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Neuroscience

Murine आंत्र तंत्रिका progenitors के लिए एक मात्रात्मक सेल प्रवासन परख

doi: 10.3791/50709 Published: September 18, 2013

Summary

हम विभिन्न विकास कारकों की उपस्थिति में आंतों का तंत्रिका शिखा सेल प्रवास संभावित की सटीक मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है कि एक पूर्व vivo सेल प्रवास परख उपस्थित थे.

Abstract

तंत्रिका शिखा कोशिकाओं (एनसीसी) पृष्ठीय न्यूरल ट्यूब से निकलती है और विकासशील हड्डीवाला भ्रूण भर में बड़े पैमाने पर प्रवास करती है कि एक क्षणिक और multipotent सेल की आबादी हैं. परिधीय glia और न्यूरॉन्स प्रदान करने के अलावा, एनसीसी melanocytes के साथ ही cranio चेहरे कंकाल की सबसे उत्पन्न करते हैं. एनसीसी प्रवास और भेदभाव न्यूरल ट्यूब और क्षेत्रीय स्तर पर अलग बाह्य cues के लिए जोखिम के साथ उनके अक्षीय मूल के संयोजन के द्वारा नियंत्रित किया जाता है. बाह्य ligands के इस तरह के योगदान आंतों का तंत्रिका तंत्र (सत्ता), एक जटिल परस्पर (अन्य बातों के अलावा) स्थानीय रूप से नियंत्रित करता है कि तंत्रिका ganglia के नेटवर्क पेट की मांसपेशी आंदोलन और आंतों की गतिशीलता के गठन के दौरान विशेष रूप से स्पष्ट है. दुम फैशन के लिए एक विजय - स्तम्भ में - - भावी पेट की पूरी लंबाई के सत्ता से अधिकांश उपनिवेश स्थापित करने के क्रम में एक लंबी यात्रा शुरू करने कि एनसीसी के एक छोटे से प्रारंभिक पूल से ली गई है. ज्ञात करने के लिए कई संकेत दे रास्ते के बीच मेंआंतों का एनसीसी बसाना को प्रभावित, GDNF / रेत संकेतन सबसे महत्वपूर्ण माना जाता है. दरअसल, पेट mesenchyme से रेत ligand GDNF की spatiotemporally नियंत्रित स्राव भ्रूण पेट के लिए और भीतर आकर्षण और रेत व्यक्त आंतों का एनसीसी के मार्गदर्शन के लिए मुख्यत: जिम्मेदार है. यहाँ, हम GDNF सहित विभिन्न विकास कारकों की उपस्थिति में आंतों का एनसीसी प्रवास संभावित की सटीक मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है जो fluorescently लेबल एनसीसी, जिनके पास एक ट्रांसजेनिक माउस लाइन का इस्तेमाल कर रही है, एक पूर्व vivo सेल प्रवास परख का वर्णन.

Introduction

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तंत्रिका शिखा कोशिकाओं (एनसीसी) भ्रूण के विकास के दौरान कई डेरिवेटिव रूपों कि रीढ़ के लिए अद्वितीय एक क्षणिक सेल प्रकार के होते हैं. इस सेल की आबादी गैर तंत्रिका बाहरी झिल्ली 1 से सटे तंत्रिका प्लेट, की सीमा पर उठता है. Neurulation के दौरान गठन न्यूरल ट्यूब के पृष्ठीय बढ़त के साथ तंत्रिका प्लेट स्थानों एनसीसी के झुकने. एनसीसी तो segregating और दूर न्यूरल ट्यूब से पलायन, एक उपकला-mesenchymal संक्रमण से गुजरना. एनसीसी वे पूरे आंतों का तंत्रिका तंत्र (सत्ता) के रूप में जहां पाचन तंत्र, आंतों की दीवारों में एम्बेडेड तंत्रिका ganglia के एक परस्पर नेटवर्क सहित विभिन्न भ्रूण संरचनाओं, उपनिवेश. हाल ही में 2,3 की समीक्षा की है, कई जीनों इस जटिल संरचना के विकास में शामिल किया गया है.

सत्ता के अधिकांश (यानी भावी पश्चमस्तिष्क / रीढ़ की हड्डी की सीमा के आसपास) vagal तंत्रिका ट्यूब से एनसीसी उद्भव के एक छोटे से पूल से ली गई है 4.इन तंत्रिका progenitors चूहों में भ्रूण दिन (ई) 9.0 चारों ओर अग्रांत्र तक पहुँचने और लगभग e15.0 पूरे भ्रूण आंतों उपनिवेश स्थापित करने के लिए जब तक तो पेट mesenchyme भीतर दुमदारी विस्थापित. Colonic तंत्रिका progenitors के एक नाबालिग सबसेट भी ऊपर अंधान्त्र 4 को विपरीत दिशा में पीछे पेट पर आक्रमण जो त्रिक एनसीसी द्वारा प्रदान की जाती है. Vagal और धार्मिक दोनों एनसीसी की आवश्यकता एकाधिक प्रवास, प्रसार, सत्ता के पूर्ण गठन को सुनिश्चित करने के अस्तित्व और भेदभाव को बढ़ावा देने cues. इस संबंध में पशु मॉडल - विशेष रूप से आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों - कई आवश्यक बाह्य ligands की पहचान करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है: GDNF (glial सेल व्युत्पन्न neurotrophic कारक), Endothelin -3, neurotrophin -3, BMPs (हड्डी morphogenic प्रोटीन), Netrin , साथ ही ध्वनि और भारतीय हाथी (श्श्श और IHH) 5-10. इनमें से, (अभिकर्मक के दौरान पुन: व्यवस्थित) tyrosine kinase transmembrane रिसेप्टर रेत के माध्यम से संकेत GDNF वें के रूप में मान्यता प्राप्त हैभ्रूण पेट के लिए और भीतर आकर्षण और एनसीसी के मार्गदर्शन के लिए ई सबसे महत्वपूर्ण मार्ग है. GDNF पेट mesenchyme द्वारा स्रावित और रेत 11,12 व्यक्त जो आंतों का एनसीसी, को सीधे chemoattractive है कि एक spatiotemporally नियंत्रित rosrrocaudal ढाल रूपों है.

अन्य कार्यों के बीच, सत्ता आंतों की दीवारों में चिकनी मांसपेशियों के साथ अपनी बातचीत के माध्यम से पाचन तंत्र के भीतर आंदोलन को नियंत्रित करता है. हिर्स्चस्प्रुंग रोग में आंतें परिणाम के टर्मिनल क्षेत्र में तंत्रिका ganglia का अभाव: प्रभावित खंड का टॉनिक संकुचन रुकावट पच सामग्री के अपस्ट्रीम संचय और आंत और पेट का भारी बढ़ाव की ओर जाता है. हिर्स्चस्प्रुंग रोग लगभग एक 5000 में जीवित जन्म होता है. आंतों का एनसीसी की rostro दुम प्रवास पैटर्न हिर्स्चस्प्रुंग रोग के एटियलजि के लिए मुख्य योगदान कारक माना जा रहा है. एनसीसी और बी के अंतिम भाग की ओर पलायन के स्रोत से पेट के, दूरउपनिवेश होने के लिए owel, सत्ता के गठन में दोष के सबसे अतिसंवेदनशील है. आंतों का एनसीसी प्रवास में अपनी महत्वपूर्ण भूमिका के अनुसार, GDNF / रेत संकेतन का विघटन हिर्स्चस्प्रुंग रोग 13 की मुख्य ज्ञात आनुवंशिक कारण है.

[5kb]-GFP 14 Gata4p नाम - - प्रवासी एनसीसी हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के साथ चिह्नित कर रहे हैं, जिसमें बेहतर एनसीसी और सत्ता के विकास का अध्ययन करने के लिए, हम एक ट्रांसजेनिक माउस लाइन उत्पन्न. हम अगले अब GDNF जैसे विभिन्न विकास कारकों की उपस्थिति में आंतों का एनसीसी प्रवास संभावित की सटीक मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है कि अन्य समूहों 11,12,15 द्वारा प्रकाशित काम से रूपांतरित एक पूर्व vivo सेल प्रवास परख,, सिद्ध.

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Protocol

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आचार बयान

चूहों से जुड़े प्रयोगों चिकित्सा अनुसंधान में इस्तेमाल पशुओं की देखभाल और हेरफेर के लिए पशु की देखभाल के दिशा निर्देशों के कनाडा परिषद निम्नलिखित प्रदर्शन किया गया. जानवरों के हेरफेर से जुड़े प्रोटोकॉल मॉन्ट्रियल में क्यूबेक के विश्वविद्यालय की संस्थागत नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया (Comité Institutionnel डे संरक्षण des Animaux; संदर्भ संख्या 0512-R3-650-0513).

1. कोलेजन जैल की तैयारी

एक टिशू कल्चर हुड के तहत, एक बाँझ फैशन में काम करते हैं.

  1. मानक एंटीबायोटिक दवाओं सहित पूरा 5x DMEM (ईगल के संशोधित जरूरी मध्यम) तैयार करें. 20 मिलीलीटर पानी में DMEM पाउडर और 3 NaHCO की 0.925 जी की 3.37 ग्राम भंग. 0.22 सुक्ष्ममापी फिल्टर के माध्यम से पारित करके जीवाणुरहित. बाँझ 100x पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन और बाँझ गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम की 25 एमएल की 2.5 मिलीलीटर जोड़ें. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
  2. बर्फ पर, 800 μl मिश्रण, पूरा 5x DMEM के 600 μl और 1 एन NaOH के 17 μl कोलेजन मैं समाधान का (0.02 एन एसिटिक एसिड, फिल्टर निष्फल में 3.77 मिलीग्राम / एमएल). 3 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा के लिए बाँझ पानी के साथ पतला. मिश्रण में प्रासंगिक वृद्धि कारकों में शामिल हैं. हम आम तौर पर आंतों का एनसीसी प्रवास को प्रोत्साहित करने के लिए 10 एनजी / एमएल पर GDNF का उपयोग करें.
  3. 24 अच्छी तरह से थाली में एक ही पंक्ति का प्रत्येक कुएं में जमा लगभग 480 μl. बुलबुले से बचें. शेष पंक्तियों सेल प्रवास पर अन्य विकास कारकों के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  4. कोलेजन 37 डिग्री सेल्सियस पर एक बाँझ इनक्यूबेटर में कम से कम 1 घंटा भाजन दो.

2. पशु 16 के विच्छेदन

  1. Matings की स्थापना की और अगली सुबह योनि प्लग के लिए जाँच करें. दिन E0.5, योनि प्लग पाया जाता है दिन दोपहर की जा रही महिला को अलग करने और E12.5 तक 12 दिनों के इंतजार.
  2. Isoflurane के साथ गर्भवती चूहों anesthetize और सीओ 2 साँस लेना द्वारा euthanize.
  3. 70% इथेनॉल के साथ माउस स्प्रे. पेट की लिफ्टपरिजन और विदारक कैंची से पेट गुहा खुला.
  4. ठंडा पीबीएस (फॉस्फेट बफर खारा) से भरा एक गिलास पेट्री डिश में गर्भाशय निकालना. प्रत्येक भ्रूण आरोपण साइट को अलग करने transversely व्यक्ति deciduum सूजन के बीच गर्भाशय काटें.
  5. ठंडा पीबीएस से भरा एक गिलास पेट्री डिश में अलग से प्रत्येक आरोपण साइट पर काम करते हैं. एक विदारक खुर्दबीन के नीचे, गर्भाशय की मांसपेशियों की परत को हटाने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करें.
  6. भ्रूण प्रकट करने के लिए आंत की जर्दी थैली और भ्रूणावरण खोलें. वे विकासशील आंतों के साथ intertwined रहे हैं, नाल / आंत की जर्दी थैली को भ्रूण में शामिल होने के लिए रक्त वाहिकाओं विच्छेद जब ख्याल रखना.
  7. गर्दन पर भ्रूण का सिर तोड़.
  8. बस गहरे लाल रंग का जिगर ऊपर, एक भ्रूण के उदर गुहा में एक बंद संदंश डालें और पेट गुहा में एक आड़ा उद्घाटन करने के लिए (दबाव लागू रोक) के ही संदंश खोलते हैं. की ओर खोला संदंश नीचे खींचपूरी तरह से पेट खोलने के लिए भ्रूण के पीछे अंत.
  9. जिगर के पीछे संयोजी ऊतक को पकड़ो और (पेट के गुदा से जुड़ा हुआ है) आंतों को तोड़ने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा है, पेट के बाहर हिम्मत खींच.
  10. भ्रूण के बाकी हिस्सों से हिम्मत मुक्त करने के लिए पेट के कट. कटौती पेट के साथ किसी भी स्थान पर बनाया जा सकता है. बाद के लिए पूंछ भाग सुरक्षित रखते हैं.
  11. अंधान्त्र से संयोजी ऊतक, आंतों की तो बाकी बाहर चिढ़ाओ. जबकि ऐसा करने से आंतों में घाव के प्रति सावधान रहें.
  12. कुछ मौजूद हैं जिगर और पेट (छोटी आंत की विजय - स्तम्भ अंत पर), साथ ही mesonephros और जननांग लकीरें दूर कटौती.
  13. छोटी आंत अलग. फिर, आंत चुटकी के प्रति सावधान रहें. अब से, पेट के ऊतकों की rosrrocaudal अभिविन्यास विजय - स्तम्भ अंत पर उपस्थित तेज वक्रता का उपयोग कर लगाया जा सकता है. उन्हें पहले संभव के रूप में कम एक समय के लिए कमरे के तापमान पर पीबीएस में छोटी आंत छोड़ दोबिस्तर (3.3 कदम देखें).
  14. अंत में, सही भ्रूण के विकास के चरण का निर्धारण करने के लिए प्रत्येक भ्रूण के लिए पूंछ somites की संख्या दर्ज करते हैं.

3. भ्रूण आंतों के सेक्शनिंग

  1. भ्रूण dissections के साथ आगे बढ़ने से पहले, 100 मिलीलीटर पीबीएस (फॉस्फेट बफर खारा) में 1.5 जी agarose पिघल और 50 डिग्री सेल्सियस पर रखना
  2. डालो एक एम्बेडिंग मोल्ड में agarose पिघल (जैसे एक के बारे में 1/4 ट्यूब दीवार के उत्पाद शुल्क के लिए लंबाई में कटौती की गई है कि 2 एमएल microcentrifuge ट्यूब बंद). Agarose लगभग 42-45 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने, उसे छूने के लिए केवल थोड़ा गर्म होना चाहिए.
  3. बस agarose solidifies से पहले भ्रूण आंत शामिल करें (इस संदंश सुझावों के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है और चारों ओर 36-38 डिग्री सेल्सियस घटित होगा). मुड़ा हुआ विजय - स्तम्भ अंत तक संदंश के साथ आंत होल्डिंग, मिट्टी की लंबाई के साथ agarose के माध्यम से बहुत धीरे धीरे यह पुल. यह सीधे agarose सेट जबकि पेट रखने में मदद करता है. टी रिलीजजैसे ही यह ले जाया जा रहा विरोध करने के लिए शुरू होता है के रूप में जारी. पेट का व्याख्यान चबूतरे वाला दुम अभिविन्यास का ध्यान रखें.
  4. Agarose पूरी तरह स्थापित किया है सुनिश्चित करने के लिए, एक फ्रिज 2-3 मिनट में ढालना रखो.
  5. (खोला Eppendorf ट्यूब से बाहर फिसलने से) मोल्ड से agarose बाहर ले जाओ. एक ब्लेड के साथ, आंत सीधा करने के लिए कटौती करने, दोनों सिरों पर अतिरिक्त agarose बाहर ले.
  6. हिल ब्लेड के साथ एक सूक्ष्म की धातु मंच पर नीचे ब्लॉक agarose आंत / की विजय - स्तम्भ अंत गोंद. आंत / agarose ब्लॉक के किनारों पर अतिरिक्त agarose ट्रिम.
  7. हिल सूक्ष्म चैम्बर पर धातु चरण माउंट. यदि आवश्यक हो, तो आंत (इसलिए ब्लेड सीधा करने के लिए) के रूप में संभव के रूप में खड़ी है मंच के कोण समायोजित करें. ठंडा पीबीएस के साथ नमूना कवर. बफर सतह के नीचे कुछ मिलीमीटर तक नीचे सूक्ष्म ब्लेड लाओ.
  8. कि ई सुनिश्चित करने, दुम सबसे छोटी आंत के 200 माइक्रोन vibratome अनुप्रस्थ कटौती करेंACH agarose टुकड़ा एक पूर्ण आंतों खंड शामिल हैं.

4. आंतों explants की संस्कृति

  1. धीरे अच्छी तरह से प्रत्येक के मध्य की ओर से एक टुकड़ा डाल, संदंश के साथ कोलेजन जैल पर ताजा कटौती आंत / agarose स्लाइस फ्लैट जमा.
  2. Explant के बाहर एनसीसी के प्रवास अनुमति देने के लिए, एक नम 5% सीओ 2 के माहौल में, 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों सेते हैं.
  3. संदंश के साथ बहुत धीरे कोलेजन जेल बंद आंत / agarose स्लाइस लें. नीचे जेल को नुकसान नहीं ख्याल रखना.
  4. सेल प्रवास पैटर्न परेशान नहीं है कि यह सुनिश्चित करने के क्रम में बाद में ऊष्मायन और धोने चरणों के दौरान सीधे कोलेजन जेल को छूने से बचें. कमरे के तापमान पर अच्छी तरह से 1 घंटा प्रति (पीबीएस) में 4% पीएफए ​​(paraformaldehyde) के 500 μl के साथ ठीक करें.
  5. अच्छी तरह से प्रति DAPI के 500 μl (4 ',6-diamidino-2-phenylindole) समाधान (पीबीएस में 5 ग्राम / एमएल) के साथ लगानेवाला बदलें और कमरे के तापमान पर 10 मिनट सेते हैं.
  6. अच्छी तरह से 3x प्रत्येक धोने5 मिनट के लिए पीबीएस के 500 μl के साथ.
  7. प्रत्येक अच्छी तरह से भीतर कोलेजन जेल में एम्बेडेड फ्लोरोसेंट कोशिकाओं (GFP और DAPI चैनल) तस्वीर.

5. छवि विश्लेषण

हम explant संस्कृति के बाद उत्पन्न छवियों की प्रक्रिया और यों तो ImageJ 17 का व्यापक उपयोग किया.

  1. फ्लोरोसेंट सेल तस्वीरों के रूप में एक ही बढ़ाई पर एक माइक्रोमीटर स्लाइड इमेजिंग द्वारा शुरू करो. (सीधी रेखा उपकरण का उपयोग) पिक्सल में एक माइक्रोन की लंबाई को मापने.
  2. (/ सेट स्केल विश्लेषण; पिक्सल / माइक्रोन के इनपुट संख्या) पैमाने पर सेट.
  3. प्रत्येक GFP प्रतिदीप्ति तस्वीर के लिए, 8 बिट स्केल (Image/Type/8-bit) करने के लिए छवि प्रारूप बदल जाते हैं.
  4. संकेत (छवि समायोजित / / चमक / विपरीत) की तीव्रता को समायोजित.
  5. आवश्यक (प्रक्रिया / पृष्ठभूमि घटाना; रोलिंग गेंद त्रिज्या समायोजित) यदि पृष्ठभूमि शोर घटाना.
  6. कोशिकाओं और सेल clumps (छवि / / दहलीज समायोजित), उजागर करने के लिए एक सीमा निर्धारितn clumps (प्रक्रिया / द्विआधारी / वाटरशेड) विभाजित करने के लिए एक जल लागू होते हैं.
  7. ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र निर्दिष्ट और सेल नंबर आँकड़े उत्पन्न करने के लिए कणों का विश्लेषण (कण विश्लेषण / विश्लेषण, सेट आकार न्यूनतम शेष पिक्सल बाहर करने के लिए).
  8. Feret व्यास (/ सेट माप विश्लेषण) शामिल करने के लिए माप विकल्प सेट करें.
  9. समूह ROIs और Feret व्यास निर्धारित करने के लिए एक पूरे के रूप में मापने, सेल प्रसार का एक संकेत (/ उपकरण / आरओआई प्रबंधक / अतिरिक्त / या फिर आरओआई प्रबंधक / जोड़ें, और आरओआई प्रबंधक / उपाय विश्लेषण).

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Representative Results

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निम्नलिखित परिणाम (चित्रा 1) यहाँ वर्णित तकनीक के साथ प्राप्त किया जा सकता है की प्रतिनिधि हैं. वृद्धि कारकों (यानी GDNF) का उपयोग GFP-व्यक्त आंतों explant के बाहर और कोलेजन जेल में आंतों का एनसीसी (चित्रा 2) के प्रवास को उत्तेजित करता है. कुछ कोशिकाओं की वृद्धि कारकों के अभाव में explant से बाहर आते हैं, इनमें से ज्यादातर GFP लेबल नहीं कर रहे हैं और निष्क्रिय प्रविष्टि का प्रतिनिधित्व करते हैं. यह इस ऊतक अभी भी भारी फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की आबादी है और अन्यथा नीचे कोलेजन में पड़ी कोशिकाओं छुपा होता है, के रूप में परिणाम रिकॉर्ड करने के क्रम में कोलेजन जेल से आंतों टुकड़ा दूर करने के लिए आवश्यक है. इन परिणामों की मात्रा GDNF मौजूद है जब बहुत से अधिक कोशिकाओं कोलेजन जेल के भीतर पाए जाते हैं कि पता चलता है, और है कि सक्रिय माइग्रेशन (चित्रा 3) जगह लेता है. दरअसल, निष्क्रिय कोशिकाओं को एक आंतों टुकड़ा के व्यास के भीतर, wher, तुरंत explants के नीचे पाया जाता सक्रिय रूप से कोलेजन जेल पर आक्रमण कि ईएएस कोशिकाओं दूर मूल की उनकी बात से कदम है और आगे फैल गया.

चित्रा 1
चित्रा 1. Explant संस्कृति तकनीक. ए) 200 μ मोटी explants बनाने के लिए इस्तेमाल दुम छोटी आंत क्षेत्र के भीतर फ्लोरोसेंट आंतों का एनसीसी की वर्दी आबादी का अवलोकन. स्केल बार:. 200 माइक्रोन बी) कोलेजन युक्त संस्कृति के माध्यम से 24 अच्छी तरह प्लेटें में जमा है और 1 घंटे के लिए कड़ा करने के लिए छोड़ दिया है. Agarose एम्बेडेड भ्रूण आंतों की Vibratome स्लाइस जैल (अच्छी तरह से प्रति एक टुकड़ा) पर जमा कर रहे हैं, और फ्लोरोसेंट आंतों का एनसीसी 3 दिनों के लिए explants से बाहर पलायन करने की अनुमति है. स्लाइस तो कोलेजन जैल आक्रमण किया कि कोशिकाओं इमेजिंग से पहले बंद रखा जाता है.s/ftp_upload/50709/50709fig1highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. 10 एनजी / एमएल GDNF की अनुपस्थिति या उपस्थिति में 3 दिन ऊष्मायन के दौरान एक पेट explant के बाहर चले गए हैं. प्रकोष्ठों आंतों explant के बाहर और कोलेजन जेल के भीतर सेल प्रवास, तय DAPI (नीला) के साथ दाग और के लिए फोटो खिंचवाने गया GFP लेबल आंतों का एनसीसी (हरा) दिखा. 70x बढ़ाई. स्केल पट्टी: 100 माइक्रोन. बिंदीदार रेखा लगभग आकार और यह जेल में बंद कर लिया था इससे पहले explant के स्थान का प्रतिनिधित्व करता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें. घंटे क्लिक करेंबड़ी छवि को देखने के लिए अरे.

चित्रा 3
चित्रा 3. 3 दिनों के बाद आंतों explants के बाहर पलायन GFP-व्यक्त कोशिकाओं की आंतों का एनसीसी प्रवास संभावित की मात्रा. संख्या और प्रसार (Feret व्यास) ImageJ सॉफ्टवेयर 17 का उपयोग मात्रा था. दोनों ही मामलों में, वहाँ अनुपचारित और GDNF इलाज की स्थिति के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर एक छात्र टी परीक्षण के अनुसार है (पी 0.001 <; *). आंतों स्लाइस (बिंदीदार काला लाइन: 260 माइक्रोन) का औसत व्यास निष्क्रिय प्रवेश और सक्रिय माइग्रेशन के बीच भेद करने के लिए शामिल किया गया था. NT: गैर इलाज, एन. संसाधित explants की संख्या बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

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हम अपने पूर्व vivo explant संस्कृति तकनीक ठीक GDNF की उपस्थिति में आंतों का एनसीसी प्रवास संभावित यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कैसे दिखा. इस तरह की सटीक मात्रा का ठहराव बहुत पहले से 11,12,15 वर्णित के रूप में, 200 माइक्रोन मोटी vibratome पेट वर्गों का उपयोग कर के बजाय लगभग आकार के बड़े टुकड़े से मदद की है. दरअसल, यह हमारे लिए एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य सेटिंग में कोशिकाओं का एक उचित संख्या के साथ काम करने के लिए अनुमति देता है. ध्यान से, explant स्लाइस काट रहे हैं जिसमें से छोटी आंत की दुम का सबसे क्षेत्र के भीतर फ्लोरोसेंट आंतों का एनसीसी की वर्दी वितरण भी एक ही आंत (चित्रा 1 ए) की ओर से अनेक वर्गों के विश्लेषण की अनुमति देता है. इसके अलावा, आंतों का एनसीसी और axons दोनों संस्कृति की अवधि के अंत में इस तरह के assays 11, explants की वापसी में ऊतक बाहर कर सकते हैं हमें प्रवासी एनसीसी पर विशेष रूप से ध्यान केंद्रित करने की सुविधा देता है कि दिया.

सबसे महत्वपूर्ण कदम है लेकिन w के रूप में, प्रोटोकॉल पाठ में रेखांकित किया गयाआंतों explant के elfare स्वस्थ पलायन एनसीसी, विशेष रूप से ध्यान रखा जाना चाहिए प्राप्त करने के लिए सर्वोपरि है. आंत agarose (3.3 कदम) में अंतर्निहित है, खासकर जब अचानक तापमान में परिवर्तन करने के लिए भ्रूण के ऊतकों को subjecting बचें. आंत ऊतक "खाना पकाने" से बचने के लिए संभव (अभी तक अभी भी पिघल) के रूप में के रूप में शांत कमरे के तापमान और agarose पर है सुनिश्चित करें. आंतों explant अक्सर आकार में बढ़ रही है और agarose टुकड़ा से बाहर spilling, संस्कृति के माध्यम से भरे कोलेजन जेल पर पनपे चाहिए. Explant अस्वस्थ या बदतर दिखाई देता है,, ऊष्मायन के दौरान नष्ट हो विच्छेदन के दौरान इसे बनाए रखने में मदद करने के लिए (जैसे HEPES बफर M2 या DMEM 10% FBS के साथ पूरक) कमरे के तापमान पर संस्कृति मीडिया के साथ पीबीएस जगह प्रयास करने के लिए जाता है.

हमारे दृष्टिकोण के लिए एक प्रमुख सीमा यह एनसीसी की ओर पलायन करने के लिए एक फ्लोरोसेंट लेबल प्रदान करने के लिए एक माउस लाइन की उपलब्धता पर निर्भर करता है. इस तरह के एक संसाधन के अभाव में, एम के खिलाफ एक एंटीबॉडीएनसीसी igrating (जैसे विरोधी रीटेल या विरोधी Sox10) कोलेजन जेल पर हमला किया कि कोशिकाओं लेबल इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, यह इन विट्रो परख के साथ प्राप्त परिणामों पूरी तरह विवो में आंतों का एनसीसी के व्यवहार को प्रतिबिंबित नहीं हो सकता है, पेट सूक्ष्म वातावरण कहीं अधिक जटिल एक सरल कोलेजन जेल से दी है कि. जीना सेल इमेजिंग से जुड़े अतिरिक्त प्रयोगों इस व्यवहार का आकलन करने के लिए सिफारिश कर रहे हैं. यह एक chemoattractant के रूप में अपनी भूमिका के अलावा, GDNF आंतों का एनसीसी 4 पलायन के प्रसार को बढ़ावा देने के लिए जाना जाता है कि यह भी उल्लेखनीय है. GDNF की उपस्थिति में आंतों का एनसीसी प्रवास संभावित की हमारी उपाय इस प्रकार शायद आंतों की एनसीसी उपनिवेशन के लिए अग्रणी में विवो तंत्र के सदृश सच सेल प्रवास और सेल प्रसार का एक मिश्रण है. इन दो प्रक्रियाओं के बीच एक स्पष्ट अंतर वांछित है, संस्कृति मीडिया में एक सेल चक्र अवरोधक (जैसे AZD 5438 18) के अलावा सेल migratio के लिए विश्लेषण सीमित कर सकते हैंएन.

इस तकनीक को विभिन्न अन्य बाह्य ligands के साथ ही विशिष्ट संकेत दे रास्ते के inhibitors, और उसमें किसी भी संयोजन का परीक्षण करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है. अन्य ऊतकों भी संभावित विच्छेदित और कई भ्रूण संरचनाओं में एनसीसी प्रवास के अध्ययन की अनुमति, sectioned किया जा सकता है. उपन्यास और / या एनसीसी विकास में संभव दोषों के साथ uncharacterized उत्परिवर्ती माउस उपभेदों के साथ संयुक्त, हमारी तकनीक जल्दी से विशिष्ट संकेत घटनाओं के जवाब में प्रवास व्यवहार में कमी के लिए स्क्रीन करने के लिए लागू किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम इमेज प्रोसेसिंग और विश्लेषण सलाह के लिए डेनिस Flipo धन्यवाद, और डेविड डब्ल्यू Silversides जिसका प्रयोगशाला में Gata4p [5kb]-GFP माउस लाइन उत्पन्न किया गया था. Pilon प्रयोगशाला में रिसर्च CIHR, NSERC, FRQS और FRQNT द्वारा वित्त पोषित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM powder Wisent 219-010-XK  
NaHCO3 Bioshop SOB999 Biotechnology grade
Steriflip vacuum filtration system (0.22 micron) EMD Millipore SCGP00525  
Penicilin-Streptomycin solution, 100x Wisent 450-201-EL  
Fetal bovine serum Wisent 095-150 High quality grade
Collagen I BD biosciences 354236  
NaOH Bioshop SHY700 Diluted from 10 N stock then sterile-filtered
GDNF Cedarlane CLCYT305  
Falcon 24-well Plate BD biosciences 353047  
Dissecting scissors Fisher Scientific 089515  
Glass Petri dish VWR 89000-306  
PBS Sigma P5493 Cell culture grade
Dissecting microscope Leica M125  
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-20  
Agarose Bioshop AGA001 Biotechnology grade
Surgical blade Feather 21  
All Purpose Instant Krazy Glue Pen Krazy Glue KG824  
HM 650V Vibrating-Blade Microtome Thermo Scientific 920110  
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148  
DAPI Sigma-Aldrich D9564  

Table of specific reagents and equipment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Murine आंत्र तंत्रिका progenitors के लिए एक मात्रात्मक सेल प्रवासन परख
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Bergeron, K. F., Cardinal, T., Pilon, N. A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors. J. Vis. Exp. (79), e50709, doi:10.3791/50709 (2013).More

Bergeron, K. F., Cardinal, T., Pilon, N. A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors. J. Vis. Exp. (79), e50709, doi:10.3791/50709 (2013).

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