Transplantations faciales<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryons

Résumé

Une technique de transplantation de "Extreme antérieur domaine" mouchoirs entre les embryons de Xenopus laevis a été développé. Tissu peut être déplacé d'un gène expression fond dans un autre, ce qui permet l'étude des besoins locaux pour le développement cranio-facial et d'interactions entre les régions du visage de signalisation.

Résumé

Malformations congénitales cranio-faciales se produisent dans 1 sur chaque 700 naissances vivantes, mais l'étiologie est rarement connus en raison de la compréhension limitée de développement cranio-facial. Pour déterminer où les voies de signalisation et les tissus agissent pendant la structuration de la face en développement, une technique «visage de transplantation» a été développé dans les embryons de la grenouille Xenopus laevis. Une région de tissu facial présomptif (le «extrême antérieure de domaine" (EAD)) est retiré d'un embryon donneur à l'étape du bourgeon caudal, et transplanté dans un embryon hôte de la même scène, à partir de laquelle la région équivalente a été éliminée. Ceci peut être utilisé pour générer une face chimérique où le tissu de l'hôte ou d'un donneur a subi une perte ou gain de fonction dans un gène, et / ou comprend une étiquette de lignage. Après la guérison, le résultat du développement est surveillé, et indique les rôles de la voie de signalisation dans le donateur ou tissus de l'hôte environnantes. Xenopus est un modèle précieux pour le développement de visage, comme la région du visage est large et facilement unccessible pour la micromanipulation. De nombreux embryons peuvent être analysés, sur une courte période de temps puisque le développement se fait rapidement. Les conclusions de la grenouille sont pertinents pour le développement humain, car les processus cranio-faciales semblent conservés entre Xenopus et les mammifères.

Introduction

Pour comprendre les mécanismes sous-jacents des défauts cranio-faciales congénitales ^1-2, tissus importants et leurs contributions de signalisation au cours du développement cranio-facial doit être identifié. Dans la grenouille Xenopus laevis, une partie du visage, y compris la bouche et les narines forme de la "Extreme antérieure de domaine" (EAD), où l'ectoderme et l'endoderme sont directement juxtaposés ^3-4. L'EAD agit également comme un centre de signalisation pour influencer les tissus environnants, y compris la crête neurale crânienne, qui forme des mâchoires et d'autres régions du visage ^5. Pour identif....

Protocole

Une. Réactifs Préparation

1. 10x MBS: Préparer 1 L de 10x modification Saline de Barth (MBS) de la solution ^17. Reportez-vous au tableau 1, les réactifs, les ingrédients et les instructions. Utilisez de l'eau distillée pour toutes les solutions. Mélanger dans un bol, à l'aide d'une barre d'agitation, jusqu'à complète dissolution. Toutes les solutions doivent être effectuées à température ambiante.
2. 1x MBS: Diluer 100 ml de solution 10x MBS dans 900 ml d'eau distillée pour obtenir 1 L de 1x MBS. Ajouter 0,7 ml de solution M CaCl ₂ 1.
3. 0,1 x MBS: Diluer 1x MBS pour préparer 1 L de ....

Résultats

Tissu transplanté doit être complètement insérée dans la tête de l'hôte après transplantation, comme indiqué sur la figure 3A, et avoir un pont de verre placée de façon appropriée sur le visage de l'embryon, comme le montre la Figure 2bc. Le tissu du donneur transplanté doit être correctement dimensionné pour l'ouverture de l'hôte, pour la transplantation, pour réussir. Le tissu EAD ne doit pas dépasser de la tête, en aucune façon, comme on le voit sur ​​les figu.......

Discussion

Étapes critiques et les limites: La procédure de greffe du visage EAD est temps et un travail intensif. Il exige de la pratique, les mains stables, et la dextérité pour se perfectionner. Le protocole de greffe de la face repose sur la capacité des chercheurs à éliminer efficacement et le tissu de greffe. Si l'on prend trop de temps pour insérer la greffe dans le visage de l'hôte, le visage de l'hôte va commencer à se contracter et à guérir. Pinces peuvent être utilisés pour étendre délicatement la rég.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Pipette Pasteur	VWR	14672-400	Verre à chaux  ;
Taille 5 3/4 po Pipette	graduée bouchée
	VWR	16001-180	jetable.
#5/45 Pince	Fine Science Tools de Dupont medical	11251-35	Angled 45° ;
Pince à motif standard	Outils de science fine	11000-20	Droit ; pointe dentelée ; tube capillaire en acier inoxydable
(pour aiguilles)	FHC	30-30-1	Borosil 1,0 mm OD x 0,5 mm ID/Fiber
Cover slip  ;	VWR	48393 252	24 x 60 mm  ; micro verre de protection ;
Ficoll 400	Sigma-Aldrich	F9378
Extracteur d’aiguille  ;	Sutter Instrument Co	: abandonné Filament : FB300B	L’extracteur d’aiguille le plus similaire, actuellement disponible, est le P-97. Pour les filaments, utilisez des filaments carrés Sutter de 3,00 mm de large.
Modèle P-80			de micropipettes flamboyant / brun
Stéréomicroscope	Zeiss
Éclairage par Fostec	Fostec		Utilisez une boîte à lumière avec 2 bras à fibre optique.  ;   ;
Porte-goupille nickelé	Outils de sciences fines	26018-17	Diamètre de l’ouverture de la mâchoire : 0-1 mm Porte-goupille
nickelé Moria	Outils de sciences fines	26016-12	Diamètre de l’ouverture de la mâchoire : 0-1 mm
Aiguilles en tungstène	Outils de sciences fines	10130-05	Diamètre de la tige de 0,125 mm
Van Aken Plastalina	Blick	#33268-2981
Pâte à modeler - blanche, rouge ou jaune
mMashine SP6 ou T7 Kit	Ambion	AM1340

de transfert en cotonExtracteur d’aiguille Extracteur