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Neuroscience

Eine quantitative Assay für Zellmigration Murine Enteric neuralen Vorläuferzellen

doi: 10.3791/50709 Published: September 18, 2013

Summary

Wir stellen ein ex vivo-Assay, der die Zellmigration präzise Quantifizierung der ente Neuralleistenzellen Migrationspotential in Gegenwart von verschiedenen Wachstumsfaktoren ermöglicht.

Abstract

Neuralleistenzellen (NCC) sind eine vorübergehende und multiZellPopulation, die aus dem dorsalen Neuralrohr stammt und ausgiebig wandert in den Entwicklungswirbeltierembryo. Neben der Bereitstellung von peripheren Neuronen und Glia, NCC erzeugen Melanozyten sowie die meisten der Schädel-Gesichtsskeletts. NCC Migration und Differenzierung wird durch eine Kombination ihrer axialen Ursprung entlang des Neuralrohrs und ihrer Ausrichtung auf regional unterschiedliche extrazelluläre Signale gesteuert. Ein solcher Beitrag der extrazellulären Liganden bei der Bildung des enterischen Nervensystem (ENS), einem komplexen Netzwerk von miteinander verbundenen neuralen Ganglien, die lokal steuert (unter anderem) Darmmuskelbewegung und Darmmotilität besonders deutlich. In einem rostral Schwanz fashion - - über die gesamte Länge des zukünftigen Darm meisten der ENS wird aus einer kleinen Anfangs Pool von NCC, die eine lange Reise, um zu kolonisieren verpflichten abgeleitet. Unter mehreren Signalwege bekanntbeeinflussen ente NCC Kolonisation wird GDNF / RET-Signalisierung als wichtigste anerkannt. Tatsächlich ist zeitlich und räumlich gesteuert Sekretion des RET-Liganden GDNF durch den Darm Mesenchym vor allem für die Attraktivität und Anleitung von RET-exprimierenden ente NCC nach und in der embryonalen Darm verantwortlich. Hier beschreiben wir ein ex vivo Zellmigrationsassay unter Verwendung einer transgenen Mauslinie, die über fluoreszenzmarkierten NCC, die genaue Quantifizierung von ente NCC Migrationspotential in Gegenwart von verschiedenen Wachstumsfaktoren, einschließlich GDNF ermöglicht.

Introduction

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Neuralleistenzellen (NCC) sind eine Übergangszelltyp spezifisch für Wirbeltiere, die während der Embryonalentwicklung viele Derivate bildet. Diese Zellpopulation entsteht am Rand des neuronalen Platte, benachbart zu nicht-neuralen Ektoderm 1. Während Neurulation, Biegen der Neuralplatte NCC Orten entlang der dorsalen Rand der bildenden Neuralrohr. NCC laufen dann eine epitheliale-mesenchymale Transition, Trennung und die Migration weg von dem Neuralrohr. NCC besiedeln verschiedenen embryonalen Strukturen, einschließlich des Verdauungstraktes, wo sie den gesamten enterische Nervensystem (ENS) zu bilden, ein zusammenhängendes Netzwerk von Nervenknoten in der Darmwand eingebettet. Wie kürzlich Bewertung 2,3 haben viele Gene in der Entwicklung dieser komplizierten Struktur beteiligt.

Die meisten der ENS wird aus einem kleinen Pool von NCC mit Ursprung aus dem Vagus Neuralrohr (dh rund um die potenziellen Hinterhirn / Rückenmark-Grenze) abgeleitet 4.Diese neuronalen Vorläuferzellen erreichen die Vorderdarm um embryonalen Tag (e) 9,0 bei Mäusen und dann kaudal wandern im Darm Mesenchym bis ca. EUR 15,0 um die ganze embryonalen Darm zu kolonisieren. Eine kleinere Teilmenge von Kolon neuralen Vorläuferzellen wird auch durch sakrale NCC, die den hinteren Darm in die entgegengesetzte Richtung bis zum Blinddarm 4 eindringen vorgesehen. Sowohl Vagus-und sakralen NCC erfordern mehrere migrations, Proliferation-, Überlebens-und Differenzierungsfördernde Hinweise, um vollständige Bildung des ENS zu gewährleisten. In dieser Hinsicht Tiermodellen - vor allem gentechnisch veränderte Mäuse - haben maßgeblich bei der Identifizierung von mehreren wesentlichen extrazellulären Liganden: GDNF (Glia-Zellen-derived neurotrophic factor), Endothelin-3, Neurotrophin-3, BMPs (Bone morphogenetische Proteine), Netrin sowie Sonic und Indian Hedgehog (Shh und Ihh) 10.05. Von diesen ist GDNF Signal durch die Transmembran-Rezeptor-Tyrosin-Kinase RET (während der Transfektion Rearranged) als th erkanntE kritischen Weg für die Anziehung und Führung von NCC nach und in der embryonalen Darm. GDNF ist durch den Darm ausgeschieden und Mesenchym bildet eine raumzeitlich gesteuert rosrrocaudal Gradienten, die direkt chemoattractive zu ente NCC, die ausdrücken, RET ist 11,12.

Neben anderen Funktionen steuert der ENS Bewegung im Verdauungstrakt durch seine Wechselwirkung mit der glatten Muskulatur in der Darmwand. Abwesenheit von neuralen Ganglien im Anschlussbereich der Darm Ergebnisse in Hirschsprung-Krankheit: tonische Kontraktion des betroffenen Segments führt zu Verstopfung stromauf Anhäufung von aufgeschlossenen Material und massive Ausdehnung des Darms und Bauch. Hirschsprung-Krankheit tritt in etwa einem von 5.000 Lebendgeburten. Die rostro-kaudale Migrationsmuster von magensaft NCC ist vermutlich die wichtigsten Einflussfaktor auf die Ätiologie der Hirschsprung-Krankheit sein. Der Doppelpunkt, die am weitesten von der Quelle der Migration NCC und letzte Teil Bowel besiedelt zu werden, ist besonders anfällig für Mängel in der ENS-Bildung. In Übereinstimmung mit ihrer entscheidenden Rolle bei magensaftresistenten NCC Migration ist Störung der GDNF / RET Signalisierung der Haupt bekannte genetische Ursache von Morbus Hirschsprung 13.

Um besser zu studieren, NCC und ENS Entwicklung, erzielten wir eine transgene Mauslinie - mit Namen Gata4p [5 kb]-GFP 14 -, in dem Migrations NCC mit Green Fluorescent Protein (GFP) markiert. Als nächstes perfektioniert ein ex vivo Zellmigrationsassay, durch andere Gruppen 11,12,15 aus veröffentlichten Arbeiten ausgelegt, die jetzt ermöglicht eine präzise Quantifizierung der ente NCC Migrationspotential in Gegenwart von verschiedenen Wachstumsfaktoren, wie GDNF.

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Protocol

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Ethik-Erklärung

Experimente mit Mäusen wurden folgende Kanadischer Rat der Tierpflege-Richtlinien für die Versorgung und Manipulation von Tieren in der medizinischen Forschung durchgeführt. Protokolle, die die Manipulation der Tiere wurden von der Ethikkommission der Universität von Quebec in Montreal genehmigt (Comité institutionnel de Protection des Animaux, Referenznummer 0512-R3-650 bis 0513).

1. Herstellung von Kollagen-Gels

Arbeiten Sie in einem steril unter einer Gewebekultur Kapuze.

  1. Bereiten Sie komplette 5x DMEM (Eagle modifiziertem essentiellen Medium) einschließlich Standard-Antibiotika. Man löst 3,37 g DMEM-Pulver und 0,925 g NaHCO 3 in 20 ml Wasser. Sterilisiert, indem sie durch ein 0,22 um-Filter. Hinzufügen von 2,5 ml sterilem 100x Penicillin / Streptomycin und 25 ml sterile hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum. Lagern bei 4 ° C
  2. Auf Eis, mischen Sie 800 ulvon Collagen-I-Lösung (3,77 mg / ml in 0,02 N Essigsäure, filtersterilisiert), 600 ul 5x vollständigen DMEM und 17 &mgr; l 1 N NaOH. Verdünnt mit sterilem Wasser auf ein Endvolumen von 3 ml. Fügen Sie relevanten Wachstumsfaktoren in der Mischung. Wir verwenden in der Regel GDNF bei 10 ng / ml zu ente NCC Migration anzuregen.
  3. Kaution ca. 480 ul in jede Vertiefung einer einzelnen Zeile in einer 24-Well-Platte. Vermeiden Sie Luftblasen. Die restlichen Zeilen verwendet werden, um die Wirkung anderer Wachstumsfaktoren auf die Zellmigration testen.
  4. Das Kollagen zu polymerisieren lassen mindestens 1 Stunde in einem sterilen Inkubator bei 37 ° C.

2. Präparation der Tiere 16

  1. Richten Sie Paarungen und überprüfen Vaginalpfropf am nächsten Morgen. Tag E0.5 als Uhr am Tag der vaginale Stecker gefunden wird, isolieren die weibliche und warten Sie 12 Tage bis E12.5.
  2. Anesthetize schwangere Mäuse mit Isofluran und einschläfern durch CO 2-Inhalation.
  3. Sprühen Sie die Maus mit 70% Ethanol. Heben Sie die Bauch skin und öffnen Sie den Bauch Hohlraum mit Dissektionsscheren.
  4. Entfernen der Gebärmutter in eine Glaspetrischale mit eiskaltem PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) gefüllt. Schneiden Sie die Gebärmutter quer zwischen den einzelnen deciduum Schwellungen, jeden Embryo Implantationsstelle zu isolieren.
  5. Die Arbeiten an jeder Implantationsstelle separat in einem anderen Glaspetrischale mit eiskaltem PBS gefüllt. Unter einem Binokular, feinen Pinzette verwenden, um die Muskelschicht der Gebärmutter zu entfernen.
  6. Öffnen Sie die viszerale Dottersack und Amnion, um den Embryo zu offenbaren. Achten Sie beim Abtrennen der Blutgefäße Beitritt der Embryo mit der Plazenta / viszeralen Dottersack, da sie mit den Entwicklungs Darm verflochten.
  7. Sever Kopf des Embryos am Hals.
  8. Legen Sie eine geschlossene Zange in der Bauchhöhle des Embryos, knapp über dem dunklen rot gefärbten Leber und lassen Sie die Zange geöffnet von sich selbst (mehr anwenden Druck), um eine Queröffnung in den Bauch Hohlraum zu machen. Ziehen Sie die Zange geöffnet nach unten in Richtungdas hintere Ende des Embryos, um den Bauch vollständig zu öffnen.
  9. Schnappen Sie sich das Bindegewebe hinter der Leber und aus dem Bauch ziehen den Mut, man aufpassen, nicht zu brechen, den Darm (der Dickdarm bis zum Anus beigefügt).
  10. Schneiden Sie den Doppelpunkt, um die Eingeweide aus dem Rest des Embryos zu befreien. Der Schnitt kann an jeder Stelle entlang des Dickdarms werden. Reservieren Sie den Schwanzteil für später.
  11. Herauszuarbeiten, die das Bindegewebe von der Blinddarm, dann den Rest des Darms. Achten Sie darauf, um den Darm gewickelt, während dies zu tun.
  12. Schneiden Sie die Leber und Magen (auf dem rostralen Ende des Dünndarms), sowie die Urniere und Genitalleisten, wenn einige vorhanden sind.
  13. Isolieren Sie den Dünndarm. Auch darauf achten, nicht um den Darm zu ersticken. Von nun an kann der rosrrocaudal Ausrichtung des Darmgewebe unter Verwendung des auf der rostralen Ende vorhanden scharfen Krümmung verfolgt werden. Lassen Sie den Dünndarm in PBS bei Raumtemperatur für so kurze Zeit wie möglich vor emBettwäsche (siehe Schritt 3.3).
  14. Schließlich notieren die Anzahl der Schwanz Somiten für jeden Embryo das Stadium der embryonalen Entwicklung genau zu bestimmen.

3. Schnitte von embryonalen Darm

  1. Bevor Sie mit Embryo Dissektionen fortfahren, schmelzen 1,5 g Agarose in 100 ml PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) und halten bei 50 ° C
  2. Gießen Agarose in eine Einbettungsform geschmolzen (zB ein geschlossener 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen, die längs geschnitten auf etwa 1/4 der Rohrwand herausgeschnitten). Lassen Sie die Agarose abkühlen auf ca. 42-45 ° C, sollte es nur leicht warm an.
  3. Betten Sie die embryonalen Darm, kurz bevor die Agarose erstarrt (dies kann mit einer Pinzette Tipps ausgewertet und 36-38 ° C um auftreten). Halten Sie den Darm mit einer Zange durch die gefaltete rostralen Ende, ziehen Sie es sehr langsam durch die Agarose entlang der Länge der Form. Dies hilft, den Darm gerade, während die Agarose-Sets zu halten. Lassen Sie die Tausgeben, sobald sie beginnt, zu wider bewegt. Verfolgen Sie die rostral-kaudale Ausrichtung der Darm.
  4. Legen Sie die Form in einem Kühlschrank 2-3 Minuten, um zu gewährleisten, die Agarose wurde komplett eingestellt.
  5. Nehmen Sie die Agarose aus der Form (indem Sie sie aus dem geöffneten Eppendorf-Röhrchen). Mit einer Klinge, nehmen Sie die überschüssige Agarose an beiden Enden, Kürzungen senkrecht auf den Darm.
  6. Kleben Sie den rostralen Ende des Darms / Agarose blockieren Sie auf die Metallphase eines Mikrotom mit vibrierender Klinge. Schneiden Sie die überschüssige Agarose an den Seiten des Darms / Agarose-Block.
  7. Montieren Sie den Metall Bühne, auf der vibrierenden Mikrotom Kammer. Wenn nötig, stellen Sie den Winkel der Bühne, so ist der Darm so senkrecht wie möglich (also senkrecht zur Klinge). Decken Sie die Probe mit eiskaltem PBS. Bringen Sie die Mikrotomklinge bis auf wenige Millimeter unter der Oberfläche Puffer.
  8. Stellen Sie 200 um Vibratoms Querschnitte der Schwanz-die meisten Dünndarm, sicherzustellen, dass die each Agarose-Scheibe enthält eine vollständige Darmabschnitt.

4. Kultur der Darm Explantate

  1. Sanft legen das frisch geschnittene Darm / Agarose-Scheiben flach auf den Kollagen Gele mit einer Pinzette, indem eine Scheibe in die Mitte von jedem gut.
  2. Inkubiere 3 Tage bei 37 ° C in einer feuchten 5% CO 2-Atmosphäre, um die Migration von NCC aus dem Explantat ermöglichen.
  3. Nehmen Sie die Darm / Agarose-Scheiben aus dem Kollagen-Gel sehr vorsichtig mit einer Pinzette. Achten Sie darauf, um das Gel unter beschädigen.
  4. Vermeiden direkt während der nachfolgenden Inkubation und Waschschritte, um Berühren der Kollagen-Gel, um sicherzustellen, dass die Zellmigrationsmuster nicht gestört wird. Fix mit 500 ul 4% PFA (Paraformaldehyd) (in PBS) pro Vertiefung 1 Stunde bei Raumtemperatur.
  5. Ersetzen Sie das Fixiermittel mit 500 ul DAPI (4 ',6-Diamino-2-phenylindol)-Lösung (5 pg / ml in PBS) pro Vertiefung und Inkubation 10 Minuten bei Raumtemperatur.
  6. Waschen Sie jede Vertiefung 3xmit 500 ul PBS für 5 min.
  7. Fotografieren Sie die fluoreszierenden Zellen (GFP und DAPI-Kanäle) in der Kollagen-Gel in jedem gut eingebettet.

5. Bildanalyse

Wir haben umfangreiche Verwendung von ImageJ 17 zu verarbeiten und zu quantifizieren, die nach Explantatkultur erzeugten Bilder.

  1. Beginnen Sie mit der Abbildung einer Mikrometer-Objektträger mit der gleichen Vergrößerung wie die fluoreszierenden Zell Fotografien. Messen Sie die Länge von einem Mikrometer in Pixeln (mit der Straight Line Tool).
  2. Stellen Sie die Skala (Analyse / Set-Skala; Eingang Anzahl der Pixel / Mikron).
  3. Für jedes Foto GFP-Fluoreszenz, ändern Sie das Bildformat auf 8-Bit-Graustufen (Image/Type/8-bit).
  4. Passen Sie Intensität des Signals (Bild / Anpassen / Helligkeit / Kontrast).
  5. Subtrahieren Sie die Hintergrundgeräusche, falls erforderlich (Prozess / Subtrahieren Hintergrund; stellen Sie den rollenden Ball Radius).
  6. Stellen Sie eine Schwelle, um Zellen und Zellklumpen (Bild / Anpassen / Threshold), markieren Sie dieeinen Wende n anwenden, um die Klumpen (Process / Binary / Watershed) teilen.
  7. Analysieren Teilchen Regionen von Interesse (ROI) zu spezifizieren und generieren Zellzahl-Statistik (Analyse / Analysieren Partikel; Set-Größe Mindest, um die verbleibenden Pixel auszuschließen).
  8. Stellen Messoptionen zu Feret-Durchmesser (Analyse / Set Maße) enthalten.
  9. Gruppe ROIs und messen als Ganzes der Feret-Durchmesser zu bestimmen, die Angabe der Zellausbreitung (Analysieren / Tools / ROI-Manager / Mehr / OR, dann ROI-Manager / Hinzufügen und ROI-Manager / Measure).

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Representative Results

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Die folgenden Ergebnisse sind repräsentativ dafür, was mit dem hier beschriebenen (1)-Technik erhalten werden. Die Verwendung von Wachstumsfaktoren (dh GDNF) stimuliert die Migration der GFP-exprimierenden ente NCC aus dem Darm in das Explantat und Kollagen-Gel (Abb. 2). Obwohl einige Zellen kommen aus dem Explantat in Abwesenheit von Wachstumsfaktoren, sind diese meist nicht GFP-markierten und für passive Eintrag. Es ist notwendig, die Scheibe von dem Darm Kollagen-Gel, um die Ergebnisse aufzuzeichnen entfernen, da dieses Gewebe noch stark von fluoreszierenden Zellen besiedelt und sonst die Zellen in der darunter liegenden Kollagen verbergen. Die Quantifizierung dieser Ergebnisse zeigt, dass viele mehr Zellen in der Kollagen-Gel gefunden, wenn GDNF vorhanden ist, und dass aktive Migration stattfindet (Abbildung 3). Tatsächlich sind passive Zellen unmittelbar unter der Explantate festgestellt, innerhalb des Durchmessers eines Darm Scheibe, überall dort eas Zellen, die Kollagen-Gel eindringen aktiv bewegen sich weg von dem Ort ihrer Entstehung und Ausbreitung weiter.

Figur 1
Fig. 1 ist. Übersicht der Explantatkultur Technik. A) Uniform Bevölkerung von fluoreszierenden ente NCC innerhalb der Schwanzdünndarmbereich verwendet werden, um 200 μ dicken Explantate zu machen. Maßstab:. 200 um B) Das Kulturmedium Kollagen enthält, wird in 24-Well-Platten abgeschieden und dann für 1 Stunde aushärten. Vibratom Scheiben Agarose eingebettete embryonalen Darm auf den Gelen (eine Scheibe pro Vertiefung) aufgebracht und Fluoreszenzente NCC dürfen von der Explantate für 3 Tage migrieren. Die Scheiben werden dann aus, bevor Sie die Abbildung der Zellen, die die Kollagen-Gele eingedrungen übernommen.s/ftp_upload/50709/50709fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Figur 2
2. Zellmigration aus der Darm Explantat und im Kollagengel. Zellen, die während der 3-tägigen Inkubation in Abwesenheit oder Gegenwart von 10 ng / ml GDNF aus einer Darm Explantat migriert wurden fixiert, mit DAPI (blau) gefärbt und fotografiert zeigen GFP-markierten ente NCC (grün). 70X Vergrößerung. Maßstabsbalken: 100 um. Die gestrichelte Linie zeigt die ungefähre Größe und Lage der Explantation, bevor es aus dem Gel gemacht. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen. Klicken Sie hehe eine größere Ansicht.

Fig. 3
3. Quantifizierung von ente NCC Migrationspotential. Die Anzahl und die Ausbreitung (Feret-Durchmesser) von GFP-exprimierenden Zellen, die Migration von Darm-Explantate wurde nach 3 Tagen mit 17 ImageJ Software quantifiziert. In beiden Fällen gibt es einen signifikanten Unterschied zwischen unbehandelten und mit GDNF-behandelten Bedingungen nach einem Student-t-Test (p <0,001; *). Der durchschnittliche Durchmesser der Darm Scheiben (gestrichelte schwarze Linie: 260 um) wurde aufgenommen, um zwischen passiven und aktiven Eintrag Migration zu unterscheiden. Nt: nicht behandelten, n:. Anzahl der Explantate verarbeitet Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

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Discussion

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Wir zeigen, wie unser Ex-vivo-Explantatkultur Technik kann verwendet werden, um genau zu quantifizieren ente NCC Migrationspotential in Gegenwart von GDNF werden. Eine solche genaue Quantifizierung wird stark durch Verwendung von 200 um dicke Vibratoms Darmstücke statt große Stücke ungefähre Größe, wie zuvor beschrieben, 11,12,15 erleichtert. Tatsächlich ermöglicht uns das mit einer angemessenen Anzahl von Zellen in einem hoch reproduzierbare Einstellung zu arbeiten. Zu beachten ist, ermöglicht die gleichmäßige Verteilung von fluoreszierenden ente NCC im Schwanz äußersten Bereich des Dünndarms aus dem Explantat Scheiben geschnitten Analyse auch aus mehreren Abschnitten aus einem einzigen Darm (Fig. 1A). Angesichts der Tatsache, dass sowohl ente NCC und Axone kann das Gewebe in solchen Tests 11, Entzug der Explantate am Ende der Kulturperiode beenden lässt uns konzentrieren sich ausschließlich auf die Migrations NCC.

Die meisten kritischen Schritte wurden in dem Protokoll Text jedoch als w dargelegt,elfare der Darm Explantation ist ausschlaggebend für den Erhalt gesunder Migration NCC sollte besonders darauf geachtet werden. Vermeiden Sie, embryonalen Geweben plötzlichen Temperaturänderungen, insbesondere, wenn der Darm in Agarose (Schritt 3.3) eingebettet. Stellen Sie sicher, dass der Darm ist bei Raumtemperatur und der Agarose so kühl wie möglich (aber immer noch geschmolzen) zu vermeiden, "Kochen" das Gewebe. Die Darm Explantation sollte auf dem Kulturmedium gefüllten Kollagen-Gel gedeihen, die oft in der Größe zunimmt und Verschütten aus dem Agarose-Slice. Wenn der Explantation scheint ungesund oder noch schlimmer, neigt dazu, während der Inkubation umkommen, tauschen Sie die PBS mit Kulturmedium bei Raumtemperatur (zB HEPES-gepufferte M2 oder DMEM mit 10% FBS), die dazu beitragen es beim Präparieren.

Eine wesentliche Einschränkung zu unserem Ansatz ist, dass es auf die Verfügbarkeit einer Mauslinie verleihen eine Fluoreszenzmarkierung der Migration NCC setzt. In Abwesenheit einer solchen Ressource, ein Antikörper gegen migrating NCC (zB Anti-Ret-oder Anti-Sox10) kann verwendet werden, um Zellen, die das Kollagen-Gel eingedrungen markieren. Darüber hinaus, da die Darmmikroumgebung ist viel komplexer als eine einfache Kollagengel Ergebnisse dieser in vitro-Assay erhaltenen nicht ganz das Verhalten ente NCC in vivo widerspiegeln könnte. Weitere Experimente mit lebenden Zellen werden empfohlen, um dieses Verhalten zu beurteilen. Bemerkenswert ist auch, dass zusätzlich zu seiner Rolle als ein Chemolockstoff, GDNF ist bekannt, um die Proliferation von wandernden ente NCC 4 zu fördern. Unser Maß für ente NCC Migrationspotential in Gegenwart von GDNF ist somit wahrscheinlich eine Mischung aus wahren Zellmigration und Zellproliferation, ähnlich den in vivo Mechanismen, die zu NCC Kolonisierung des Darms. Wenn eine klare Unterscheidung zwischen diesen beiden Prozessen gewünscht wird, kann der Zusatz eines Zellzyklusblocker (zB AZD 5438 18) in den Kulturmedien, die Analyse auf Zell migratio beschränkenn.

Diese Technik kann erweitert werden, um verschiedene andere extrazelluläre Liganden sowie Inhibitoren spezifischer Signalwege, und jede Kombination davon zu prüfen. Andere Gewebe können auch potenziell seziert und geschnitten, so dass die Studie der NCC Migration in vielen embryonalen Strukturen werden. Kombiniert mit neuen und / oder nicht charakterisierten Mutanten Mausstämmen mit möglichen Fehlern in NCC Entwicklung können unsere Technik angewendet werden, um schnell zu screenen Mängel in Migrationsverhalten in Reaktion auf spezifische Signalereignisse.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Wir danken Denis Flipo für die Bildverarbeitung und Analyse Beratung und David W. Silver in dessen Labor die Gata4p [5 kb]-GFP-Mauslinie generiert wurde. Die Forschung im Labor wird von Pilon CIHR, NSERC, FRQS und FRQNT finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM powder Wisent 219-010-XK  
NaHCO3 Bioshop SOB999 Biotechnology grade
Steriflip vacuum filtration system (0.22 micron) EMD Millipore SCGP00525  
Penicilin-Streptomycin solution, 100x Wisent 450-201-EL  
Fetal bovine serum Wisent 095-150 High quality grade
Collagen I BD biosciences 354236  
NaOH Bioshop SHY700 Diluted from 10 N stock then sterile-filtered
GDNF Cedarlane CLCYT305  
Falcon 24-well Plate BD biosciences 353047  
Dissecting scissors Fisher Scientific 089515  
Glass Petri dish VWR 89000-306  
PBS Sigma P5493 Cell culture grade
Dissecting microscope Leica M125  
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-20  
Agarose Bioshop AGA001 Biotechnology grade
Surgical blade Feather 21  
All Purpose Instant Krazy Glue Pen Krazy Glue KG824  
HM 650V Vibrating-Blade Microtome Thermo Scientific 920110  
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148  
DAPI Sigma-Aldrich D9564  

Table of specific reagents and equipment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Bergeron, K. F., Cardinal, T., Pilon, N. A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors. J. Vis. Exp. (79), e50709, doi:10.3791/50709 (2013).More

Bergeron, K. F., Cardinal, T., Pilon, N. A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors. J. Vis. Exp. (79), e50709, doi:10.3791/50709 (2013).

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