Summary
Calciumfosfaatprecipitatie een gemakkelijke en economische methode voor transfectie van gekweekte cellen. Met optimalisatie is het mogelijk om deze methode te gebruiken op moeilijk te transfecteren cellen zoals primaire neuronen. Hier beschrijven we gedetailleerd protocol voor calciumfosfaattransfectie van hippocampale neuronen gekweekt samen met astrogliale cellen.
Abstract
Calciumfosfaatprecipitatie een gemakkelijke en economische methode voor transfectie van gekweekte cellen. Met optimalisatie is het mogelijk om deze methode te gebruiken op moeilijk te transfecteren cellen zoals primaire neuronen. Hier beschrijven we gedetailleerd protocol voor calciumfosfaattransfectie van hippocampale neuronen gekweekt samen met astrogliale cellen.
Introduction
Primaire neuronen zijn een van de moeilijkste celtypen te transfecteren ze postmitotic en zijn zeer gevoelig voor micro-omgevingsveranderingen. Er zijn vier courante methoden voor expressie van exogene genen en korte haarspeld RNA (shRNAs) in deze cellen 1. Elk heeft zijn eigen voor-en nadelen. Zo wordt elektroporatie meestal uitgevoerd op vers geïsoleerde neuronen 2, zoals cellen in cuvetten voor transfectie moet worden overgedragen. Virusinfectie kan bereiken doorgaans zeer hoog rendement 3, maar is meer arbeidsintensief en riskant voor de exploitanten. Veel lipide gemedieerde transfectie reagentia zijn commercieel verkrijgbaar, met wisselend succes in neuronen en verschillende niveaus van cytotoxiciteit.
Calciumfosfaattransfectie is een gemakkelijke en economische methode voor het introduceren van vreemde genen in neuronen. De werkwijze werd eerst gebruikt om adenovirus DNA in zoogdierlijke cells door Graham en Van der Eb (1973) 4. Transfectie werd uitgevoerd door mengen van calciumchloride met recombinant DNA in een fosfaatbuffer. Dit maakt de vorming van DNA / calciumfosfaat precipitaten die bij geleidelijk vallen op een monolaag van cellen hechten aan het celoppervlak worden door endocytose taken en voert uiteindelijk de kern 5. Dit proces leidt tot de expressie van geïntroduceerde vreemde genen in de doelcel. Typische rendementen van calciumfosfaattransfectie bereik tussen 0,5-5% 6-8. Echter, met een zorgvuldige optimalisatie en consistente uitvoering van het experimentele protocol, is het mogelijk om een transfectie-efficiëntie van bijna 50% bereikt. Hier beschrijven we gedetailleerd protocol voor calciumfosfaat transfectie van primaire hippocampale neuronen, die worden gekweekt samen met astrogliale cellen in een sandwich formaat 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiden van Rat Astrocyte Cultuur voor geconditioneerde media en Astrocyte-neuron Coculturen.
- Bereid dissectie buffer (BSS, zie tabel 1 voor recept) en bewaar bij 4 ° C tot klaar voor gebruik.
- Verdoven neonatale rat pups (P0-P2) met isofluraan in een bekerglas van 500 ml.
- Wanneer pups zijn immobiel, spray met 70% ethanol en onthoofden.
- Verwijder de hersenen.
- Houd het hoofd vast met een paar Dumont # 5 tang, en gebruik fijne schaar om een middellijn incisie door de huid en de schedel.
- Expose de hersenen door te reflecteren de schedel aan de zijkanten, en verwijder de hersenen in een schotel met koud BSS.
- Scheid de hersenhelften van het diencephalon en de hersenstam onder een dissectie scope. Verwijder alle hersenvliezen zorgvuldig door het stabiliseren van het weefsel met een pincet en voorzichtig wegrijden de hersenvliezen met een ander paar pincetten.
- Verzamel alle hemisferen in een 60 mm schaal. Met behulp van kleine schaar, gehakt weefsel zo fijn mogelijk. Vervolgens transfer gehakt weefsel in een 50 ml conische buis.
- Voeg 1,5 ml van 1% DNase I en 1,5 ml 2,5% trypsine en 12 ml BSS (totaal volume van 15 ml) tot hersenen. Incubeer in een schuddend waterbad gedurende 15 minuten bij 37 ° C. Om een goede menging te verzekeren, wordt buis wervelde door de hand om de 5 minuten.
- Transfer supernatant door een 70 um cel zeef over een nieuwe 50 ml conische buis. Voeg 3 ml FBS dit supernatant.
- Om de resterende stukken, voeg 13,5 ml van BSS en 1,5 ml 2,5% trypsine en incubeer in het schudden waterbad nog 15 min..
- Draagt de resterende supernatant door de cel zeef en combineren met de bovenstaande vanaf stap 1.8.
- Centrifugeer bij 1000 rpm gedurende 5 minuten om de cellen te pelleteren.
- Resuspendeer pellets in 5 ml gliale media. Supernatans opnieuw worden gecentrifugeerd om de resterende cellen neer.
- Tellen cellen met een hemocytometer.
- Plaat celIs bij een dichtheid van 1 x 10 7 per 150 cm2 kolf.
- Verander media frisse gliale media de dag na plating. Daarna voeden cellen twee keer per week met gliale media.
- Wanneer de cellen> 80% confluentie (ongeveer 10 dagen na plating) hebben bereikt, bevriezen de cellen in 90% paard serum en 10% DMSO en houden voorraden in vloeibare stikstof. Cellen worden ingevroren bij 2 x 10 6 per flacon. Ongeveer 5 flacons kunnen uit elke kolf worden bevroren.
- Ongeveer 10-14 dagen voor het opzetten van de hippocampus cultuur, zijn gliacellen vergulde uit de bevroren voorraden. We meestal plaat vijf 6-well platen, die voldoende is om de groei van 90 dekglaasjes van hippocampale neuronen (drie 15 mm ronde dekglaasjes per putje) ondersteunen. We hebben ook een extra plaat acht tot tien 60 mm schalen van gliacellen, die wordt gebruikt voor het conditioneren N2.1 media voor transfectie. De dag voor neuronale cultuur moeten de cellen worden gevoed met NB27 media. De astrocyten moet idealiter> 90% confluent bij This punt. We vinden dat sterk bevriezen vermindert het aantal microglia in het astroglial kweken. Aangezien toegenomen neurotoxiciteit wordt waargenomen wanneer microglia aanwezig in de astroglial culturen, gebruiken wij altijd astrogliale cultuur bereid uit bevroren voorraden voor coculture met neuronen.
2. Neuronale Cultuur
- Schoon glas dekglaasjes door eerst spoelen in milliQ water 2x. Vervolgens worden ze geweekt in geconcentreerd salpeterzuur gedurende 24 uur en gespoeld met milliQ water gedurende minstens vijf keer in totaal 2 uur. Coverslips worden gedroogd en gesteriliseerd door bakken in een oven bij 225 ° C gedurende 6 uur.
- Transfer coverslips tot 60 mm gerechten na sterilisatie. Plaats vier punten steriele paraffine nabij de buitenrand van elk dekglaasje blijven neuronen scheiden van gliacellen tijdens co-kweek.
- Coat dekglaasjes met 1 mg / ml poly-L-lysine in 0,1 M boraatbuffer overnacht in 37 ° C incubator.
- De volgende dag, spoel dekglaasjes tweemaal in steriele milliQ water gedurende ten minste 15 minuten elk. Zij worden vervolgens gedurende een nacht geïncubeerd in plating media 37 ° C incubator.
- Euthanaseren zwangere rat (E18) door isofluraananesthesie gevolgd door pneumothorax, en euthanaseren embryonale ratten door onthoofding. Verwijder de hersenen en ontleden de hersenhelften zoals hierboven beschreven.
- Ontleden de hippocampus van de hersenhelft. Plaats alle hippocampus in een 15 ml conische buis en verteren met 0,25% trypsine (0,5 ml 2,5% trypsine, 4,5 ml BSS) bij 37 ℃ gedurende 15 minuten.
- Verteerd hippocampus worden gespoeld in BSS 3x gedurende 5 minuten elk. Ze worden vervolgens verpulverd met een glazen Pasteur pipet en de celdichtheid wordt bepaald met behulp van een hemocytometer. Neuronen worden vervolgens geënt bij een dichtheid van 2 x 10 5 cellen per 60 mm schaal.
- Ongeveer 2-4 uur na plating, overdracht coverslips met aangehechte neuronen om de schalen met astroglial cellen, met neuronen naar beneden richting de glia. Bij DIV3 toevoegen cytosinearabinoside aan decellen in een eindconcentratie van 5 uM tot glia proliferatie te stoppen.
3. Calcium Transfection
- Voorwaarde N2.1 media op glia de dag voor transfectie.
- Op de dag van de transfectie, neem geconditioneerde N2.1 media af van glia en over in een nieuw gerecht. Transfer coverslips met neuronen in de geconditioneerde N2.1 media. Laat equilibreren incubator gedurende 10-30 minuten.
- Een set van steriele buizen combineren 1-4 ug DNA, 12,5 gl 2 M CaCl2 en steriel H2O een totaal volume van 100 pl. Om een tweede stel buizen, voeg 100 ul van 2x HBS.
- Voeg ⅛ volume 2x HBS (12,5 pl) tegelijkertijd aan de buis met de CaCl 2 / DNA mengsel vortexen gedurende enkele seconden per keer. Laat de buizen te zitten voor 15 minuten.
- Na 15 min incubatie, voeg de transfectie mengsel druppelsgewijs aan de cellen. Incubeer gedurende 1-1,5 uur. Een laag zand-achtige neerslagen moet zichtbaar zijnonder de microscoop met een 10X objectief.
- Na incubatie, spoel coverslips tweemaal met warm HBS wasbuffer.
- Terug dekglaasjes originele gerechten met glia, voeg kynurenic zuur tot een eindconcentratie van 0,5 mM.
- Getransfecteerde neuronen live worden afgebeeld of verwerkt voor immunocytochemie al de volgende dag. Neuronen kan overleven drie weken na transfectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wanneer de verschillende parameters van de transfectie worden geoptimaliseerd en zorgvuldig gecontroleerd van experiment tot experiment, is het mogelijk transfectie efficiënties van tot 50% te verkrijgen. Figuur 1 toont een gebied van neuronen die zijn getransfecteerd met GFP op DIV4. Het veld bevat een totaal van 28 neuronen, waaronder 16 werden getransfecteerd. Dit vertegenwoordigt een rendement van meer dan 50%. Een steekproef van andere velden op dezelfde dekglaasje toont een totaal rendement van ongeveer 50% (gegevens niet getoond). Met het astroglial gemengde cultuursysteem, gezonde neuronen houden en ontwikkelen normaal na transfectie. Figuur 2 toont een hippocampale neuron in DIV15, 10 dagen na transfectie met een PSD-95-GFP-construct. Het neuron heeft talrijke volwassen paddestoelvormige dendritische stekels ontwikkeld, die aangeeft de neuronen zijn gezond. De hoge transfectie-efficiëntie en minimale toxiciteit van dit protocol maakt het een waardevol instrument voor het bestuderen van gen functies in het primair nijlpaardCampal neuronen. Tenslotte kan dit protocol mogelijk worden aangepast aan culturen van andere types van neuronen in de hersenen en andere moeilijk te transfecteren celtypen te transfecteren.
Figuur 1. Hippocampusneuronen getransfecteerd met GFP op DIV4, die een hoge transfectie-efficiëntie. 16 van de 28 neuronen in het veld zijn positief. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 2. Hippocampale neuron getransfecteerd met PSD-95-GFP op DIV15, waaruit tal volwassen paddestoelvormige dendritische stekels. Klik hier voor grotere afbeelding .
Tabel 1. Buffer / Media Recepten.
| Reagens | Onderdelen |
| Gliale Media | 425 ml MEM 5 ml GlutaMAX 5 ml natrium pyruvaat, 100 mM 15 ml 20% glucose 25 ml FBS (laatste 5%) 25 ml kalf serum (laatste 5%) 5 ml penicilline / streptomycine |
| 0,1 M boraatbuffer | 2,48 g boorzuur 3,9 g natrium (borax) 800 ml milliQ H2O pH met NaOH tot 8,5 Filter steriliseren |
| Plating Media | 425 ml MEM 5 ml GlutaMAX 5 ml natrium pyruvaat, 100 mM 15 ml 20% glucose 50 ml FBS |
| NB27 Media | 485 ml Neurobasal Media 5 ml GlutaMAX 2 ml B27 supplement (50x) |
| Dissection Buffer (BSS) | 50 ml 10x HBSS 5 ml 1 M HEPES, pH 7,3 5 ml penicilline / streptomycine 440 ml H 2 O |
| N2.1 Media | 425 ml MEM 5 ml GlutaMAX 5 ml natrium pyruvaat, 100 mM 15 ml 20% glucose 50 ml ovalbumine, 1% MEM 5 ml N2 supplement |
| 2x HEPES gebufferde zoutoplossing (HBS), steriele | 274 mM NaCl 9.5 mM KCl 15 mM glucose 42 mM HEPES 1.4 mM Na 2 HPO 4 Bereid batches van 3 verschillende pH (7.05, 7.10, 7.15) |
| Wash Buffer (HEPES gebufferde zoutoplossing) | 50 ml 10x HBSS 5 ml 1 M HEPES, pH 7,3 445 ml H2O |
| 50 mM kynurenic zuur | Los 0.473 g kynurenic zuur in 1x PBS. Druppels NaOH toe te voegen om het te krijgen in de oplossing. Maak dan gebruik van HCl tot pH terug aan te passen aan 7.0 |
Tabel 2. Tijdslijn voor cultuur voorbereiding.
| Dag | Actie |
| Voordat u begint | Bereid astrocyten cultuur en vries cellen naar beneden. Een partij van astrocyten cultuur kan ondersteunen gewoonlijk enkele maanden van de hippocampus culturen. |
| Week 1 Maandag | Ontdooien astrocyten. |
| Week 1 Dinsdag | Feed astrocyten. |
| Week 1 vrijdag | Feed astrocyten. |
| Week 2 Maandag | Feed astrocyten. Spoel dekglaasjes in H 2 O, dan genieten in salpeterzuur gedurende 24 uur. |
| Week 2 dinsdag | Rinse coverslips 5x. Droog steriliseren dekglaasjes. |
| Week 2 woensdag | Plaats paraffine stippen op dekglaasjes. Coat coverslips met poly-L-lysine. |
| Week 2 Donderdag | Spoel beklede dekglaasjes in steriel H2O, vervolgens incubeer dekglaasjes in plating media nacht bij 37 ° C. Verander media op astrocyten te NB27. |
| Week 2 vrijdag | Hippocampus dissectie en plating. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn een aantal belangrijke parameters die moeten zorgvuldig worden gecontroleerd voor consistent succesvol transfecties 10,11. De meest kritische parameter voor calciumfosfaat transfectie is de pH van 2x HBS, die in onze handen varieert meestal tussen 7,10-7,15. Wij raden het maken van drie partijen van de voorraden met pH-waarden in stappen van 0,05 om rekening te houden met het verschil tussen de pH-meter. Als alternatief, de Clontech zoogdieren transfectiekit biedt 2x HBS die consequent levert goede efficiëntie. Houd in gedachten dat de pH van de oplossing zal veranderen in de tijd, zelfs wanneer ze worden bewaard in de vriezer. We houden gewoonlijk hoeveelheden 2x HBS bij 4 ° C gedurende maximaal een maand, en bij -20 ° C gedurende maximaal een jaar.
De tweede parameter is de pH van het kweekmedium. Om dit consequent, N2.1 medium te houden worden regelmatig 's nachts, maar niet meer dan 24 uur onder de voorwaarde dat astrogliale culturen. Daarnaast proberen we astrogliale culturen th gebruikenop zijn vergelijkbaar in confluentie. Het gebruik van glia geconditioneerde media helpt ook toxisch voor neuronen tijdens transfectie. Geconditioneerde media geëquilibreerd in de incubator voor transfectie om de pH consistent.
De grootte en dichtheid van de calciumfosfaat precipitaten sleutel tot een succesvolle transfectie. Kleine neerslagen zou leiden tot lage transfectie-efficiëntie, terwijl de grote, klonterig neerslagen leiden meestal tot cytotoxiciteit 10. Consistente calciumfosfaatprecipitaat vorming garanderen, maken we gebruik van intermitterende vortexen bij het mengen van het DNA / CaCl2 en 2x HBS 11. Een andere veel gebruikte werkwijze voor het mengen waait door luchtbellen met een Pasteur pipet 12. We hebben de intermitterende vortexen om meer consistente neerslag vorming opleveren gevonden, vooral voor kleine volumes van transfectie mengsel.
Andere variabelen te overwegen omvatten de kwaliteit van het DNA en de ouderdom van de neurons. We vinden dat de transfectie gaan steeds werken als neuronen bereikt DIV2, maar de efficiëntie verder afneemt wanneer neuronen buiten DIV10. Tenslotte, de gezondheid van de neuronale kweken zelf is eveneens een belangrijke parameter. Wij vinden het gebruik van de co-cultuur systeem de beste manier om gezonde primaire hippocampuskweken genereren. Als de neuronen niet gezond zijn, zullen ze niet lang overleven na transfectie. Met het gemengde cultuursysteem kan neuronen lage dichtheid overleven tot 3 weken na transfectie, die lange termijn studies vergemakkelijkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen tegenstrijdige geïnteresseerd verklaard.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door NIH-subsidie NS065183 en start-up fondsen van de Rutgers Robert Wood Johnson Medical School.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | straight / sharp 8.5 cm |
| Vannas-Tubinger spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91401-14 | blunt / 14.5 cm |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 14043-225-06 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| 100 mM Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4385 | |
| 1 M HEPES, pH 7.3 | Gibco/Invitrogen | 15630-080 | |
| GlutaMAX | Gibco/Invitrogen | 35050-061 | |
| Neurobasal Media | Gibco/Invitrogen | 21130-049 | |
| B27 Supplement (50x) | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| N2 Supplement | Gibco/Invitrogen | 17502-048 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco/Invitrogen | 15070-063 | |
| 2.5% Trypsin | Gibco/Invitrogen | 15090-046 | |
| DNase I | Sigma | DN-25 | |
| Cytosine arabinoside | Calbiochem/EMD Millipore | 251010 | |
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 |
References
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
- Zeitelhofer, M., et al. High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection. Nat. Protoc. 2, 1692-1704 (2007).
- Janas, J., Skowronski, J., Van Aelst, L. Lentiviral delivery of RNAi in hippocampal neurons. Method Enzymol. 406, 593-605 (2006).
- Graham, F. L., vander Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology. 52, 456-467 (1973).
- Craig, A. M. Transfecting cultured neurons. Culturing Nerve Cells. Banker, G. aG. K. , 2nd edition, MIT Press. Cambridge, MA. (1998).
- Alavian, K. N., et al. Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase. Nat. Cell Biol. 13, 1224-1233 (2011).
- Zhang, Y., et al. Modulation of synaptic function by VAC14, a protein that regulates the phosphoinositides PI(3,5)P(2) and PI(5)P. EMBO J. 31, 3442-3456 (2012).
- Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 3, Unit 3 11 (2001).
- Goslin, K. A. H., Banker, G. Rat Hippocampal Neurons in Low-Density Culture. Culturing Nerve Cells. Banker, G. aG. K. , MIT Press. Cambridge, MA. (1998).
- Kohrmann, M., et al. Fast, convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons. J. Neurosci. Res. 58, 831-835 (1999).
- Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).
- Goetze, B., Grunewald, B., Baldassa, S., Kiebler, M. Chemically controlled formation of a DNA/calcium phosphate coprecipitate: application for transfection of mature hippocampal neurons. J. Neurobiol. 60, 517-525 (2004).
