Summary
نقدم بحكم فيفو خلية مقايسة الهجرة التي تسمح الكمي الدقيق للالمعوي العصبية المحتملة الهجرة الخلية قمة في وجود عوامل النمو المختلفة.
Abstract
الخلايا العصبية قمة (NCC) هي خلية السكان عابرة ومتعددة القدرات التي تنبع من الأنبوب العصبي الظهري ويهاجر على نطاق واسع في جميع أنحاء الفقاريات النامية الجنين. بالإضافة إلى توفير الدبقية والخلايا العصبية الطرفية، NCC توليد الخلايا الصباغية وكذلك معظم هيكل عظمي القحف الوجهي. يتم التحكم NCC الهجرة والتمايز من خلال مزيج من الأصل المحوري على طول الأنبوب العصبي وتعرضهم للالعظة خارج الخلية متميزة إقليميا. هذه المساهمة من خارج الخلية بروابط هو واضح خصوصا خلال تشكيل النظام العصبي المعوي (ENS)، وهي شبكة معقدة مترابطة من العقد العصبية التي تتحكم محليا (بين أمور أخرى) حركة العضلات والأمعاء على الحركة المعوية. ويستمد معظم ENS من مجموعة صغيرة من الأولي NCC أن القيام برحلة طويلة من أجل استعمار - في منقاري إلى الذيلية الأزياء - على طول القناة الهضمية المحتملين. من بين عدة مسارات الإشارات المعروفة لالتأثير المعوي NCC الاستعمار، ومن المسلم به GDNF / RET إشارات على أنها الأكثر أهمية. في الواقع، تسيطر إفراز spatiotemporally من RET يجند GDNF من اللحمة المتوسطة الأمعاء هو المسؤول الرئيسي لجذب وتوجيه، معربا عن RET المعوي NCC إلى وداخل القناة الهضمية الجنينية. هنا، نحن تصف فيفو السابقين فحص الهجرة الخلية، والاستفادة من خط الماوس المعدلة وراثيا امتلاك fluorescently المسمى NCC، والذي يسمح الكمي الدقيق للالمعوية المحتملة الهجرة NCC في وجود عوامل النمو المختلفة، بما في ذلك GDNF.
Introduction
الخلايا العصبية قمة (NCC) هي نوع من الخلايا عابرة فريدة لالفقاريات التي تشكل العديد من المشتقات أثناء تطور الجنين. تنشأ هذه الفئة من السكان الخلية على الحدود من لوحة العصبية، المتاخمة للالأديم الظاهر غير العصبية 1. أثناء تكون العصيبة، الانحناء من الأماكن لوحة العصبية NCC على طول الحافة الظهرية من تشكيل الأنبوب العصبي. NCC ثم الخضوع لالظهارية الانتقالية الوسيطة، وفصل المهاجرة بعيدا عن الأنبوب العصبي. NCC استعمار مختلف الهياكل الجنينية، بما في ذلك الجهاز الهضمي حيث أنها تشكل الجهاز العصبي المعوي بأكمله (ENS)، وهي شبكة مترابطة من العقد العصبية جزءا لا يتجزأ في جدار الأمعاء. كما استعرضت مؤخرا 2،3، وقد شاركت العديد من الجينات في تطوير هذه البنية المعقدة.
ويستمد معظم ENS من مجموعة صغيرة من NCC تنشأ من الأنبوب العصبي المبهم (أي حول الحدود المستقبلية الدماغ المؤخر / الحبل الشوكي) 4.هذه الأسلاف العصبية تصل إلى المعى الأمامي حول يوم الجنينية (ه) 9.0 في الفئران ثم تهاجر نحو caudally داخل اللحمة المتوسطة الأمعاء حتى e15.0 تقريبا لاستعمار الامعاء الجنينية كله. يتم توفير مجموعة فرعية صغيرة من الأسلاف العصبية القولون أيضا العجزية NCC، التي تغزو الأمعاء الخلفي في الاتجاه المعاكس حتى الأعور 4. كلا المبهم والعجزية NCC تتطلب متعددة الهجرة، الانتشار، والبقاء على قيد الحياة تعزيز التمايز العظة لضمان تشكيل كامل للENS. في هذا الصدد، النماذج الحيوانية - وخاصة الفئران المعدلة وراثيا - كان لها دور أساسي في تحديد عدة بروابط خارج الخلية الأساسية: GDNF (الدبقية المستمدة من الخلايا عامل التغذية العصبية)، Endothelin-3، Neurotrophin-3، أفضل الممارسات الإدارية (العظام البروتينات morphogenic)، Netrin ، وكذلك سونيك القنفذ الهندي و(شش وIHH) 5-10. من هذه، GDNF من خلال إشارات التيروزين كيناز عبر الغشاء مستقبلات RET (مؤجلة خلال ترنسفكأيشن) يتم التعرف على اله الطريق الأكثر أهمية لجذب وتوجيه NCC إلى وداخل القناة الهضمية الجنينية. ويفرز GDNF من اللحمة المتوسطة الأمعاء ويشكل التدرج rosrrocaudal تسيطر spatiotemporally هذا هو chemoattractive مباشرة إلى المعوية NCC والتي تعبر RET 11،12.
بين وظائف أخرى، وENS ينظم الحركة داخل الجهاز الهضمي من خلال تفاعله مع العضلات الملساء في جدار الأمعاء. غياب العقد العصبية في المنطقة الطرفية من نتائج الأمعاء في مرض هيرشسبرونغ: انكماش منشط للجزء المتأثر يؤدي إلى انسداد، وتراكم المنبع من المواد هضمها وانتفاخ هائلة من الأمعاء والبطن. يحدث المرض هيرشسبرونغ ما يقرب من واحد في 5،000 ولادة حية. ويعتقد أن نمط الهجرة rostro الذيلية المعوي NCC أن يكون عاملا مساهما الرئيسي لمسببات المرض هيرشسبرونغ. القولون، أبعد من مصدر المهاجرة NCC والجزء الأخير من بowel أن المستعمر، هو الأكثر عرضة للعيوب في تشكيل ENS. وفقا لدورها الحاسم في المعوي الهجرة NCC، تعطل GDNF / RET الإشارات هو سبب وراثي معروف الرئيسي للمرض هيرشسبرونغ 13.
لدراسة أفضل NCC والتنمية ENS، ولدت لدينا خط الماوس المعدلة وراثيا - اسمه Gata4p [5KB]-GFP 14 - التي وصفت المهاجرة NCC مع بروتين الفلورية الخضراء (GFP). نحن الكمال المقبل بحكم فيفو مقايسة الهجرة الخلية، مقتبسة من الأعمال المنشورة من قبل مجموعات أخرى 11،12،15، التي تسمح الآن الكمي الدقيق للالمعوية المحتملة الهجرة NCC في وجود عوامل النمو المختلفة، مثل GDNF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بيان الأخلاق
وأجريت التجارب على الفئران التالية المجلس الكندي للرعاية الحيوان المبادئ التوجيهية لرعاية والتلاعب من الحيوانات المستخدمة في البحوث الطبية. تمت الموافقة على البروتوكولات التي تنطوي على التلاعب في الحيوانات من قبل لجنة الأخلاق المؤسسي للجامعة كيبيك في مونتريال (لجنة حماية Institutionnel دي دي Animaux؛ الرقم المرجعي 0512-R3-650-0513).
1. إعداد الهلام الكولاجين
العمل بطريقة عقيمة، تحت غطاء زراعة الأنسجة.
- إعداد كاملة 5X DMEM (النسر تعديل الوسيلة الأساسية) بما في ذلك المضادات الحيوية القياسية. حل 3.37 غرام من مسحوق DMEM و0.925 غرام من NaHCO 3 في 20 مل من الماء. تعقيم عن طريق تمرير من خلال مرشح 0.22 ميكرون. إضافة 2.5 مل من العقيمة 100X البنسلين / الستربتوميسين و 25 مل من مصل بقري جنيني العقيمة للحرارة المعطل. تخزين عند 4 درجات مئوية.
- على الجليد، ومزيج 800 ميكرولترمن الكولاجين أنا الحل (3.77 ملغ / مل في 0.02 N حامض الخليك، فلتر تعقيم)، 600 ميكرولتر من DMEM كاملة 5X و 17 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم N 1. تمييع مع الماء المعقم إلى الحجم النهائي من 3 مل. وتشمل عوامل النمو ذات الصلة في هذا المزيج. نحن عادة استخدام GDNF في 10 نانوغرام / مل لتحفيز المعوي الهجرة NCC.
- الودائع حوالي 480 ميكرولتر في كل بئر من صف واحد في 24 لوحة جيدا. تجنب الفقاعات. الصفوف المتبقية يمكن استخدامها لاختبار تأثير عوامل النمو الأخرى على الهجرة الخلية.
- السماح للالكولاجين بلمرة لا يقل عن 1 ساعة في حاضنة معقمة عند 37 درجة مئوية.
2. تشريح الحيوانات 16
- إعداد التزاوج والتحقق من وجود المقابس المهبلية في صباح اليوم التالي. e0.5 اليوم يجري ظهر اليوم تم العثور على المكونات المهبل، وعزل الإناث والانتظار 12 يوما حتى E12.5.
- تخدير الفئران الحوامل مع isoflurane والموت ببطء وعن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون 2.
- رش الفأر مع الايثانول 70٪. رفع و البطنالقربى وفتح تجويف البطن مع مقص تشريح.
- إزالة الرحم في طبق بتري زجاجية مملوءة الجليد الباردة PBS (الفوسفات مخزنة المالحة). قطع الرحم بشكل مستعرض بين تورمات deciduum الفردية لعزل كل موقع غرس الجنين.
- العمل على كل موقع على حدة زرع في طبق بتري الزجاج أخرى مليئة PBS الجليد الباردة. تحت المجهر تشريح، واستخدام ملقط غرامة لإزالة طبقة عضلة الرحم.
- فتح الكيس المحي الحشوية والسلى للكشف عن الجنين. أخذ الحذر عند قطع الأوعية الدموية الانضمام إلى الجنين إلى المشيمة / الحشوية الكيس المحي، كما أنها تتشابك مع الأمعاء النامية.
- قطع رأس الجنين في الرقبة.
- إدراج ملقط مغلقة في تجويف البطن للجنين، فوق الكبد حمراء بلون الظلام، والسماح للملقط مفتوحة من نفسها (وقف الضغط) لجعل افتتاح مستعرضة في تجويف البطن. سحب الملقط فتحت أسفل نحونهاية الخلفي من الجنين لفتح البطن تماما.
- الاستيلاء على الأنسجة الضامة وراء الكبد وسحب الشجاعة للخروج من البطن، والحرص على عدم كسر الأمعاء (مرفق القولون إلى الشرج).
- قطع القولون لتحرير الشجاعة من بقية الجنين. ويمكن إجراء خفض في أي مكان على طول القولون. نحتفظ جزء الذيل في وقت لاحق.
- ندف من النسيج الضام من الأعور، ثم بقية الأمعاء. يجب الحرص على عدم جرح الأمعاء أثناء القيام بذلك.
- قطع بعيدا الكبد والمعدة (على نهاية منقاري من الأمعاء الدقيقة)، وكذلك mesonephros والتلال الأعضاء التناسلية إذا كان بعض موجودة.
- عزل الأمعاء الدقيقة. مرة أخرى، يجب الحرص على عدم وأد الأمعاء. من الآن فصاعدا، يمكن تتبع التوجه rosrrocaudal من أنسجة الأمعاء باستخدام انحناء حاد موجودة على نهاية منقاري. ترك الأمعاء الدقيقة في برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة لفترة قصيرة قدر الإمكان قبل مالفراش (انظر الخطوة 3.3).
- أخيرا، تسجيل عدد من somites الذيل لكل الجنين لتحديد بدقة مرحلة التطور الجنيني.
3. باجتزاء الجنينية الأمعاء
- قبل الشروع في تشريح الجنين، تذوب 1.5 غرام الاغاروز في 100 مل PBS (الفوسفات مخزنة المالحة) والحفاظ على 50 درجة مئوية.
- صب ذاب الاغاروز إلى العفن التضمين (على سبيل المثال مغلقة 2 مل أنبوب microcentrifuge التي تم قطع بالطول لاستئصال حوالي 1/4 من جدار الأنبوب). السماح للالاغاروز يبرد إلى حوالي 42-45 درجة مئوية، وينبغي أن يكون فقط دافئ قليلا لمسة.
- تضمين الأمعاء الجنينية قبل يتصلب الاغاروز (وهذا يمكن أن يتم تقييمها مع ملقط النصائح وسوف تحدث حول 36-38 درجة مئوية). عقد الأمعاء مع ملقط بحلول نهاية منقاري مطوية، تسحبه ببطء شديد من خلال الاغاروز على طول القالب. وهذا يساعد على الحفاظ على الأمعاء على التوالي في حين أن مجموعات الاغاروز. الافراج عن رتصدر بمجرد أن تبدأ لمقاومة يجري نقلها. تتبع توجيه منقاري الذيلية للامعاء.
- وضع القالب في الثلاجة مدة 2-3 دقائق، لضمان الاغاروز وقد وضعت تماما.
- اخراج الاغاروز من العفن (من الانزلاق للخروج من أنبوب إيبندورف فتح). بشفرة، واخراج الاغاروز الزائدة عند كلا الطرفين، مما يجعل التخفيضات عمودي على الأمعاء.
- الغراء نهاية منقاري من الأمعاء / الاغاروز منع أسفل على المسرح معدنيه مشراح تهتز مع النصل. تقليم الاغاروز الزائدة على جانبي كتلة الأمعاء / الاغاروز.
- جبل المرحلة المعدنية على غرفة مشراح تهتز. إذا لزم الأمر، وضبط زاوية من مرحلة حتى الأمعاء رأسيا قدر الإمكان (وبالتالي عمودي على النصل). تغطية العينة مع برنامج تلفزيوني الجليد الباردة. جلب شفرة مشراح وصولا الى بضعة ملليمترات تحت سطح العازلة.
- جعل 200 ميكرون vibratome عرضية تخفيضات من الأمعاء-الذيلية معظم الصغيرة، وضمان أن هيحتوي منظمة العمل ضد الجوع شريحة الاغاروز قسم المعوية الكاملة.
4. ثقافة المعوية إإكسبلنتس
- إيداع بلطف قطع طازجة شرائح الأمعاء / الاغاروز شقة على المواد الهلامية الكولاجين مع ملقط، ووضع شريحة واحدة نحو منتصف كل بئر.
- احتضان 3 أيام عند 37 درجة مئوية، في الرطبة 5٪ CO 2 الغلاف الجوي، للسماح للهجرة NCC من ازدراع.
- أخذ شرائح الأمعاء / الاغاروز قبالة هلام الكولاجين بلطف شديد مع ملقط. والحرص على عدم تلف هلام أدناه.
- تجنب لمس هلام الكولاجين مباشرة خلال الخطوات الحضانة وغسل اللاحقة من أجل ضمان أن نمط الهجرة الخلية لا تضطرب. إصلاح مع 500 ميكرولتر من PFA 4٪ (بارافورمالدهيد) (في برنامج تلفزيوني) لكل بئر 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- استبدال تثبيتي مع 500 ميكرولتر من دابي (4 '،6-diamidino-2-phenylindole) حل (5 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني) لكل بئر واحتضان 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- يغسل كل 3X جيدامع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
- تصوير الخلايا الفلورسنت (GFP القنوات ودابي) جزءا لا يتجزأ من هلام الكولاجين داخل كل بئر.
5. تحليل صورة
قدمنا الاستخدام الواسع النطاق لليماغيج 17 إلى معالجة وتحديد الصور ولدت بعد الثقافة ازدراع.
- تبدأ من خلال التصوير شريحة ميكرون في نفس التكبير كما الصور الخلية الفلورسنت. قياس طول واحد ميكرون بالبكسل (باستخدام أداة خط مستقيم).
- تعيين مقياس (تحليل / مجموعة مقياس، وعدد من المدخلات بكسل / ميكرون).
- لكل صورة GFP مضان، وتغيير شكل صورة إلى 8 بت والرمادي (Image/Type/8-bit).
- ضبط شدة الإشارة (صورة / ضبط / السطوع / التباين).
- طرح ضجيج في الخلفية إذا لزم الأمر (عملية / طرح الخلفية؛ ضبط نصف قطرها المتداول الكرة).
- وضع عتبة لتسليط الضوء على الخلايا وكتل الخلية (الصورة / ضبط / عتبة)، ون تطبيق مستجمعات المياه لتقسيم كتل (عملية / ثنائي / مستجمعات المياه).
- تحليل الجزيئات لتحديد المناطق ذات الاهتمام (ROI) وتوليد إحصاءات عدد الخلايا (تحليل / تحليل الجسيمات، وحجم مجموعة الحد الأدنى لاستبعاد المتبقية بكسل).
- تعيين خيارات القياس لتشمل القطر فيريه في (تحليل / مجموعة القياسات).
- مجموعة رويس وقياس ككل لتحديد قطرها فيريه، ومؤشرا على انتشار الخلية (تحليل / أدوات / مدير ROI / عن / OR، ثم مدير ROI / إضافة، ومدير ROI / قياس).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
النتائج التالية تمثل ما يمكن الحصول مع تقنية الموضحة هنا (الشكل 1). استخدام عوامل النمو (أي GDNF) يحفز هجرة المعوي NCC من ازدراع المعوية وإلى هلام الكولاجين، معربا عن GFP (الشكل 2). على الرغم من بعض الخلايا تخرج من ازدراع في غياب عوامل النمو، وهذه هي في الغالب لا GFP المسمى وتمثل دخول السلبي. فمن الضروري إزالة شريحة المعوية من هلام الكولاجين من أجل تسجيل النتائج، حيث أن هذا النسيج لا تزال مكتظة بالسكان الخلايا الفلورسنت ولن تخفي وإلا فإن خلايا الكذب في الكولاجين تحتها. الكمي لهذه النتائج تظهر أن تم العثور على العديد من الخلايا داخل هلام الكولاجين عندما GDNF هو الحاضر، وأن الهجرة النشطة يحدث (الشكل 3). في الواقع، تم العثور على خلايا السلبي على الفور تحت لل explants، داخل القطر من شريحة المعوية، وهر قمة شرق اسيا التي تغزو الخلايا بنشاط هلام الكولاجين الابتعاد عن نقطة انطلاقها وتنتشر أكثر.
الشكل 1. نظرة عامة على التقنية الثقافة ازدراع ألف) السكان الموحدة من الفلورسنت المعوي NCC داخل المنطقة الأمعاء الدقيقة الذيلية التي استخدمت لصنع 200 إإكسبلنتس μ سميكة. شريط مقياس: 200 ميكرون ب) يتم إيداع مستنبت المحتوية على الكولاجين في 24 لوحات جيدة وتترك لتتصلب لمدة 1 ساعة. تترسب Vibratome شرائح جزءا لا يتجزأ الاغاروز الأمعاء الجنينية على المواد الهلامية (شريحة واحدة لكل بئر)، ويسمح الفلورسنت المعوي NCC إلى الهجرة من إإكسبلنتس لمدة 3 أيام. ثم تؤخذ شرائح قبالة قبل التصوير الخلايا التي غزت المواد الهلامية الكولاجين.s/ftp_upload/50709/50709fig1highres.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الشكل 2. تم إصلاح الهجرة الخلية من ازدراع الأمعاء وداخل هلام الكولاجين. الخلايا التي هاجرت من أصل ازدراع المعوية خلال فترة الحضانة لمدة 3 أيام في غياب أو وجود من 10 نانوغرام / مل GDNF، ملطخة دابي (الأزرق) وتصويرها ل تظهر GFP المسمى المعوي NCC (الخضراء). 70X التكبير. شريط مقياس: 100 ميكرون. الخط المنقط يمثل حجم تقريبي وموقع ازدراع قبل اتخاذ تشغيله الجل. انقر هنا لعرض أكبر شخصية. اضغط ساعةيحرث لمشاهدتها بشكل اكبر.
الرقم 3. وكان كميا الكمي للالمعوية المحتملة الهجرة NCC. عدد وانتشار (قطر فيريه و) من الخلايا، معربا عن GFP المهاجرة من إإكسبلنتس الأمعاء بعد 3 أيام باستخدام برنامج ImageJ 17. في كلتا الحالتين، هناك فرق كبير بين الظروف غير المعالجة وGDNF المعاملة وفقا لاختبار ر الطالب (ع <0.001؛ *). أدرج التمييز بين دخول السلبي والنشط الهجرة: متوسط قطرها شرائح المعوية (260 ميكرون منقطة خط أسود). الإقليم الشمالي: غير المعالجة، ن: عدد إإكسبلنتس معالجة اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وتبين لنا كيف يمكن استخدام لدينا فيفو السابقين الثقافة ازدراع تقنية لقياس بدقة المعوية المحتملة الهجرة NCC في وجود GDNF. ومثل هذا القياس الكمي الدقيق سهلت إلى حد كبير باستخدام 200 ميكرون سميكة المقاطع vibratome الأمعاء بدلا من قطع كبيرة من حجم تقريبي، كما هو موضح سابقا 11،12،15. في الواقع، وهذا يسمح لنا بالعمل مع عدد معقول من الخلايا في إعداد تكرار للغاية. من المذكرة، وتوزيع موحد من الفلورسنت المعوي NCC داخل المنطقة الذيلية الأكثر من الأمعاء الدقيقة التي يتم قطع شرائح ازدراع يسمح أيضا تحليل مقاطع متعددة من القناة الهضمية واحد (الشكل 1A). وعلاوة على ذلك، بالنظر إلى أن كلا المعوية NCC ومحاور عصبية يمكن الخروج من الأنسجة في مثل هذه المقايسات 11، انسحاب لل explants في نهاية الفترة الثقافة يتيح لنا التركيز حصرا على المهاجرة NCC.
وقد وردت معظم الخطوات الحاسمة في نص البروتوكول، ولكن كما ثelfare من ازدراع المعوية هو الهدف الأسمى الحصول على صحي المهاجرة NCC، ينبغي اتخاذ عناية خاصة. تجنب تعريض الأنسجة الجنينية لتغيرات درجة الحرارة المفاجئ، وخاصة عندما يتم تضمين الأمعاء في الاغاروز (الخطوة 3.3). تأكد من أن الأمعاء هي في درجة حرارة الغرفة والاغاروز بارد قدر الإمكان (حتى الآن لا تزال ذاب) لتجنب "الطبخ" في الأنسجة. ازدراع المعوية يجب أن تزدهر على ثقافة مليئة المتوسطة الكولاجين هلام، في كثير من الأحيان زيادة في حجم وإراقة للخروج من شريحة الاغاروز. إذا ظهر ازدراع غير صحية أو أسوأ من ذلك، يميل إلى يهلك أثناء الحضانة، ومحاولة استبدال برنامج تلفزيوني مع وسائل الإعلام والثقافة في درجة حرارة الغرفة (على سبيل المثال HEPES مخزنة-M2 أو DMEM تستكمل مع FBS 10٪) للمساعدة في الحفاظ عليه خلال تشريح.
وجود قيود كبيرة على نهجنا هو أنه يعتمد على توفر خط الماوس منح تسمية الفلورسنت لالمهاجرة NCC. في غياب مثل هذه الموارد، والأجسام المضادة ضد مigrating NCC (مثل مكافحة المتقاعد أو المضادة للSox10) يمكن استخدامها لتسمية الخلايا التي غزت هلام الكولاجين. علاوة على ذلك، نظرا إلى أن الأمعاء الدقيقة بيئة أكثر تعقيدا بكثير من مجرد هلام الكولاجين بسيطة، النتائج التي تم الحصول عليها مع هذا الاختبار في المختبر قد لا تعكس بالكامل سلوك المعوي NCC في الجسم الحي. ينصح تجارب إضافية تشمل التصوير الخلية الحية لتقييم هذا السلوك. ومن الجدير بالذكر أيضا أنه بالإضافة إلى دورها بوصفها جاذب كيميائي، ومن المعروف GDNF لتعزيز انتشار المهاجرة المعوي NCC 4. لدينا مقياس المعوية المحتملة الهجرة NCC في وجود GDNF وبالتالي ربما مزيج من الهجرة الخلية الحقيقية وتكاثر الخلايا، أقرب إلى آليات في الجسم الحي مما أدى إلى NCC استعمار الامعاء. إذا كان المطلوب تمييز واضح بين هاتين العمليتين، إضافة مانع دورة الخلية (مثل AZD 5438 18) في وسائل الإعلام والثقافة يمكن أن تحد من التحليل لmigratio الخليةن.
هذه التقنية يمكن توسيعها لاختبار مختلف بروابط أخرى خارج الخلية وكذلك مثبطات مسارات إشارات محددة، وأي مزيج فيه. الأنسجة الأخرى ويمكن أيضا يحتمل أن تشريح ومقطوع، والسماح للدراسة الهجرة NCC في العديد من الهياكل الجنينية. جنبا إلى جنب مع الرواية و / أو سلالات الفئران الطافرة uncharacterized مع عيوب محتملة في التنمية NCC، لدينا تقنية يمكن تطبيقها على الشاشة بسرعة لأوجه القصور في السلوك الهجرة ردا على الأحداث إشارات محددة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نشكر دينيس Flipo لمعالجة الصور وتحليلها وتقديم المشورة، وديفيد دبليو السيلفر في المختبر الذي تم إنشاء خط الماوس Gata4p [5KB]-GFP. ويتم تمويل البحوث في المختبر بيلون من قبل CIHR، NSERC، FRQS وFRQNT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM powder | Wisent | 219-010-XK | |
| NaHCO3 | Bioshop | SOB999 | Biotechnology grade |
| Steriflip vacuum filtration system (0.22 micron) | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Penicilin-Streptomycin solution, 100x | Wisent | 450-201-EL | |
| Fetal bovine serum | Wisent | 095-150 | High quality grade |
| Collagen I | BD biosciences | 354236 | |
| NaOH | Bioshop | SHY700 | Diluted from 10 N stock then sterile-filtered |
| GDNF | Cedarlane | CLCYT305 | |
| Falcon 24-well Plate | BD biosciences | 353047 | |
| Dissecting scissors | Fisher Scientific | 089515 | |
| Glass Petri dish | VWR | 89000-306 | |
| PBS | Sigma | P5493 | Cell culture grade |
| Dissecting microscope | Leica | M125 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001 | Biotechnology grade |
| Surgical blade | Feather | 21 | |
| All Purpose Instant Krazy Glue Pen | Krazy Glue | KG824 | |
| HM 650V Vibrating-Blade Microtome | Thermo Scientific | 920110 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 | |
Table of specific reagents and equipment. |
|||
References
- Bronner, M. E., Le Douarin, N. M. Development and evolution of the neural crest: An overview. Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).
- Bergeron, K. F., Silversides, D. W., Pilon, N. The developmental genetics of Hirschsprung's disease. Clin. Genet. 83 (1), 15-22 (2013).
- Obermayr, F., Hotta, R., Enomoto, H., Young, H. M. Development and developmental disorders of the enteric nervous system. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 10 (1), 43-57 (2012).
- Sasselli, V., Pachnis, V., Bursn, A. J.
- Sanchez, M. P., Silos-Santiago, I., et al. Renal agenesis and the absence of enteric neurons in mice lacking GDNF. Nature. 382 (6586), 70-73 (1996).
- Baynash, A. G., Hosoda, K., et al. Interaction of endothelin-3 with endothelin-B receptor is essential for development of epidermal melanocytes and enteric neurons. Cell. 79 (7), 1277-1285 (1994).
- Chalazonitis, A., Pham, T. D., et al. Neurotrophin-3 is required for the survival-differentiation of subsets of developing enteric neurons. J. Neurosci. 21 (15), 5620-5636 (2001).
- Goldstein, A. M., Brewer, K. C., Doyle, A. M., Nagy, N., Roberts, D. J. BMP signaling is necessary for neural crest cell migration and ganglion formation in the enteric nervous system. Mech. Dev. 122 (6), 821-833 (2005).
- Jiang, Y., Liu, M. T., Gershon, M. D. Netrins and DCC in the guidance of migrating neural crest-derived cells in the developing bowel and pancreas. Dev. Biol. 258 (2), 364-384 (2003).
- Ramalho-Santos, M., Melton, D. A., McMahon, A. P. Hedgehog signals regulate multiple aspects of gastrointestinal development. Development. 127 (12), 2763-2772 (2000).
- Natarajan, D., Marcos-Gutierrez, C., Pachnis, V., de Graaf, E. Requirement of signaling by receptor tyrosine kinase RET for the directed migration of enteric nervous system progenitor cells during mammalian embryogenesis. Development. 129 (22), 5151-5160 (2002).
- Young, H. M., Hearn, C. J., et al. GDNF Is a chemoattractant for enteric neural cells. Dev. Biol. 229 (2), 503-516 (2001).
- Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review. J. Med. Genet. 45 (1), 1-14 (2008).
- Pilon, N., Raiwet, D., Viger, R. S., Silversides, D. W. Novel pre- and post-gastrulation expression of Gata4 within cells of the inner cell mass and migratory neural crest cells. Dev. Dyn. 237 (4), 1133-1143 (2008).
- Nagy, N., Goldstein, A. M. Endothelin-3 regulates neural crest cell proliferation and differentiation in the hindgut enteric nervous system. Dev. Biol. 293 (1), 203-217 (2006).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersen, K., Behringer, R. Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. , 3rd ed, CSH Press. Cold Spring Harbor. 209-250 (2003).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Byth, K. F., Thomas, A., et al. AZD5438, a potent oral inhibitor of cyclin-dependent kinases 1, 2, and 9, leads to pharmacodynamic changes and potent antitumor effects in human tumor xenografts. Mol. Cancer Ther. 8 (7), 1856-1866 (2009).
