Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Kemirgen Enterik Sinir progenitörlerin için Kantitatif Hücre Göç Tahlili

doi: 10.3791/50709 Published: September 18, 2013

Summary

Çeşitli büyüme faktörlerinin varlığında enterik nöral tepe hücre göçü potansiyelinin hassas miktar tayinine izin veren bir ex vivo hücre göçü deneyi mevcut.

Abstract

Nöral krest hücreleri (KKK) dorsal nöral tüp kaynaklanan ve gelişmekte olan omurgalı embriyo boyunca yoğun göç geçici ve multipotent hücre popülasyonu vardır. Çevresel glia ve nöronlar sağlamanın yanı sıra, NCC melanositler gibi kranyo-yüz iskeletinin en üretir. NCC göç ve farklılaşma nöral tüp ve bölgesel olarak farklı hücre dışı uyaranlara maruz kaldıkları boyunca eksenel kökenli bir kombinasyonu ile kontrol edilmektedir. Hücre dışı ligandlar Bu katkı enterik sinir sistemi (ENS), karmaşık bağlantılı (diğer şeyler arasında) lokal olarak kontrol nöral ganglia ağı bağırsak, kas hareketi ve intestinal motilite oluşumu sırasında, özellikle belirgindir. Kaudal moda bir rostral - - müstakbel bağırsak tüm uzunluğu ENS çoğu kolonize etmek için uzun bir yolculuğa üstlenmek KKK başlangıçtaki küçük bir havuz türetilmiştir. Bilinen çeşitli sinyal yolları arasında,enterik KKK kolonizasyonu etkileyen, GDNF / RET sinyal en önemli olarak kabul edilmektedir. Nitekim, bağırsak mezenşimin tarafından RET ligand GDNF'nin spatiotemporally kontrollü salgılanması embriyonik gut ve içinde cazibe ve RET-ifade enterik KKK rehberlik için başlıca sorumludur. Burada, GDNF gibi çeşitli büyüme faktörlerinin varlığında enterik NCC göç potansiyeli hassas miktar tayinine izin veren, floresanla işaretlenmiş NCC, sahip olan bir transgenik fare hattı yararlanarak, bir ex vivo hücre göçü deneyi tarif eder.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Nöral tepe hücreleri (NCC) embriyo gelişim boyunca bir çok omurgalı türevler meydana özgü bir geçici hücre türüdür. Bu hücre popülasyonu nöral olmayan ektoderm 1 bitişik sinirsel levha, sınırında ortaya çıkar. Nörülasyon sırasında oluşturan nöral tüpün dorsal kenarı boyunca nöral plak yerlerden KKK arasında eğilme. KKK sonra ayrılması ve uzak nöral tüp göç, epitel-mezenkimal geçiş tabi. KKK onlar tüm enterik sinir sistemi (ENS) oluşturmak sindirim sistemi, bağırsak duvarında gömülü nöral ganglionlarda birbirine bağlı bir ağ dahil olmak üzere çeşitli embriyonik yapılar, kolonize. Geçenlerde 2,3 gözden gibi, birçok genin bu karmaşık yapının geliştirilmesi dahil edilmiştir.

ENS çoğu (yani müstakbel Beyin / omurilik sınırındaki civarında) vagal nöral tüp KKK menşeli küçük bir havuz türetilmiştir 4.Bunlar sinir atalarıdır farelerde embriyonik gün (E) 9.0 etrafında foregut ulaşmak ve yaklaşık e15.0 tüm embriyonik bağırsakları kolonize kadar sonra bağırsak mezenşimin içinde caudally göç. Kolon sinir progenitörlerinin Küçük bir alt kümesi, aynı zamanda yukarı çekum 4 ters yönde arka bağırsak işgal sakral NCC, tarafından sağlanır. Vagal ve sakral Hem NCC gerektiren birden fazla göç-çoğalma-, ENS tam oluşmasını sağlamak için hayatta kalma ve farklılaşma-teşvik ipuçları. Bu bağlamda, hayvan modelleri, - özellikle de genetik olarak modifiye edilmiş farenin - birkaç temel hücre dışı ligandların belirlenmesi vesile olmuştur: GDNF (gliyal hücre-türevi nörotropik faktör), endotelin-3, nörotrofin-3, BMP (kemik morfojenik proteinler), netrin , hem de sonik ve Hint Hedgehog (Shh ve Ihh) 5-10. Bunlardan, (transfeksiyon sırasında Rearranged) transmembran reseptör tirozin kinaz yoluyla sinyal RET GDNF inci olarak kabul edilmektedirembriyonik gut ve içinde cazibe ve KKK rehberlik e en kritik yolu. GDNF bağırsak mezenşimin tarafından salgılanan ve RET 11,12 ifade enterik KKK, doğrudan kemoatraktif bir spatiotemporally kontrollü rosrrocaudal degrade oluşturur.

Diğer fonksiyonlar arasında, ENS bağırsak duvarında düz kas ile etkileşim yoluyla sindirim sistemi içinde hareketini düzenler. Hirschsprung hastalığında bağırsak sonuçların terminal bölgesinde nöral ganglia olmaması: etkilenen segmentin tonik kasılma tıkanması, sindirilmiş madde birikimi ve üst bağırsak ve karın büyük bir şişkinlik yol açar. Hirschsprung hastalığı yaklaşık 5,000 canlı doğumda oluşur. Enterik KKK rostro-kaudal göç desen Hirschsprung hastalığının etiyolojisinde ana bir faktör olduğuna inanılmaktadır. KKK ve b son bölümünü göç kaynağından kolon, uzakkolonize edilmesi Owel, ENS oluşumunda hatalarına karşı en hassas olduğunu. Enterik NCC göç onun önemli rol ile uygun olarak, GDNF / RET sinyal bozulması Hirschsprung hastalığı 13'ün ana bilinen genetik bir nedenidir.

[5kb]-GFP 14 Gata4p adında - - Göçmen KKK Yeşil Floresan Protein (GFP) ile etiketli olduğu daha iyi KKK ve ENS gelişimini incelemek için, biz bir transgenik fare hattı oluşturulur. Gelecek artık, GDNF gibi çeşitli büyüme faktörlerinin varlığında enterik NCC göç potansiyeli hassas miktar tayinine izin veren diğer gruplara 11,12,15 tarafından yayınlanmış çalışmadan adapte edilen bir ex vivo hücre göçü deneyi, mükemmel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Etik beyanı

Fareleri içeren deneyleri tıbbi araştırmalarda kullanılan hayvanların bakım ve manipülasyon için Hayvan Bakım kurallar Kanada Konseyi takip yapıldı. Hayvanların manipülasyon içeren protokolleri Montreal Quebec Üniversitesi'nden kurumsal etik komitesi tarafından onaylandı (Comite Institutionnel de Koruma des Animaux; referans numarası 0512-R3-650-0513).

1.. Kollajen Jeller hazırlanması

Bir doku kültürü kaputu altında, steril bir şekilde çalışır.

  1. Standart antibiyotik dahil tam 5x DMEM'yi (Eagle modifiye temel orta) hazırlayın. 20 ml su içinde DMEM tozu ve NaHCO 3 0,925 g 3.37 g çözülür. 0.22 um'lik bir filtreden geçirilerek sterilize edin. Steril 100x penisilin / streptomisin ve steril ısıyla etkisiz hale getirilen fetal sığır serumu, 25 ml 2.5 ml ekle. 4 ° C'de saklayın
  2. Buz, 800 ul mix, tam 5x 600 ul DMEM ve 1 N NaOH 17 ul Kollajen I çözeltisi (0.02 N, asetik asit, filtre ile sterilize edilmiş olarak 3,77 mg / ml). 3 ml'lik bir son hacme kadar steril su ile seyreltilir. Karışımı ilgili büyüme faktörlerini içerir. Genellikle bağırsak hareketini uyarıcı etki gösterir NCC için 10 ng / ml 'de GDNF kullanın.
  3. , 24 oyuklu bir plaka içerisinde tek bir sıra her çukuruna Deposit yaklaşık 480 ul. Kabarcıkları kaçının. Geri kalan satırlar hücre göçü ile ilgili diğer büyüme faktörlerinin etkisini test etmek için de kullanılabilir.
  4. Kollajen 37 ° C'de steril bir kuluçka makinesi içinde en az 1 saat süreyle polimerize olsun

2. Hayvanlar 16 diseksiyonu

  1. Çiftleşmesi kurmak ve ertesi sabah vajinal fişleri kontrol edin. Gün E0.5, vajinal fiş bulunan gününde öğlen olmak kadın yalıtmak ve E12.5 kadar 12 gün bekleyin.
  2. Izofluran ile hamile fareler anestezi ve CO 2 inhalasyon yoluyla euthanize.
  3. % 70 etanol ile fare püskürtün. Karın s kaldırınkin ve diseksiyon makas ile karın boşluğu açmak.
  4. Buz soğukluğunda PBS (fosfat-tamponlu tuzlu su) ile doldurulmuş, cam bir Petri kabı içine rahim çıkarın. Her bir embriyo implantasyonu sitesi izole etmek için tek tek enine biçimde deciduum şişlikler arasındaki rahim kesin.
  5. Buz gibi soğuk PBS ile dolu bir cam petri ayrı ayrı her bir implantasyon sitede çalışın. Bir mikroskop altında, rahim kas tabakası kaldırmak için ince forseps kullanır.
  6. Embriyo ortaya çıkarmak için visseral sarısı kesesi ve amniyon açın. Onlar gelişen bağırsak ile iç içe olarak, plasenta / visseral yumurta sarısının için embriyo katılarak kan damarlarını severing dikkatli olun.
  7. Boyunda embriyonun başını Sever.
  8. Sadece koyu kırmızı renkli karaciğer üzerinde, bir embriyonun karın boşluğunda kapalı forseps yerleştirin ve karın boşluğunda bir çapraz açılış yapmak için (basınç uygulayarak durdurmak) kendisi forseps açalım. Doğru açılan forseps aşağı çekintamamen karın açmak için embriyonun arka ucu.
  9. Karaciğer arkasında bağ dokusu tut ve (kolon anüs bağlı) bağırsakları kırmak için dikkatli olmak, karın dışarı cesareti çekin.
  10. Embriyonun geri kalanından bağırsaklar serbest bırakmak için kolon kesin. Kesilen kolon boyunca herhangi bir yerde yapılabilir. Sonrası için kuyruk kısmını rezerv.
  11. Çekum bağ dokusu, bağırsakların daha sonra kalanını didiklemek. Bunu yaparken bağırsakları yara için dikkatli olun.
  12. Bazı mevcut ise karaciğer ve mide (ince bağırsağın rostral ucunda), hem de mesonephros ve genital sırtlar kesip.
  13. Ince bağırsak izole. Yine, bağırsak nip için dikkatli olun. Şu andan itibaren, bağırsak dokusunun rosrrocaudal oryantasyon rostral ucunda bulunan keskin eğrilik kullanılarak izlenebilir. EM önce mümkün olduğu kadar kısa bir süre boyunca, oda sıcaklığında PBS içinde küçük bağırsak bırakyatak (adım 3.3).
  14. Son olarak, doğru embriyonik gelişim evresini belirlemek için her bir embriyo için kuyruk Somitlerin sayısını kaydedin.

3. Embriyonik Bağırsaklar Kesit

  1. Embriyo diseksiyonlar ile devam etmeden önce, 100 ml PBS (fosfat-tamponlu tuzlu su) içinde 1.5 g agarozun eritilmesi ve 50 ° C'de tutmak
  2. Akma bir gömme kalıba eritilmiş agaroz (örneğin, yaklaşık 1/4 boru duvarının çıkarılması için uzunlamasına kesilmiş olan 2 ml mikrosantrifüj tüpü kapalı). Agaroz yaklaşık 42-45 ° C'ye kadar soğumasını bekleyin, o dokunmak için sadece biraz ılık olmalıdır.
  3. Sadece agaroz katılaşır önce embriyonik bağırsak Embed (bu forseps ipuçları ile değerlendirilebilir ve çevresinde 36-38 ° C meydana gelecektir). Katlanmış rostral sonunda forseps ile bağırsak tutarak, kalıbın uzunluğu boyunca agaroz boyunca çok yavaş çekin. Bu, düz agaroz setleri ise gut tutmaya yardımcı olur. T bırakınkısa sürede taşınıyor karşı başlar yayınlayacak. Bağırsak rostral-kaudal yönde takip edin.
  4. Agaroz tamamen belirledi sağlamak için, buzdolabı 2-3 dakika içinde kalıp koyun.
  5. (Açılan Eppendorf tüp dışarı kaydırarak) kalıptan agaroz dışarı atın. Bir bıçak ile, bağırsak dik kesim yapma, her iki uçta aşırı agaroz çıkar.
  6. Titreşen bir bıçak ile bir mikrotom metal aşamasında aşağı bloke agaroz bağırsak / rostral ucunu Tutkal. Bağırsak / agaroz blok tarafında aşırı agaroz Trim.
  7. Titreşimli mikrotom odasının metal sahne monte edin. Gerekirse, bu nedenle bağırsak (bu nedenle bıçak dik) mümkün olduğu kadar dik olan sahne açısını ayarlamak. Buz soğukluğunda PBS ile örnek örtün. Tampon yüzeyine altında birkaç milimetre aşağı mikrotom bıçak getir.
  8. Bu e sağlanması, kuyruk-en ince bağırsağın 200 mikron vibratome enine kesim yapmakach agaroz dilim tam bağırsak bölüm içerir.

4. Bağırsak eksplant kültürü

  1. Yavaşça de her ortalarına doğru bir dilim yerleştirerek, forseps ile kollajen jeller üzerine taze kesilmiş bağırsak / agaroz dilimleri düz yatırmak.
  2. Eksplant üzerinden KKK göçünü sağlamak için, nemli bir% 5 CO2 atmosferinde, 37 ° C'de 3 gün inkübe edilir.
  3. Forseps ile çok nazikçe kollajen jel kapalı bağırsak / agaroz dilimleri alın. Aşağıdaki jel zarar vermemeye özen gösterin.
  4. Hücre göçü, model rahatsız emin olmak amacıyla daha sonra inkübasyon ve yıkama adımları sırasında doğrudan kolajen jel dokunmaktan kaçının. Oda sıcaklığında da 1 saat başına (PBS)% 4 PFA (paraformaldehid) 500 ul ile düzeltildi.
  5. Çukur başına 500 ul DAPI (4 ',6-diamidino-2-fenilindol) çözeltisi (PBS içerisinde 5 ug / ml) ile fiksatif yerine ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir.
  6. Iyi 3x her yıkayın5 dakika boyunca 500 ul PBS ile.
  7. Her bir içindeki kolajen jel içine gömülü floresan hücreleri (GFP ve DAPI kanalı) Fotoğraf.

5. Görüntü Analizi

Biz eksplant kültürü sonra oluşturulan görüntüleri işlemek ve ölçmek için ImageJ 17 geniş kullanımı yaptı.

  1. Floresan hücre fotoğraf gibi aynı büyütmede bir mikrometre slayt görüntüleme başlayın. (Düz Çizgi aracını kullanarak) piksel bir mikron uzunluğunu ölçün.
  2. (/ Set Ölçeği Analiz; piksel / mikron giriş numarası) ölçeği ayarlayın.
  3. Her GFP floresan fotoğraf için, 8-bit gri tonlama (Image/Type/8-bit) için görüntü formatını değiştirin.
  4. Sinyal (Görüntü / Ayarı / Parlaklık / Kontrast) yoğunluğunu ayarlayın.
  5. Gerekli (Process / Arka Plan çıkarma; yuvarlanan topu yarıçapını ayarlamak) ise arka plan gürültü çıkarın.
  6. Hücreleri ve hücre kümeleri (Görüntü / / Eşik ayarlama), vurgulamak için bir eşik ayarlayınn kümeleri (Process / Binary / Havza) bölmek için bir dönüm geçerlidir.
  7. Ilgi (ROI) bölgeleri belirlemek ve hücre sayısı istatistikleri oluşturmak için parçacıklar Analiz (Parçacıklar Analiz / Analiz; set boyut minimum kalan piksel hariç).
  8. Feret çapı (/ Set Ölçümleri Analiz) dahil ölçüm seçenekleri ayarlayın.
  9. Grup ROI'ler ve Feret çapını belirlemek için bir bütün olarak ölçmek, hücre yayılması bir göstergesidir (/ Araçlar / ROI Manager / Diğer / VEYA, ardından ROI Müdürü Ekle / ve ROI Manager / Tedbir Analiz).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Aşağıdaki sonuçlar (Şekil 1) burada tarif edilen teknik ile elde edilebilir ne temsil etmektedir. Büyüme faktörleri (örneğin GDNF) kullanılması GFP-ifade eden intestinal eksplant dışarı ve kolajen jel içine enterik NCC (Şekil 2) göçünü teşvik eder. Bazı hücreler, büyüme faktörlerinin yokluğunda eksplant çıkması rağmen, bu çoğunlukla GFP-etiketli değildir ve pasif girişi temsil eder. Bu doku hala yoğun floresan hücreler tarafından doldurulur ve aksi altındaki kollajen yatan hücreleri gizlemek gibi, sonuçları kaydetmek için kollajen jel bağırsak dilim kaldırmak için gereklidir. Bu sonuçların GDNF miktarının mevcut olduğu zaman, çok daha fazla hücre kollajen jel içinde bulunan olduğunu göstermektedir ve bu aktif göç (Şekil 3) yer alır. Gerçekten de, hücreler, pasif bir bağırsak dilimin çapının içinde nereye hemen altında bulunan eksplantlar aktif kollajen jel işgal EAS hücreleri uzak geldikleri noktadan hareket ve daha fazla yayıldı.

Şekil 1
Şekil 1. Eksplant kültür tekniği. A) 200 μ kalınlığında eksplantlarının yapmak için kullanılan kuyruk ince bağırsak bölgede floresan enterik KKK Düzgün nüfus bakış. Ölçek çizgisi:. 200 um B) kolajen ihtiva eden kültür ortamı, 24 oyuklu plakalar içinde yatırılır ve 1 saat boyunca sertleşmeye bırakılmıştır. Agaroz yerleştirilen embriyonik bağırsak Vibratome dilim jeller (her bir dilim) üzerine yatırılır ve floresan enterik NCC 3 gün için eksplantlar dışarı göç izin verilir. Dilimler daha sonra kolajen jeller işgal görüntüleme hücreleri önce kapalı alınır.s/ftp_upload/50709/50709fig1highres.jpg "target =" _blank "> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.

Şekil 2,
Şekil 2. 10 ng / ml GDNF yokluğunda veya varlığında, 3 günlük inkübasyon sırasında bir bağırsak eksplant üzerinden geçirilir. Hücreler bağırsak eksplant dışında ve kollajen jel içinde hücre göçü, sabit DAPI (mavi) ile boyanmış ve fotoğraflanmıştır GFP etiketli enterik KKK (yeşil) gösterebilir. 70X büyütme. Ölçek çubuğu: 100 mikron. Noktalı çizgi yaklaşık boyutunu ve jel çıkarılmadan önce eksplantın konumunu temsil eder. büyük rakam görmek için buraya tıklayın. h tıklayınDaha büyük resmi görmek için ere.

Şekil 3,
Şekil 3,. 3 gün sonra, eksplantlardan bağırsak üzerinden göç GFP-ifade eden hücrelerin enterik NCC göç potansiyeli miktarının belirlenmesi. Sayısı ve dağılımı (Feret çapı) 17 ImageJ yazılımı kullanılarak hesaplandı. Her iki durumda da, orada muamele edilmemiş ve GDNF-muamele koşulları arasında önemli bir fark, bir Student t-testine göre bir (p <0.001, *). Bağırsak dilimleri (noktalı siyah çizgi: 260 mikron) ve ortalama çapı pasif girişi ve aktif göç ayırt dahil edildi. Nt: non-muamele, n:. Işlenmiş eksplantlarının sayısı büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Biz ex vivo eksplant kültürü tekniği tam GDNF mevcudiyetinde enterik NCC göç potansiyeli ölçmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Bu tür kesin miktar büyük ölçüde daha önce tarif edildiği gibi 11,12,15, 200 mikron kalınlığında bir vibratome bağırsak bölümleri kullanılarak yerine yaklaşık boyutu büyük parça tarafından kolaylaştırılır. Gerçekten de, bu bizi son derece tekrarlanabilir bir ortamda hücrelerin makul bir sayı ile çalışmak için izin verir. Not, eksplant dilimleri kesildiği ince bağırsağın kaudal en bölge içinde floresan enterik KKK homojen dağılımı da tek bağırsak (Şekil 1A) birden fazla bölme analiz sağlar. Ayrıca, enterik NCC ve akson hem de kültür periyodunun sonunda, bu tür deneylerde 11, eksplant çekilmesinde doku çıkabilir us göç NCC sadece odak olanak sağlayan verilmedi.

En kritik adımlar ancak w gibi, protokol metninde belirtilen edildibağırsak eksplantın elfare sağlıklı göç KKK, özellikle dikkatli olunmalıdır elde etmek için her şeyden önemlidir. Bağırsak agaroz (3.3 adım) gömülü olduğu, özellikle ani sıcaklık değişimlerine embriyonik dokular maruz kaçının. Bağırsak dokusu "pişirme" önlemek mümkündür (henüz hala erimiş) gibi serin oda sıcaklığında ve agaroz az olduğundan emin olun. Intestinal eksplant genellikle boyut olarak artar ve agaroz dilim üzerinden dökülüp, kültür ortamı doldurulmuş kollajen jel gelişirler gerekir. Eksplant sağlıksız ya da kötü görünürse, inkübasyon sırasında helak diseksiyonu sırasında sürdürmek için (örneğin HEPES-tamponlu M2 veya DMEM'dir% 10 FBS ile takviye), oda sıcaklığında kültür ortamı ile PBS değiştirmeyi deneyin eğilimindedir.

Bizim yaklaşım önemli bir kısıtlaması UYDM'ye göç için bir floresan etiket kazandıran bir fare hattının kullanılabilirliği dayanıyor olmasıdır. Böyle bir kaynak yokluğunda, m karşı bir antikorKKK igrating (örneğin, anti-Ret ya da bir anti-Sox10) kolajen jel işgal hücreleri etiketlemek için kullanılabilir. Ayrıca, bu in vitro testte elde edilen sonuçlar, in vivo olarak, tamamen enterik NCC davranışlarını yansıtmayabilir, gut mikro-ortamı çok daha karmaşık basit bir kollajen jel daha olduğunu verilmedi. Canlı hücre görüntüleme içeren ek deneyler bu davranışlarını değerlendirmek için tavsiye edilir. Bu bir kemoakraktan olarak rolüne ek olarak, GDNF enterik NCC 4 göç çoğalmasını teşvik bilinmektedir olması da dikkat çekicidir. GDNF mevcudiyetinde enterik NCC göç potansiyelinin Bizim ölçüsü ve böylece belki de bağırsakların NCC kolonizasyon yol açan mekanizmaların in vivo benzer gerçek hücre göçü ve hücre çoğalması bir karışımıdır. Bu iki işlem arasında açık bir farklılık isteniyorsa, kültür ortamı içinde, bir hücre döngüsü blokeri (örneğin, AZD 5438 18) eklenmesinin hücre migratio için analizi kısıtlayabilirn.

Bu teknik, çeşitli hücre dışı ligandlar yanı sıra belirli sinyal yollarının önleyicileri ve içinde herhangi bir kombinasyonu test etmek için genişletilebilir. Diğer dokular da potansiyel olarak kesilmiş ve bir çok embriyonik yapılarda NCC göç çalışma sağlayan kesitli olabilir. Yeni ve / ya da NCC gelişiminde muhtemel hataları ile karakterize edilmemiş mutant fare suşları ile birlikte, teknik eden hızlı bir şekilde belirli sinyal olaylarına tepki olarak göç davranışları eksiklikler taranması için uygulanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Biz görüntü işleme ve analiz için tavsiye Denis Flipo teşekkür ve David W. Silversides kimin laboratuvar olarak Gata4p [5kb]-GFP fare hattı oluşturuldu. Pilon Araştırma laboratuvarında CIHR, NSERC, FRQS ve FRQNT tarafından finanse edilmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM powder Wisent 219-010-XK  
NaHCO3 Bioshop SOB999 Biotechnology grade
Steriflip vacuum filtration system (0.22 micron) EMD Millipore SCGP00525  
Penicilin-Streptomycin solution, 100x Wisent 450-201-EL  
Fetal bovine serum Wisent 095-150 High quality grade
Collagen I BD biosciences 354236  
NaOH Bioshop SHY700 Diluted from 10 N stock then sterile-filtered
GDNF Cedarlane CLCYT305  
Falcon 24-well Plate BD biosciences 353047  
Dissecting scissors Fisher Scientific 089515  
Glass Petri dish VWR 89000-306  
PBS Sigma P5493 Cell culture grade
Dissecting microscope Leica M125  
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-20  
Agarose Bioshop AGA001 Biotechnology grade
Surgical blade Feather 21  
All Purpose Instant Krazy Glue Pen Krazy Glue KG824  
HM 650V Vibrating-Blade Microtome Thermo Scientific 920110  
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148  
DAPI Sigma-Aldrich D9564  

Table of specific reagents and equipment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bronner, M. E., Le Douarin, N. M. Development and evolution of the neural crest: An overview. Dev. Biol. 366, (1), 2-9 (2012).
  2. Bergeron, K. F., Silversides, D. W., Pilon, N. The developmental genetics of Hirschsprung's disease. Clin. Genet. 83, (1), 15-22 (2013).
  3. Obermayr, F., Hotta, R., Enomoto, H., Young, H. M. Development and developmental disorders of the enteric nervous system. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 10, (1), 43-57 (2012).
  4. Sasselli, V., Pachnis, V., Bursn, A. J. The enteric nervous system. Dev. Biol. 366, (1), 64-73 (2012).
  5. Sanchez, M. P., Silos-Santiago, I., et al. Renal agenesis and the absence of enteric neurons in mice lacking GDNF. Nature. 382, (6586), 70-73 (1996).
  6. Baynash, A. G., Hosoda, K., et al. Interaction of endothelin-3 with endothelin-B receptor is essential for development of epidermal melanocytes and enteric neurons. Cell. 79, (7), 1277-1285 (1994).
  7. Chalazonitis, A., Pham, T. D., et al. Neurotrophin-3 is required for the survival-differentiation of subsets of developing enteric neurons. J. Neurosci. 21, (15), 5620-5636 (2001).
  8. Goldstein, A. M., Brewer, K. C., Doyle, A. M., Nagy, N., Roberts, D. J. BMP signaling is necessary for neural crest cell migration and ganglion formation in the enteric nervous system. Mech. Dev. 122, (6), 821-833 (2005).
  9. Jiang, Y., Liu, M. T., Gershon, M. D. Netrins and DCC in the guidance of migrating neural crest-derived cells in the developing bowel and pancreas. Dev. Biol. 258, (2), 364-384 (2003).
  10. Ramalho-Santos, M., Melton, D. A., McMahon, A. P. Hedgehog signals regulate multiple aspects of gastrointestinal development. Development. 127, (12), 2763-2772 (2000).
  11. Natarajan, D., Marcos-Gutierrez, C., Pachnis, V., de Graaf, E. Requirement of signaling by receptor tyrosine kinase RET for the directed migration of enteric nervous system progenitor cells during mammalian embryogenesis. Development. 129, (22), 5151-5160 (2002).
  12. Young, H. M., Hearn, C. J., et al. GDNF Is a chemoattractant for enteric neural cells. Dev. Biol. 229, (2), 503-516 (2001).
  13. Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review. J. Med. Genet. 45, (1), 1-14 (2008).
  14. Pilon, N., Raiwet, D., Viger, R. S., Silversides, D. W. Novel pre- and post-gastrulation expression of Gata4 within cells of the inner cell mass and migratory neural crest cells. Dev. Dyn. 237, (4), 1133-1143 (2008).
  15. Nagy, N., Goldstein, A. M. Endothelin-3 regulates neural crest cell proliferation and differentiation in the hindgut enteric nervous system. Dev. Biol. 293, (1), 203-217 (2006).
  16. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersen, K., Behringer, R. Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. 3rd ed, CSH Press. Cold Spring Harbor. 209-250 (2003).
  17. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
  18. Byth, K. F., Thomas, A., et al. AZD5438, a potent oral inhibitor of cyclin-dependent kinases 1, 2, and 9, leads to pharmacodynamic changes and potent antitumor effects in human tumor xenografts. Mol. Cancer Ther. 8, (7), 1856-1866 (2009).
Kemirgen Enterik Sinir progenitörlerin için Kantitatif Hücre Göç Tahlili
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bergeron, K. F., Cardinal, T., Pilon, N. A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors. J. Vis. Exp. (79), e50709, doi:10.3791/50709 (2013).More

Bergeron, K. F., Cardinal, T., Pilon, N. A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors. J. Vis. Exp. (79), e50709, doi:10.3791/50709 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter