस मामले में, एक एकल कारोबार प्रयोग कटैलिसीस का एक उपाय प्रदान कर सकते हैं.
एक एकल कारोबार दृष्टिकोण एक आंतरिक उत्प्रेरक दर निर्धारित करने के लिए किया जाता है, तो पर्याप्त एंजाइम आंशिक दर सीमित नहीं है कि बाध्यकारी आश्वस्त करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. इसी तरह, बाध्यकारी सब्सट्रेट भी तेजी से तो फट दर सब्सट्रेट बंधन से सीमित नहीं है कि होना चाहिए. एंजाइम है कि बाध्यकारी एक एकल कारोबार के प्रयोग के दौरान सीमित दर नहीं है सत्यापित करने के लिए समय बेशक घातीय समय पाठ्यक्रम बदल नहीं है कि पुष्टि करने के लिए एक अलग एंजाइम एकाग्रता के साथ दोहराया है. फट या एकल कारोबार समय पाठ्यक्रम के आयाम क्रमश एंजाइम या सब्सट्रेट सांद्रता, सीधे आनुपातिक है क्योंकि इसके अलावा, इन सांद्रता का चुना जाना चाहिएवे मज़बूती से मापा जा सकता है ओ. अंत में, यह फट और स्थिर राज्य दरों में अच्छी तरह से अलग नहीं कर रहे हैं, फट आयाम सच सक्रिय एंजाइम एकाग्रता 12 underestimates कि ध्यान दिया जाना चाहिए.
कैनेटीक्स दृष्टिकोण डीएनए glycosylases का उत्प्रेरक साइकिल चालन के दौरान महत्वपूर्ण कदम अलग करने के लिए एक विश्वसनीय तरीका प्रदान ऊपर वर्णित है. इन संदर्भ गतिज स्थिरांक के साथ, बदल डीएनए अनुक्रम / संरचना 1,13-18 के प्रभाव, सक्रिय स्थल अवशेष 19,20, धातु आयन 21, या कटैलिसीस या एंजाइम साइकिल पर सेलुलर गौण प्रोटीन अब 22-24 का मूल्यांकन किया जा सकता है.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम उपयोगी सुझाव और विचार विमर्श के लिए पांडुलिपि और डा. राजेंद्र प्रसाद की महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए डॉ. जूली लालकृष्ण होर्टन धन्यवाद. इस शोध के अंश मूल रूप से जैव रसायन विज्ञान, Sassa एक एट के जर्नल में प्रकाशित किए गए थे. अल., "मानव 8 Oxoguanine डीएनए Glycosylase की Glycosylase गतिविधि पर डीएनए अनुक्रम प्रसंग प्रभाव." जम्मू बॉय केम. 287, 36702-36710 (2012) 2. इस काम के अंदर का रिसर्च प्रोग्राम में स्वास्थ्य अनुसंधान परियोजना अनुदान Z01-ES050158 के राष्ट्रीय संस्थान, NIEHS द्वारा, पूरे या हिस्से में, का समर्थन किया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| 5’-6-FAM labeled oligonucleotides containing a single 8-oxoG | Eurofins MWG Operon | 5’-P32 radiolabeled oligonucleotides can be used as well. Polyacrylamide gel purification grade is recommended. | |
| Unlabeled oligonucleotides (complementary strand) | Eurofins MWG Operon | Polyacrylamide gel purification grade is recommended. | |
| 1 ml BD Luer Lock disposable syringe | BD Medical | 309628 | Lue Lock disposable syringe from other vendors can be used as well. |
| 10 ml BD Luer Lock disposable syringe | BE Medical | 309604 | Luer Lock disposable syringe from other vendors can be used as well. |
| Equipment | |||
| Circulating water bath | Any vender | ||
| RQF-3 Rapid Quench-Flow Instrument | KinTek Corporation | Rapid Quench-Flow Instrument from other vendors can be used as well. | |
| Typhoon Phosphorimager 8600 | GE Healthcare Life Sciences | Imager from other vendors can be used as well. | |
| KaleidaGraph | Synergy Software | ||
References
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