Calciumfosfaatprecipitatie een gemakkelijke en economische methode voor transfectie van gekweekte cellen. Met optimalisatie is het mogelijk om deze methode te gebruiken op moeilijk te transfecteren cellen zoals primaire neuronen. Hier beschrijven we gedetailleerd protocol voor calciumfosfaattransfectie van hippocampale neuronen gekweekt samen met astrogliale cellen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Calciumfosfaattransfectie van Primary hippocampus neuronen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Calciumfosfaatprecipitatie een gemakkelijke en economische methode voor transfectie van gekweekte cellen. Met optimalisatie is het mogelijk om deze methode te gebruiken op moeilijk te transfecteren cellen zoals primaire neuronen. Hier beschrijven we gedetailleerd protocol voor calciumfosfaattransfectie van hippocampale neuronen gekweekt samen met astrogliale cellen.
Inleiding
Primaire neuronen zijn een van de moeilijkste celtypen te transfecteren ze postmitotic en zijn zeer gevoelig voor micro-omgevingsveranderingen. Er zijn vier courante methoden voor expressie van exogene genen en korte haarspeld RNA (shRNAs) in deze cellen 1. Elk heeft zijn eigen voor-en nadelen. Zo wordt elektroporatie meestal uitgevoerd op vers geïsoleerde neuronen 2, zoals cellen in cuvetten voor transfectie moet worden overgedragen. Virusinfectie kan bereiken doorgaans zeer hoog rendement 3, maar is meer arbeidsintensief en riskant voor de exploitanten. Veel lipide gemedieerde transfectie reagentia zijn commercieel verkrijgbaar, met wisselend succes in neuronen en verschillende niveaus van cytotoxiciteit.
Calciumfosfaattransfectie is een gemakkelijke en economische methode voor het introduceren van vreemde genen in neuronen. De werkwijze werd eerst gebruikt om adenovirus DNA in zoogdierlijke cells door Graham en Van der Eb (1973) 4. Transfectie werd uitgevoerd door mengen van calciumchloride met recombinant DNA in een fosfaatbuffer. Dit maakt de vorming van DNA / calciumfosfaat precipitaten die bij geleidelijk vallen op een monolaag van cellen hechten aan het celoppervlak worden door endocytose taken en voert uiteindelijk de kern 5. Dit proces leidt tot de expressie van geïntroduceerde vreemde genen in de doelcel. Typische rendementen van calciumfosfaattransfectie bereik tussen 0,5-5% 6-8. Echter, met een zorgvuldige optimalisatie en consistente uitvoering van het experimentele protocol, is het mogelijk om een transfectie-efficiëntie van bijna 50% bereikt. Hier beschrijven we gedetailleerd protocol voor calciumfosfaat transfectie van primaire hippocampale neuronen, die worden gekweekt samen met astrogliale cellen in een sandwich formaat 9.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Voorbereiden van Rat Astrocyte Cultuur voor geconditioneerde media en Astrocyte-neuron Coculturen.
- Bereid dissectie buffer (BSS, zie tabel 1 voor recept) en bewaar bij 4 ° C tot klaar voor gebruik.
- Verdoven neonatale rat pups (P0-P2) met isofluraan in een bekerglas van 500 ml.
- Wanneer pups zijn immobiel, spray met 70% ethanol en onthoofden.
- Verwijder de hersenen.
- Houd het hoofd vast met een paar Dumont # 5 tang, en gebruik fijne schaar om een middellijn incisie door de huid en de schedel.
- Expose de hersenen door te reflecteren de schedel aan de zijkanten, en verwijder de hersenen in een schotel met koud BSS.
- Scheid de hersenhelften van het diencephalon en de hersenstam onder een dissectie scope. Verwijder alle hersenvliezen zorgvuldig door het stabiliseren van het weefsel met een pincet en voorzichtig wegrijden de hersenvliezen met een ander paar pincetten.
- Verzamel alle hemisferen in een 60 mm schaal. Met behulp van kleine schaar, gehakt weefsel zo fijn mogelijk. Vervolgens transfer gehakt weefsel in een 50 ml conische buis.
- Voeg 1,5 ml van 1% DNase I en 1,5 ml 2,5% trypsine en 12 ml BSS (totaal volume van 15 ml) tot hersenen. Incubeer in een schuddend waterbad gedurende 15 minuten bij 37 ° C. Om een goede menging te verzekeren, wordt buis wervelde door de hand om de 5 minuten.
- Transfer supernatant door een 70 um cel zeef over een nieuwe 50 ml conische buis. Voeg 3 ml FBS dit supernatant.
- Om de resterende stukken, voeg 13,5 ml van BSS en 1,5 ml 2,5% trypsine en incubeer in het schudden waterbad nog 15 min..
- Draagt de resterende supernatant door de cel zeef en combineren met de bovenstaande vanaf stap 1.8.
- Centrifugeer bij 1000 rpm gedurende 5 minuten om de cellen te pelleteren.
- Resuspendeer pellets in 5 ml gliale media. Supernatans opnieuw worden gecentrifugeerd om de resterende cellen neer.
- Tellen cellen met een hemocytometer.
- Plaat celIs bij een dichtheid van 1 x 10 7 per 150 cm2 kolf.
- Verander media frisse gliale media de dag na plating. Daarna voeden cellen twee keer per week met gliale media.
- Wanneer de cellen> 80% confluentie (ongeveer 10 dagen na plating) hebben bereikt, bevriezen de cellen in 90% paard serum en 10% DMSO en houden voorraden in vloeibare stikstof. Cellen worden ingevroren bij 2 x 10 6 per flacon. Ongeveer 5 flacons kunnen uit elke kolf worden bevroren.
- Ongeveer 10-14 dagen voor het opzetten van de hippocampus cultuur, zijn gliacellen vergulde uit de bevroren voorraden. We meestal plaat vijf 6-well platen, die voldoende is om de groei van 90 dekglaasjes van hippocampale neuronen (drie 15 mm ronde dekglaasjes per putje) ondersteunen. We hebben ook een extra plaat acht tot tien 60 mm schalen van gliacellen, die wordt gebruikt voor het conditioneren N2.1 media voor transfectie. De dag voor neuronale cultuur moeten de cellen worden gevoed met NB27 media. De astrocyten moet idealiter> 90% confluent bij This punt. We vinden dat sterk bevriezen vermindert het aantal microglia in het astroglial kweken. Aangezien toegenomen neurotoxiciteit wordt waargenomen wanneer microglia aanwezig in de astroglial culturen, gebruiken wij altijd astrogliale cultuur bereid uit bevroren voorraden voor coculture met neuronen.
2. Neuronale Cultuur
- Schoon glas dekglaasjes door eerst spoelen in milliQ water 2x. Vervolgens worden ze geweekt in geconcentreerd salpeterzuur gedurende 24 uur en gespoeld met milliQ water gedurende minstens vijf keer in totaal 2 uur. Coverslips worden gedroogd en gesteriliseerd door bakken in een oven bij 225 ° C gedurende 6 uur.
- Transfer coverslips tot 60 mm gerechten na sterilisatie. Plaats vier punten steriele paraffine nabij de buitenrand van elk dekglaasje blijven neuronen scheiden van gliacellen tijdens co-kweek.
- Coat dekglaasjes met 1 mg / ml poly-L-lysine in 0,1 M boraatbuffer overnacht in 37 ° C incubator.
- De volgende dag, spoel dekglaasjes tweemaal in steriele milliQ water gedurende ten minste 15 minuten elk. Zij worden vervolgens gedurende een nacht geïncubeerd in plating media 37 ° C incubator.
- Euthanaseren zwangere rat (E18) door isofluraananesthesie gevolgd door pneumothorax, en euthanaseren embryonale ratten door onthoofding. Verwijder de hersenen en ontleden de hersenhelften zoals hierboven beschreven.
- Ontleden de hippocampus van de hersenhelft. Plaats alle hippocampus in een 15 ml conische buis en verteren met 0,25% trypsine (0,5 ml 2,5% trypsine, 4,5 ml BSS) bij 37 ℃ gedurende 15 minuten.
- Verteerd hippocampus worden gespoeld in BSS 3x gedurende 5 minuten elk. Ze worden vervolgens verpulverd met een glazen Pasteur pipet en de celdichtheid wordt bepaald met behulp van een hemocytometer. Neuronen worden vervolgens geënt bij een dichtheid van 2 x 10 5 cellen per 60 mm schaal.
- Ongeveer 2-4 uur na plating, overdracht coverslips met aangehechte neuronen om de schalen met astroglial cellen, met neuronen naar beneden richting de glia. Bij DIV3 toevoegen cytosinearabinoside aan decellen in een eindconcentratie van 5 uM tot glia proliferatie te stoppen.
3. Calcium Transfection
- Voorwaarde N2.1 media op glia de dag voor transfectie.
- Op de dag van de transfectie, neem geconditioneerde N2.1 media af van glia en over in een nieuw gerecht. Transfer coverslips met neuronen in de geconditioneerde N2.1 media. Laat equilibreren incubator gedurende 10-30 minuten.
- Een set van steriele buizen combineren 1-4 ug DNA, 12,5 gl 2 M CaCl2 en steriel H2O een totaal volume van 100 pl. Om een tweede stel buizen, voeg 100 ul van 2x HBS.
- Voeg ⅛ volume 2x HBS (12,5 pl) tegelijkertijd aan de buis met de CaCl 2 / DNA mengsel vortexen gedurende enkele seconden per keer. Laat de buizen te zitten voor 15 minuten.
- Na 15 min incubatie, voeg de transfectie mengsel druppelsgewijs aan de cellen. Incubeer gedurende 1-1,5 uur. Een laag zand-achtige neerslagen moet zichtbaar zijnonder de microscoop met een 10X objectief.
- Na incubatie, spoel coverslips tweemaal met warm HBS wasbuffer.
- Terug dekglaasjes originele gerechten met glia, voeg kynurenic zuur tot een eindconcentratie van 0,5 mM.
- Getransfecteerde neuronen live worden afgebeeld of verwerkt voor immunocytochemie al de volgende dag. Neuronen kan overleven drie weken na transfectie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Wanneer de verschillende parameters van de transfectie worden geoptimaliseerd en zorgvuldig gecontroleerd van experiment tot experiment, is het mogelijk transfectie efficiënties van tot 50% te verkrijgen. Figuur 1 toont een gebied van neuronen die zijn getransfecteerd met GFP op DIV4. Het veld bevat een totaal van 28 neuronen, waaronder 16 werden getransfecteerd. Dit vertegenwoordigt een rendement van meer dan 50%. Een steekproef van andere velden op dezelfde dekglaasje toont een totaal rendement van on...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Er zijn een aantal belangrijke parameters die moeten zorgvuldig worden gecontroleerd voor consistent succesvol transfecties 10,11. De meest kritische parameter voor calciumfosfaat transfectie is de pH van 2x HBS, die in onze handen varieert meestal tussen 7,10-7,15. Wij raden het maken van drie partijen van de voorraden met pH-waarden in stappen van 0,05 om rekening te houden met het verschil tussen de pH-meter. Als alternatief, de Clontech zoogdieren transfectiekit biedt 2x HBS die consequent levert goede ef...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen tegenstrijdige geïnteresseerd verklaard.
Dankbetuigingen
Dit werk wordt ondersteund door NIH-subsidie NS065183 en start-up fondsen van de Rutgers Robert Wood Johnson Medical School.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | recht / scherp 8,5 cm |
| Vannas-Tubinger veerschaar | Fine Science Tools | 15008-08 | gebogen / scherp / 8,5 cm / 5 mm snijrand |
| Standaard forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Student chirurgische schaar | Fine Science Tools | 91401-14 | blunt / 14,5 cm |
| Veerschaar | Fine Science Tools | 15006-09 | zijwaarts gebogen / 9 cm / 10 mm snijrand |
| Isofluraan | Webster Veterinary | 14043-225-06 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| 100 mM Natriumpyruvaat | Sigma | S8636 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4385 | |
| 1 M HEPES, pH 7.3 | Gibco/Invitrogen | 15630-080 | |
| GlutaMAX | Gibco/Invitrogen | 35050-061 | |
| Neurobasal Media | Gibco/Invitrogen | 21130-049 | |
| B27 Supplement (50x) | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| N2 Supplement | Gibco/Invitrogen | 17502-048 | |
| Ovalbumine | Sigma | A5503 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco/Invitrogen | 15070-063 | |
| 2,5% Trypsin | Gibco/Invitrogen | 15090-046 | |
| DNase I | Sigma | DN-25 | |
| Cytosine arabinoside | Calbiochem/EMD Millipore | 251010 | |
| Kynureninezuur | Sigma | K3375 |
Referenties
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
- Zeitelhofer, M., et al. High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection. Nat. Protoc. 2, 1692-1704 (2007).
- Janas, J., Skowronski, J., Van Aelst, L. Lentiviral delivery of RNAi in hippocampal neurons. Method Enzymol. 406, 593-605 (2006).
- Graham, F. L., vander Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology. 52, 456-467 (1973).
- Craig, A. M. Transfecting cultured neurons. Culturing Nerve Cells. Banker, G. aG. K. , 2nd edition, MIT Press. Cambridge, MA. (1998).
- Alavian, K. N., et al. Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase. Nat. Cell Biol. 13, 1224-1233 (2011).
- Zhang, Y., et al. Modulation of synaptic function by VAC14, a protein that regulates the phosphoinositides PI(3,5)P(2) and PI(5)P. EMBO J. 31, 3442-3456 (2012).
- Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 3, Unit 3 11(2001).
- Goslin, K. A. H., Banker, G. Rat Hippocampal Neurons in Low-Density Culture. Culturing Nerve Cells. Banker, G. aG. K. , MIT Press. Cambridge, MA. (1998).
- Kohrmann, M., et al. Fast, convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons. J. Neurosci. Res. 58, 831-835 (1999).
- Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).
- Goetze, B., Grunewald, B., Baldassa, S., Kiebler, M. Chemically controlled formation of a DNA/calcium phosphate coprecipitate: application for transfection of mature hippocampal neurons. J. Neurobiol. 60, 517-525 (2004).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
