Transplantations faciales<em> Xenopus laevis</em> Embryons
Summary
Une technique de transplantation de "Extreme antérieur domaine" mouchoirs entre les embryons de Xenopus laevis a été développé. Tissu peut être déplacé d'un gène expression fond dans un autre, ce qui permet l'étude des besoins locaux pour le développement cranio-facial et d'interactions entre les régions du visage de signalisation.
Abstract
Malformations congénitales cranio-faciales se produisent dans 1 sur chaque 700 naissances vivantes, mais l'étiologie est rarement connus en raison de la compréhension limitée de développement cranio-facial. Pour déterminer où les voies de signalisation et les tissus agissent pendant la structuration de la face en développement, une technique «visage de transplantation» a été développé dans les embryons de la grenouille Xenopus laevis. Une région de tissu facial présomptif (le «extrême antérieure de domaine" (EAD)) est retiré d'un embryon donneur à l'étape du bourgeon caudal, et transplanté dans un embryon hôte de la même scène, à partir de laquelle la région équivalente a été éliminée. Ceci peut être utilisé pour générer une face chimérique où le tissu de l'hôte ou d'un donneur a subi une perte ou gain de fonction dans un gène, et / ou comprend une étiquette de lignage. Après la guérison, le résultat du développement est surveillé, et indique les rôles de la voie de signalisation dans le donateur ou tissus de l'hôte environnantes. Xenopus est un modèle précieux pour le développement de visage, comme la région du visage est large et facilement unccessible pour la micromanipulation. De nombreux embryons peuvent être analysés, sur une courte période de temps puisque le développement se fait rapidement. Les conclusions de la grenouille sont pertinents pour le développement humain, car les processus cranio-faciales semblent conservés entre Xenopus et les mammifères.
Introduction
Pour comprendre les mécanismes sous-jacents des défauts cranio-faciales congénitales 1-2, tissus importants et leurs contributions de signalisation au cours du développement cranio-facial doit être identifié. Dans la grenouille Xenopus laevis, une partie du visage, y compris la bouche et les narines forme de la "Extreme antérieure de domaine" (EAD), où l'ectoderme et l'endoderme sont directement juxtaposés 3-4. L'EAD agit également comme un centre de signalisation pour influencer les tissus environnants, y compris la crête neurale crânienne, qui forme des mâchoires et d'autres régions du visage 5. Pour identifier les gènes qui contribuent à la fonction de l'EAD, une technique «visage de transplantation» a été développé, où le tissu est transplanté d'un donneur dans un embryon hôte, après le retrait de la région d'hôte correspondant. Après la greffe, ce qui entraîne le développement du visage est évaluée. Ainsi, les effets de la perte de fonction (LOF) ou gain de fonction (GOF) pour un gène spécifique dans la EAD sont analysées localement, où le reste de l'hLire et corps est composé de tissus de type sauvage. La transplantation réciproque peut être effectuée, où le type sauvage tissu est transplanté dans des embryons avec LOF mondiale ou GOF dans les gènes spécifiques. Transplantation a été fréquemment utilisé dans Xenopus et étudie poussin 6. Par exemple, la transplantation de Xenopus a traité homogenetic induction neurale, la lentille et de la compétence de neurones, et la migration de la crête neurale 7-10. Caille-poulet greffe chimère a analysé le développement de la plaque neurale antérieure, crête neurale antérieure, la crête neurale, et les os crâniens 11-14. C'est la première technique de greffe pour l'étude du développement cranio-facial chez Xenopus. Cette technique a démontré un nouveau rôle pour les inhibiteurs de Wnt Frzb1 et du Croissant dans la régulation de la formation de la membrane basale dans la bouche présomptif 5. Xenopus laevis est un modèle idéal pour l'étude du développement cranio-facial que les embryons sont grandes, développer l'extérieur, une le visage est bien visible, ce qui permet la micromanipulation et de l'imagerie de développement. Mécanismes sous-jacents du développement du visage semblent conservés, ce qui indique que les constatations faites dans la grenouille permettent de mieux comprendre le développement humain 4,15-16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Étapes critiques et les limites: La procédure de greffe du visage EAD est temps et un travail intensif. Il exige de la pratique, les mains stables, et la dextérité pour se perfectionner. Le protocole de greffe de la face repose sur la capacité des chercheurs à éliminer efficacement et le tissu de greffe. Si l'on prend trop de temps pour insérer la greffe dans le visage de l'hôte, le visage de l'hôte va commencer à se contracter et à guérir. Pinces peuvent être utilisés pour étendre dé…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Radek Šindelka pour son aide, et Cas Bresilla pour aider avec la grenouille élevage et la préparation de l'embryon. Ce travail a été financé par le NIH via le R01DE021109 de subvention à HLS Laura Jacox a été financé par le Herschel Smith bourse d'études supérieures à l'Université de Harvard et une subvention F30 bourse individuelle F30DE022989-01 à la NIDCR.
Materials
| Pasteur pipette | VWR | 14672-400 | Lime Glass |
| Size 5 3/4’’ | Cotton Plugged | ||
| Disposable | |||
| Graduated Transfer Pipette | VWR | 16001-180 | Disposable |
| Polyethylene | |||
| #5/45 forceps | Fine Science Tools by Dupont medical | 11251-35 | Angled 45 degrees |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-20 | Straight; serrated tip |
| Stainless Steel; | |||
| 20cm long | |||
| Capillary Tubing (for needles) | FHC | 30-30-1 | Borosil 1.0mm OD x 0.5mm ID/Fiber |
| 100mm each | |||
| Cover slip | VWR | 48393 252 | 24x60mm |
| micro cover glass | or | or | |
| (for glass bridges) | 48393 230 | 24x40mm | |
| No.1.5 | |||
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 | |
| Needle Puller | Sutter Instrument Co | Needle Puller: discontinued Filament: FB300B | The most similar, currently available needle puller is the P-97. For filaments, use Sutter 3.00mm square box filaments, 3.0mm wide. |
| Model P-80 | Flaming / Brown micropipette puller | ||
| (discontinued) | |||
| Stereomicroscope | Zeiss | ||
| Zeiss Stemi 1000 | |||
| Stereomicroscope Lighting by Fostec | Fostec | Use a light box with 2 fiberoptic arms. | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26018-17 | Jaw Opening Diameter: 0 to 1mm |
| Length: 17cm | |||
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Jaw opening Diameter: 0 to 1mm |
| Length: 12cm | |||
| Tungsten Needles | Fine Science Tools | 10130-05 | 0.125mm Rod diameter |
| Van Aken Plastalina | Blick | #33268-2981 | |
| Modeling Clay- white, red or yellow | |||
| mMessage mMashine SP6 or T7 Kit | Ambion | AM1340 |
References
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