Facial Transplantation i<em> Xenopus laevis</em> Embryoner
Summary
En teknik til omplantning "Extreme Anterior Domain" facial væv mellem Xenopus laevis embryoner er blevet udviklet. Væv kan flyttes fra en genekspression baggrund til en anden, hvilket tillader undersøgelse af lokale krav til kraniofaciale udvikling og til signalering interaktioner mellem ansigtet regioner.
Abstract
Kraniofaciale misdannelser forekommer i 1 ud af hver 700 levendefødte, men Ætiologien sjældent kendt på grund af begrænset forståelse af kraniofaciale udvikling. At identificere, hvor signalveje og væv handle under mønstret af ansigtet udvikle, har en 'ansigt transplantation' teknik er udviklet i embryoner fra frøen Xenopus laevis. En region af formodede ansigtsservietter (den "Extreme Anterior Domain" (EAD)) fjernes fra en donor embryo på tailbud scenen, og transplanteres til en værtsembryo af samme fase, hvorfra den tilsvarende region er blevet fjernet. Dette kan bruges til at generere et kimært ansigt, hvor værten eller donorvæv har et tab eller gevinst af funktion i et gen, og / eller omfatter en slægt etiket. Efter healing, er resultatet af udviklingen overvåges, og angiver roller signalvejen inden donor eller de omkringliggende værtsvævene. Xenopus er en værdifuld model for ansigt udvikling, da ansigtet regionen er stor og let enccessible for mikromanipuleringer. Mange embryoner kan analyseres i løbet af en kort tidsperiode, da udvikling sker hurtigt. Fund i frøen er relevante for menneskelig udvikling, da kraniofaciale processer vises konserveret mellem Xenopus og pattedyr.
Introduction
For at forstå mekanismerne bag kraniofaciale misdannelser 1-2, vigtige væv og deres signalering bidrag i løbet af kraniofaciale udvikling skal identificeres. I frøen Xenopus laevis del af ansigtet, herunder munden og næsebor form fra "Extreme Anterior Domain" (EAD), hvor ektoderm og endoderm direkte sammenstillet 3-4. EAD fungerer også som en signalering center til at påvirke omgivende væv, herunder kranie neurale våbenskjold, som danner kæberne og andre ansigtstræk regioner 5. Til at identificere gener, der bidrager til EAD funktion, en 'ansigt transplantation' teknik udviklet, hvor væv transplanteres fra en donor til en værtsembryo efter fjernelse af den tilsvarende vært regionen. Efter transplantationen, medfører ansigtet udvikling vurderes. Således er virkningerne af tab af funktion (LOF) eller øget funktion (GOF) for et specifikt gen i EAD analyseret lokalt, hvor resten af head og krop består af vildtype væv. Den gensidige transplantation kan udføres, hvor vildtype væv er transplanteret ind i embryoner med global LOF eller GOF i specifikke gener. Transplantation er ofte blevet brugt i Xenopus og chick studies 6. For eksempel har Xenopus transplantation behandlet homogenetic neural induktion, linse og neurale kompetence, og neuralkam migration 7-10. Quail-chick kimære podning har analyseret udviklingen af den forreste neurale plade, anterior neural højderyg, neurale våbenskjold, og kranieknogler 11-14. Dette er den første transplantation teknik til undersøgelse af kraniofaciale udvikling i Xenopus. Denne teknik har vist en hidtil ukendt rolle for Wnt inhibitorer Frzb1 og Crescent i reguleringen basalmembran dannelse i den formodede munden 5. Xenopus laevis er en ideel model for undersøgelse af kraniofaciale udvikling embryoer er store, udvikle eksternt, etnd ansigtet er umiddelbart synlige, så mikromanipulering og billeddannelse af udvikling. Mekanismerne bag facial udvikling ser bevaret, hvilket indikerer, at konstateringer i frøen give indsigt i den menneskelige udvikling 4,15-16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiske stadier og Begrænsninger: EAD ansigt transplantation procedure er tid og arbejde intensivt. Det kræver praksis, konstant hænder, og fingerfærdighed at perfektionere. Ansigtet transplantation protokol bygger på forskerens evne til at fjerne effektivt og transplantation af væv. Hvis man tager for lang tid at indsætte transplantation i værtens ansigt, vil værten ansigt begynde at kontrakten og helbrede. Tang kan bruges til forsigtigt udvide ansigtet regionen. Men hvis betydelige sår sammentræknin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Radek Sindelka for hans hjælp, og Cas Bresilla for at bistå med frø dyrehold og forberedelse foster. Dette arbejde blev finansieret af NIH via tilskud R01DE021109 til HLS Laura Jacox blev finansieret af Herschel Smith Graduate Fellowship på Harvard University og en F30 individuel stipendium F30DE022989-01 gennem NIDCR.
Materials
| Pasteur pipette | VWR | 14672-400 | Lime Glass |
| Size 5 3/4’’ | Cotton Plugged | ||
| Disposable | |||
| Graduated Transfer Pipette | VWR | 16001-180 | Disposable |
| Polyethylene | |||
| #5/45 forceps | Fine Science Tools by Dupont medical | 11251-35 | Angled 45 degrees |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-20 | Straight; serrated tip |
| Stainless Steel; | |||
| 20cm long | |||
| Capillary Tubing (for needles) | FHC | 30-30-1 | Borosil 1.0mm OD x 0.5mm ID/Fiber |
| 100mm each | |||
| Cover slip | VWR | 48393 252 | 24x60mm |
| micro cover glass | or | or | |
| (for glass bridges) | 48393 230 | 24x40mm | |
| No.1.5 | |||
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 | |
| Needle Puller | Sutter Instrument Co | Needle Puller: discontinued Filament: FB300B | The most similar, currently available needle puller is the P-97. For filaments, use Sutter 3.00mm square box filaments, 3.0mm wide. |
| Model P-80 | Flaming / Brown micropipette puller | ||
| (discontinued) | |||
| Stereomicroscope | Zeiss | ||
| Zeiss Stemi 1000 | |||
| Stereomicroscope Lighting by Fostec | Fostec | Use a light box with 2 fiberoptic arms. | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26018-17 | Jaw Opening Diameter: 0 to 1mm |
| Length: 17cm | |||
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Jaw opening Diameter: 0 to 1mm |
| Length: 12cm | |||
| Tungsten Needles | Fine Science Tools | 10130-05 | 0.125mm Rod diameter |
| Van Aken Plastalina | Blick | #33268-2981 | |
| Modeling Clay- white, red or yellow | |||
| mMessage mMashine SP6 or T7 Kit | Ambion | AM1340 |
References
- Gorlin, R. J., Cohen, M., Levin, L. . Syndromes of the head and neck. , (1990).
- Trainor, P. Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potential for prevention. Am. J. Med. Gen. A. 152, 2984-2994 (2010).
- Dickinson, A. J., Sive, H. L. Development of the primary mouth in Xenopus laevis. Dev. Bio. 295, 700-713 (2006).
- Dickinson, A. J., Sive, H. L. Positioning the extreme anterior in Xenopus: cement gland, primary mouth and anterior pituitary. Sem. Cell Dev. Bio. 18, 525-533 (2007).
- Dickinson, A. J., Sive, H. L. The Wnt antagonists Frzb-1 and Crescent locally regulate basement membrane dissolution in the developing primary mouth. Dev. 136, 1071-1081 (2009).
- Gilbert, S. F. . Developmental Biology. , (2010).
- Borchers, A., Epperlein, H. H., Wedlich, D. An assay system to study migratory behavior of cranial neural crest cells in Xenopus. Dev. Genes Evol. 210, 217-222 (2000).
- Grunz, H. Homoiogenetic neural inducing activity of the presumptive neural plate of Xenopus laevis. Dev. Growth Differ. 32, 583-589 (1990).
- Servetnick, M., Grainger, R. M. Changes in neural and lens competence in Xenopus ectoderm: evidence for an autonomous developmental timer. Dev. Bio. 112, 177-188 (1991).
- Servetnick, M., Grainger, R. M. Homeogenetic neural induction in Xenopus. Dev. Bio. 147, 73-82 (1991).
- Couly, G., Coltey, P., Le Douarin, N. The triple origin of skull in higher vertebrates: a study in quail-chick chimeras. Dev. 117, 409-429 (1993).
- Couly, G. F., Le Douarin, N. M. Mapping of the early neural primordium in quail-chick chimeras : I. Developmental relationships between placodes, facial ectoderm. 110, 422-439 (1985).
- Couly, G. F., Le Douarin, N. M. Mapping of the early neural primordium in quail-chick chimeras II. The prosencephalic neural plate and neural folds: Implications for the genesis of cephalic human congenital abnormalities. Dev. Bio. 120, 198-214 (1987).
- Lievre, A. L., Le Douarin, N. The early development of cranial sensory ganglia and the potentialities of their component cells studied in quail-chick chimeras. Dev. Bio. 94, 291-310 (1982).
- Kennedy, A., Dickinson, A. Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes. Dev. Bio. 365, 229-240 (2012).
- Trainor, P., Tam, P. Cranial paraxial mesoderm and neural crest of the mouse embryo- codistribution in the craniofacial mesenchyme but distinct segregation in the branchial arches. Dev. 121, 2569-2582 (1995).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus laevis. , (2000).
- Tandon, P., Showell, C., Christine, K., Conlon, F. Morpholino injection in Xenopus. Methods Mol. Biol. 843, 29-46 (2012).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1994).
