Summary
גישת יוכימיים מתוארת לזהות באינטראקציות vivo חלבונים (PPI) של חלבונים בממברנה. השיטה משלבת צלב המקשר חלבון, טיהור זיקה וספקטרומטריית מסה, וניתנת להתאמה כמעט לכל סוג תא או האורגניזם. עם גישה זו, גם זיהוי של PPI החולף הופך לאפשרי.
Abstract
החלבונים בממברנה הם חיוניים ליכולת קיום של תאים ולכן הם מטרות טיפוליות חשובות 1-3. מאז הם פועלים במתחמים 4, שיטות לזיהוי ואפיון של האינטראקציות שלהם נחוצות 5. לשם כך, פיתחנו ניסוי ממברנה סטרפטוקוקוס חלבון האינטראקציה, הנקרא ממברנה עמוד השדרה 6. טכניקה זו משלבת in vivo cross-linking באמצעות פורמלדהיד צולב מקשר הפיך עם טיהור זיקה של חלבון פיתיון קרום סטרפטוקוקוס מתויג. במהלך ההליך, חלבוני טרף צולבים הם שיתוף מטוהר עם חלבון פיתיון הקרום ולאחר מכן הופרד על ידי רתחה. לפיכך, ניתן לבצע שתי משימות עיקריות בעת ניתוח אינטראקציות בין חלבונים (-PPI) של חלבונים בממברנה באמצעות ממברנה בעמוד שדרה: ראשון, האישור של שותף אינטראקציה שהוצע על ידי immunoblotting, ושנית, זיהוי שותפי אינטראקציה חדשים על ידי ניתוח ספקטרומטריית מסה . יתר על כן, גם אניow זיקה, PPIs החולף הוא לגילוי על ידי טכניקה זו. לבסוף, ממברנה שדרה להתאמה כמעט לכל סוג תא, מה שהופך אותו מתאים ככלי מיון רבי עוצמה כדי לזהות-PPI של חלבונים בממברנה.
Introduction
כדי להבין את תפקידו של חלבון זה חיוני לדעת שותפי האינטראקציה שלה. כמה טכניקות קלאסיות זמינות לזיהוי שותפי אינטראקציה של חלבונים מסיסים. עם זאת, טכניקות אלה אינן ניתנות להעברה בקלות לחלבוני קרום בשל האופי ההידרופובי שלהם 4. כדי להתגבר על מגבלה זו, פיתחנו ניסוי האינטראקציה סטרפטוקוקוס חלבון ממברנה (ממברנה-עמוד שדרה) 6. היא מבוססת על שיטת עמוד השדרה, שהייתה מתאים רק לחלבונים מסיסים 7.
יתרונות קרום עמוד שדרה משני יתרונות של פורמלדהיד סוכן cross-linking: ראשון, פורמלדהיד יכול לחדור בקלות ממברנות ולכן מייצר תמונת מצב מדויקת של interactome של תא חי 8. שנית, יכולים להיות הפוכים קישורים צולבים פורמלין על ידי הרתחת 9. הנה, שני יתרונות אלו משמשים לזיהוי לא רק-PPI קבוע, אלא גם הגנה של מחזור החולף של קרוםתוספות 6.
בקיצור, סטרפטוקוקוס תג הוא קבע את C-הסופית של חלבון פיתיון קרום נפרד. תאים המבטאים את חלבון פיתיון הקרום מודגרת עם פורמלדהיד אשר חוצה קישורים לטרוף חלבונים לחלבון פיתיון קרום (איור 1). שינויים של חלבוני טרף אין צורך. בשלב הבא, את החלק יחסי הקרום מוכן. לכן, חלבוני קרום solubilized על ידי טיפול בחומרי ניקוי ופיתיון חלבונים הם שיתוף מטוהר עם חלבוני הטרף שלה באמצעות טיהור זיקה. בהמשך לכך, הקישור הצולב מתהפך על ידי רותחים, ואת הפיתיון והחלבונים טרף שיתוף eluted-מופרדים על ידי-SDS. לבסוף, ניתן לזהות חלבוני טרף על ידי ניתוח immunoblot או ספקטרומטריית מסה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: מידע מפורט לגבי מאגרים שצוינו בפרוטוקול נגיש בטבלה 1.
1. קיבוע של חלבונים אינטראקציות על ידי פורמלדהיד cross-linking בתאים חיים
- כדי להתחיל להכין את תקשורת צמיחה, פתרונות מניות וP1 החיץ
- הכן 500 בינוני מיליליטר: הבינוני צריך לספק תנאים התומכים באינטראקציה בין חלבון פיתיון הממברנה וחלבונים טרף. בנוסף, ניסוי אחד צריכה להתבצע בתנאים בהם אין אינטראקציה צפויה (למשל ללא cross-linking).
הערה: אנו משווים אינטראקציות בין חלבונים בחיידקים הדגישו ולא לחוצים. לכן, אנו מכינים 500 מיליליטר וריא Bertani בינוני (LB) (טבלת 1) שאנחנו משלימים עם סוכן וישכנע לחץ (למשל 0.5 M NaCl) בבקבוק 2 ליטר Erlenmeyer. לבקרה, אנו משתמשים במדיום LB נורמלי עם 0.17 M NaCl (pH 7.0). - הכן טריס-חיץ (20 מ"מ טריס-HCl; pH 8.0) ו0.1 M חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA), פתרון ה-pH 8.0 המניה (טבלת 1).
- הכן P1 חיץ. ממיסים סוכרוז לריכוז סופי של 0.5 M בטריס-חיץ. לעקר P1 חיץ על ידי סינון ולאחסן אותו ב 4 ° C.
- הכן 500 בינוני מיליליטר: הבינוני צריך לספק תנאים התומכים באינטראקציה בין חלבון פיתיון הממברנה וחלבונים טרף. בנוסף, ניסוי אחד צריכה להתבצע בתנאים בהם אין אינטראקציה צפויה (למשל ללא cross-linking).
- לגדל תאים המבטאים את חלבון פיתיון הקרום עם פיוז'ן סטרפטוקוקוס תג טרמינל C-מוקטור. לגרום לביטוי של חלבוני קרום פיתיון למספיק זמן.
הערה: אנו לגרום לביטוי של חלבוני פיתיון קרום חיידק בשלב מוקדם יומן (600 = 0.3) על ידי תוספת של 250 μl M 1 איזופרופיל-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) 500 מיליליטר בינוני (ריכוז סופי: 0.5 מ"מ) . כדי לאפשר ביטוי מספיק, אנחנו דגירה החיידקים עד השלב מאוחר ביומן (600 = 1.2). - להתכונן לכל תרבות שתי כוסות צנטריפוגות בהיקף מינימאלי של 300 מיליליטר כל אחד ומניח אותם על קרח.
- בצע פורמלדהיד cross-linking.
CAUTION: פורמלדהיד הוא רעיל ביותר אנו ממליצים לעבוד תחת מנדף בטיחות..- העבר את כלי התרבות תחת מנדף בטיחות. פיצול כל דגימה לשתי דוגמאות, אחד השמטת cross-linking (- X) ואחד כולל פורמלדהיד cross-linking (+ X). הוסף 4 מיליליטר 37% תמיסת פורמלדהיד לתרבות מיליליטר 250 להגיע לריכוז סופי של .0.6%.
- העבר את כלי התרבות אחורה ולגדל תאים עבור 20 דקות נוספות כמו בעבר.
- מלא תרבויותיך לתוך צינורות צנטריפוגה תחת מנדף בטיחות. איסוף תאים על ידי צנטריפוגה ב3,000 XG במשך 30 דקות.
- בטל supernatant ידי pipetting אותה בזהירות מתחת למכסה המנוע קטר בטיחות. איסוף supernatant המכיל פורמלדהיד הרעיל ולהיפטר ממנו כמו שצריך.
- על מנת להגיע לתשואה אופטימלית במהלך הכנת חלבון קרום, להכין spheroplasts הראשונה. כאן, אנו מספקים פרוטוקול להיווצרות spheroplast של חיידקים גראם שליליים:
- PreparP2 חיץ דואר (טבלה 1) מאבקת lyophilized. בעדינות לפזר 2 ליזוזים מ"ג ב0.1 M EDTA, pH 8, בצינור 1.5 מיליליטר. תמיד להכין P2 חיץ טרי ליום של הניסוי.
- הכן טריס-חיץ עם מעכבי פרוטאז (P3 חיץ). ל10 מיליליטר של טריס-חיץ, להוסיף 0.1 מיליליטר 1 M phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) (טבלת 1) לריכוז סופי של 10 מ"מ. השתמש במאגר באופן מיידי, על מנת להבטיח תפקוד תקין של PMSF כמעכב פרוטאז.
- כדורי תא גלול ב10 מיליליטר טריס-חיץ עם מעכבי פרוטאז ופתרון טרנספר לצינור חרוטי 15 מיליליטר.
- הוספת P2 חיץ מיליליטר 1 ו לדגור על קרח למשך 30 דקות.
- לאסוף spheroplasts ידי צנטריפוגה ב3,000 XG במשך 30 דקות וזורקים supernatant בזהירות.
- דגירה את כדורי spheroplast הלילה ב -20 ° C.
2. טיהור של חלבון ממברנה סטרפטוקוקוס תג (פיתיון)
- הנח גלולה spheroplast על קרח. </ Li>
- במהלך הזמן את כדורי spheroplast להפשיר על קרח, להכין 10 מיליליטר P3 חיץ עבור כל הכנת spheroplast. בעדינות לפזר מ"ג DNaseI 1 ב10 מיליליטר טריס-חיץ. הוסף 0.1 מיליליטר PMSF M 1 רק לפני השימוש.
- Resuspend את הכדור ב 6 מיליליטר P3 מוכן טרי. Sonicate המדגם ארבע פעמים ל1 דקות ברציפות על קרח עם הפסקה 1 דקות בין כל פרץ, במטרה לשבש spheroplasts.
- צנטריפוגה המדגם XG ב 10,000 במשך 10 דקות לפסולת תא קציר. מעביר את supernatant באמצעות פיפטה לצינור ultracentrifuge.
- גלולה שבריר הקרום ב100,000 XG במשך 30 דקות. שטוף את הכדור בזהירות בטריס-חיץ ללא פירוקה. ייבש את הצינור עם ממחטת נייר (למשל קלינקס). הימנע מלהפריע גלולה בכל עת.
- Resuspend את הכדור (= קרום) בזהירות ב1 מיליליטר טריס-חיץ. השתמש aliquot 20 μl כדי לקבוע את ריכוז החלבון על ידי assay BCA למשל. בשלב זה, את הקרומים ניתן הלם קפוא בliחנקן פאונד ומאוחסנים ב -80 ° C.
3. טיהור של סטרפטוקוקוס תג חלבון ממברנה פיתיון ו- SDS
- לנרמל את ריכוז החלבון של שבריר הקרום עד 5 מ"ג / מיליליטר עם טריס-חיץ. קח 2.5 מיליליטר שבריר קרום (5 מ"ג / מיליליטר) בצינור ultracentrifuge ולהוסיף 0.25 מיליליטר של 20% טריטון X-100 להגיע לריכוז סופי של 2%, על מנת solubilize החלבונים בממברנה. הוספת מוט מיקרו מגנטי ומערבבים על קרח במשך שעה 1.
הערה: למרות שבאופן כללי יש לנו תוצאות טובות באמצעות טריטון X-100 כחומר ניקוי, זה יכול להיות שימושי כדי לשנות את חומר הניקוי לאופטימיזציה. במובן זה, יש לנו תוצאות הטובות ביותר עם אלו חומרי ניקוי המשמשים לטיהור תפקודית של חלבון פיתיון קרום בהתאמה. - בעת ביצוע שלב 3.1, להכין 50 מיליליטר חיץ E W ו 5 מיליליטר חיץ מ( טבלה 1). מלא את 10 מיליליטר 5x להתרכז W חיץ 50 מיליליטר ולהוסיף 150 μl 20% טריטון X-100.
- למלא 1 מיליליטר 5x buffeתרכיז r E ל10 מיליליטר ולהוסיף 30 μl 20% טריטון X-100. לאזן את זרימת עמודה הכבידה superflow סטרפטוקוקוס-Tactin 1 מיליליטר עם 8 וו מיליליטר החיץ
שים לב: זה חיוני כדי להוסיף את חומר הניקוי המשמש לsolubilization בריכוז של פי 10 מעל הריכוז הקריטי micelle (CMC) בכל חיץ במהלך הליך הטיהור.
- למלא 1 מיליליטר 5x buffeתרכיז r E ל10 מיליליטר ולהוסיף 30 μl 20% טריטון X-100. לאזן את זרימת עמודה הכבידה superflow סטרפטוקוקוס-Tactin 1 מיליליטר עם 8 וו מיליליטר החיץ
- הסר את מוט המייקר מגנטי ממדגם solubilization וultracentrifuge ב100,000 XG במשך 30 דקות, עד גלולה שבריר הקרום מסיס. הסר את supernatant באמצעות פיפטה לטיהור נוספת.
- טען את supernatant לעמודה. הפעל את העמודה רק עם זרימת כוח הכבידה. לשטוף את העמודה עם 5 מיליליטר החיץ וו חזור על שלב זה הכביסה 5x.
- Elute חלבוני פיתיון קרום עם 1 מיליליטר חיץ א 'חזור על שלב elution זה 4x.
- להתרכז שברים elution 2, 3, ו4-300 μl עם יחידת מסנן צנטריפוגלי.
- מערבבים 200 μl של כל דגימה עם 50 μl 5x SDS-PAGטעינת צבע E. פיצול כל הכנה ב125 aliquots μl. מרתיחים aliquot אחד מכל הכנה ל20 דקות ב 95 מעלות צלזיוס, כדי להפוך קישורים צולבים פורמלדהיד. בואו דגימות להתקרר לRT לפחות 10 דקות על גבי ספסל.
- טען 30 μl מכל מדגם לנתיב יחיד של polyacrylamide ג'ל מתאים לimmunoblotting. השתמש סמן משקל מולקולרי prestained להתמצאות הטובה ביותר ולהפעיל-SDS 10.
4. Immunoblot ניתוח לאישור שותפי אינטראקציה
- ברגע שצעד 3.8 הושלם, חלבוני העברה לממברנה ניטרוצלולוזה על ידי למשל semidry.
- לחסום את הקרום כדי למנוע תיוג נוקב. הכן את חיץ חסימה על ידי שקילת אלבומין בסרום שור (BSA) כדי להשיג במשקל של 3% לכל נפח שבנאגר מלוח טריס בתוספת סופי ריכוז 0.05% 20-Tween (TBS-T). השתמש בנפח מספיק של חיץ חסימה כדי לכסות את הממברנה. לחסום את הקרום עבור שעה 1 ב RT.
- לדללnd דגירה הנוגדן הראשון הספציפי חלבון טרף כרגיל. השתמש בנוגדן HRP צמוד כנוגדן השני.
- לפתח immunoblot באמצעות ערכת זיהוי chemiluminescent עם רגישות גבוהה. לנטר את האות באמצעות הליך עיבוד סרט קלאסי או ציוד הדמיה דיגיטלי.
5. ניסויי NanoLC-ESI-MS/MS רזולוציה גבוהה לזהות שותפי אינטראקציה
- במקרה שאין נוגדן ספציפי זמין עבור חלבון הטרף או שותפי אינטראקציה ידועים צריך להיות מזוהה, השתמש ספקטרומטריית מסה (MS) לצורך זיהוי. על מנת למנוע זיהום קרטין, השתמש ג'לי precasted להפרדת חלבונים.
- כסף להכתים-SDS באמצעות ערכת צביעת MS-תואם על פי הפרוטוקול של היצרן. לבצע את כל שלבי הצביעה ושטיפה במיכלי זכוכית.
- להקות ובהתאמה בלו לנתח אלה על ידי LC ברזולוציה גבוהה / 9 טרשת נפוצה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניתוח עמוד שדרת קרום מאפשר שיתוף הטיהור של חלבונים בממברנה ושותפי חלבון transiently אינטראקציה. שיתוף הטיהור מושגת על ידי השימוש בפורמלדהיד סוכן cross-linking. שני פרמטרים הם קריטיים כדי למנוע קישורים צולבים נוקבים: ריכוז הפורמלין וזמן cross-linking. השימוש מספק, אך לא מוגזם של פורמלדהיד בקלות יכול להיות נשלט על ידי immunoblotting. ניתן להפריד קומפלקסי חלבונים פורמלדהיד צולבים על ידי רתחה, אך לא על ידי טיפול SDS. לפיכך, הם יכולים להיות דמיינו לאחר סופג של חלבון פיתיון הקרום מתויג סטרפטוקוקוס ככתם בחלקו העליון של חיסון הכתם של מדגם unboiled.
תוצאת נציג assay ממברנה עמוד השדרה, הכוללים את כל הבקרות הנדרשות, מוצגת באיור 2. כמו חלבון פיתיון CpxA חלבון קרום נפרד מEscherichia coli שימש 6,11. CpxA הוא קינאז חיישן והוא מורכבתחום חיישן N-מסוף עם שני תחומים הטרנסממברני (TMD) שילוב תחום גדול extracytoplasmic חיישן ותחום בטרמינל C-שמור ביותר cytoplasmic קטליטי 12. לאחר גירוי, CpxA מפעיל CpxR רגולטור תגובה מאותו המקור שלה. CpxR הופעל מפזר את לתווך את התגובה. לממברנה עמוד השדרה, דלקת התג היה התמזגו לC-הסופית של CpxA (CpxA סטרפטוקוקוס). CpxA סטרפטוקוקוס צולבים לחלבונים אחרים או מתחמי חלבון מזוהה ככתם במדגם שטופלה פורמלדהיד unboiled (איור 2, קו 1 מול השורה 3) מצביע על cross-linking מספיק. יתר על כן, אינטראקציה בין חלבונים ישיר של CpxA סטרפטוקוקוס עם CpxR מאותו מקור רגולטור תגובת החלבון כמו חלבון הטרף היא רק להבחין בנוכחות של פורמלדהיד (איור 2, קו 2 מול שורת 4) תומכת את הספציפיות של פורמלדהיד cross-linking.
תוצאת נציג של ניתוח ממברנה עמוד שדרה היא מוצגת in איור 3. דוגמאות המקבילות לאלו של איור 2 היו כסף מוכתם. החץ מסמן להקה שהיא ספציפי למדגם מבושל. בשל הרקע, ניתוח MS זיהה גם חלבונים אחרים מלבד CpxR 6. לכן, המדגם הלא פורמלדהיד טופל תמיד צריך להיות מנותח, כדי להקצות את רעשי רקע ושותף של אינטראקציה ספציפית.
טבלה 1: חוצצים וחומרים כימיים הנדרשים לקרום עמוד שדרה.
| חיץ / מגיב / בינוני | ריכוז עבודה | הערה | |
|---|---|---|---|
| LB | 10 גרם Tryptone תמצית שמרים 5 גרם 10 גרם NaCl עד 1 ליטר, כדי להתאים את pH 7.0 | בינוני מרק לוריא | |
| IPTG | 1 M איזופרופיל-β-D-thiogalactopyranoside | 0.5 מ"מ | |
| טריס-חיץ | 20 מ"מ טריס-HCl, pH 8 | התאם ל-pH 8.0 באמצעות NaOH | |
| 0,1 M EDTA, pH 8 | 0.1 M EDTA | התאם ל-pH 8.0 באמצעות NaOH | |
| PMSF | 1 M Phenylmethylsulfonylfluoride באלכוהול איזופרופיל 100% | 10 מ"מ | PMSF הוא יציב בisopropanol 100% אך לא במים! פתרון מניות יכול להיות מאוחסן ב -20 ° C; PMSF צריך להיות מותאם לטמפרטורת חדר לפני דילול במאגר; PMSF המכיל מאגרים יש להשתמש בבתוך 10 דקות של הכנה. |
| P1 | 20 מ"מ טריס-HCl, pH 8.0 0.5 M סוכרוז | ||
| P2 | 2 מ"ג / מיליליטר ליזוזים 0.1 M EDTA, pH 7.5 | ||
| P3 | 20 מ"מ טריס-HCl, pH 8.0 10 מ"מ PMSF | השתמש היא מידately לאחר הכנה | |
| סבון נוזל | 20% טריטון X-100 | 2% לsolubilization | |
| החיץ W | מלא את 10 מיליליטר 5x להתרכז 50 מיליליטר להוסיף 150 μl 20% טריטון X-100 | 100 מ"מ טריס-HCl, pH 8.0 150 מ"מ NaCl 1 mM EDTA 0.06% טריטון X-100 | תרכיז 5x הוא חלק מסט חיץ טיהור חלבוני סטרפטוקוקוס תג (רשות השידור) |
| חיץ E | למלא 1 מיליליטר 5x להתרכז כדי 10 מיליליטר להוסיף 30 μl 20% טריטון X-100 | 100 מ"מ טריס-HCl, pH 8.0 150 מ"מ NaCl 1 mM EDTA 2.5 מ"מ Dethiobiotin 0.06% טריטון X-100 | תרכיז 5x הוא חלק מסט חיץ טיהור חלבוני סטרפטוקוקוס תג (רשות השידור) |
| טעינת צבע 5x-SDS | 0.3125 M טריס-HCl, pH 6.8 10% SDS 0.5 M DTT גליצרול 50% |
איור 1. תרשים זרימה של הליך ממברנה עמוד השדרה באמצעות חלבון קרום חיידקי Escherichia כחלבון פיתיון מטופלים) חיידקים. המבטאים את חלבון פיתיון קרום סטרפטוקוקוס-מתויג עם פורמלדהיד. פורמלדהיד חודר את הקרומים וקישורים צולבים לטרוף חלבונים לפיתיון קרום חלבון. ב ') חלק הקרום מוכן וחלבונים הקרום solubilized על ידי טיפול בחומרי ניקוי. בהמשך לכך, חלבוני טרף הם שיתוף מטוהר עם חלבון הפיתיון. C) קישורים צולבים פורמלדהיד מתהפכים על ידי רתחה והחלבונים מופרדים על ידי-SDS. לבסוף, חלבוני טרף נמצאים תחת פיקוח או על ידי immunoblotting (ד ') או שזוהו על ידי MS-anaתמוגה (E). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. immunoblot נציג המשמש לניטור PPI של חלבון קרום. חיידקים לייצר CpxA סטרפטוקוקוס מפלסמיד כמו חלבון פיתיון קרום, גדלו במדיום LB לOD 600 של 1 ונחשף לפורמלדהיד (CH 2 O) ל20 דקות. שבריר הקרום הפנימי הוכן, חלבוני קרום היו solubilized על ידי טיפול בחומרי ניקוי וCpxA סטרפטוקוקוס היה מטוהר (מסלולים 1 ו -2). ייצור חיידקים או CpxA סטרפטוקוקוס ללא טיפול פורמלדהיד (מסלולי 3 ו -4) או נושאים את הווקטור הריק עם טיפול פורמלדהיד (נתיבי 5 ו 5) שימשו כקבוצת ביקורת. Aliquots של כל דגימה היו מבושלים על 95 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות(נתיבים 2, 4, ו -6) להפריד חלבונים צולבים מCpxA סטרפטוקוקוס. חלבונים הופרדו ב12.5% SDS-PAGE. Immunoblotting בוצע והכתם הופרד בהתאם לגודל של CpxA סטרפטוקוקוס (51 KDA) וחלבוני הטרף המתאימים CpxR (26 KDA). שני החלקים של immunoblot הודגרו עם נוגדני polyclonal הועלו נגד CpxA וCpxR, בהתאמה. לאחר מכן, טופלו הכתמים נוספים עם נוגדנים נגד ארנב סוס (HRP) ופותחו באמצעות מצע SuperSignal מערב פיקו Chemiluminescent. ראש החץ מסמן מוצרים פגומים של CpxA. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. SDS-PAGE מוכתם כסף נציג המשמש לזיהוי של iשותף nteraction של חלבון קרום על ידי ניתוח MS. דוגמאות המקבילות לאלו של איור 2 היה כסף מוכתם. החץ מסמן להקה שנותחה על ידי ניתוח MS ואשר אישרה CpxR כשותף האינטראקציה של CpxA 5. ליין 7 מופעים מטוהרים 6 CpxR-ונתיב מופעים 8 מטוהרים 6 חלבון. CpxA-לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ניתוח עמוד שדרת ממברנה הוא גישה ביוכימית, המאפשרת אחד כדי לאשר ולזהות לשותפי שלב זה לא ידוע אינטראקציה של חלבונים בממברנה. עמוד שדרת קרום משלבת in vivo cross-linking ידי פורמלדהיד עם טיהור של חלבון פיתיון קרום סטרפטוקוקוס מתויג. שילוב עם immunoblotting מאפשר האישור של שותפי אינטראקציה ניבאו (איור 2). בנוסף, שילוב עם ניתוח MS מאפשר זיהוי של שותפי אינטראקציה לא ידועים (איור 3). עבור שניהם היישומים, אין דרישה לשינוי חלבון הטרף שלך. יתר על כן, ממברנה עמוד השדרה היא רגיש מספיק כדי לאפשר זיהוי של חלבוני טרף אנדוגני 6.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול אופטימיזציה עבור חלבוני קרום של חיידקי גרם שלילי. המעטפה של חיידקי גרם שלילי מפרידה בין הציטופלסמה מהסביבה ובעלי, בנוסףקרום cytoplasmic, קרום חיצוני וsacculus murein. לפיכך, הפרוטוקול שלנו כולל את ההסרה של הקרום החיצוני וsacculus murein, וכתוצאה מכך spheroplasts מה שנקרא. מכיוון שפרוטוקולים כאלה זמינים עבור רוב סוגי תאים, הפרוטוקול שלנו צריך להיות ישים עבור רוב החלבונים בממברנה. בנוסף, את הנקודות הבאות צריכים להיחשב.
קודם כל, מספר העותק של הווקטור המשמש לייצור יתר של חלבון פיתיון קרום צריך להיות מאוזנת בין רמה גבוהה כדי לאפשר טיהור חלבוני קרום מספיק ורמה נמוכה כדי למנוע אינטראקציות נוקבות
שנית, עבור חלק מחלבוני קרום היתוך N-מסוף יכול להיות יותר אופטימלי מאשר היתוך C-מסוף. בשני המקרים, את הפונקציונליות של ההיתוך צריכה להיות מאושרת על ידי טרנס שלמה.
פרוטוקולים שלישיים, אחרים זיקת טיהור הם גם תואמים עם ניתוח MS לאחר מכן, כגון טיהור דגל וטיהור טנדם זיקה (TAP). אנחנו מעדיפים סטרפטוקוקוס התג השני בגלל גודלו הקטן שלה עם רק 8 חומצות אמינו (WSHPQFEK).
הרביעית, הריכוז של פורמלדהיד המשמש את זמן cross-linking צריך להיות מותאם כדי למנוע cross-linking הנוקב. שימוש מספק אך לא מוגזם של פורמלדהיד יכול להיות פיקוח על ידי immunoblotting של דגימות unboiled כיחס בין צולבים וחלבון פיתיון קרום nonlinked (איור 2). חלבונים צולבים נודדים ככתם בחלקו העליון של immunoblot. חלבונים בלתי צמודים נודדים כמו חלבון שלא טופל. היחס בין צולבים וחלבון לא צמוד צריך להיות בערך 3:1.
חמישית, אין "חומר ניקוי כללי" עבור כל החלבונים בממברנה לsolubilization. לפיכך, במקרים מסוימים חומר הניקוי המתאים לsolubilization של חלבון פיתיון הקרום צריך להיות נחוש. ובכך, חומר הניקוי שנבחר חייב להיות תואם עם קולום סטרפטוקוקוס התגn.
לבסוף, הליך צביעת כסף צריך להיות בקנה אחד עם ניתוח MS שלאחר מכן. ערכות צביעת כסף תואמות MS זמינות מהספקים שונים. אנחנו השתמשנו אלה שונים עם תוצאות טובות להשוואה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש לנו מה למסור.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מענקים של דויטשה Forschungsgemeinschaft GraKo1121, Hu1011/2-1 וSFB940 לSH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Formaldehyde | Roth | 4979.1 | Should not be older than one year |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| Micromagnetic rod | Roth | 0955.2 | 5 mm in length, 2 mm in diameter |
| Triton X-100 | Roth | 6683.1 | standard detergent for solubilization |
| n-Dodecyl-β-maltoside | Glycon | D97002-C | the best detergent to solubilze CpxA |
| 1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column | IBA | 2-1207-050 | |
| Strep-tag protein purification buffer set | IBA | 2-1002-001 | Contains buffer W and buffer E |
| Amicon Ultra-4 centrifugal filter | Millipore | UFC803024 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate | Pierce | 34080 | |
| SilverQuest Silverstaining kit | Invitrogen | LC6070 | |
| FireSilver Staining Kit | Proteome Factory | P-S-2001 | |
| Ultracentrifuge |
References
- Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. L. Predicting transmembrane protein topology with a hidden markov model: application to complete genomes. J. Mol. Biol. 305, 567-580 (2001).
- Bakheet, T. M., Doig, A. J. Properties and identification of human protein drug targets. Bioinformatics. 25, 451-457 (2009).
- Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M.
- Daley, D. O. The assembly of membrane proteins into complexes. Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 420-424 (2008).
- Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. Histidine kinases and response regulators in networks. Curr. Opin. Microbiol. 15, 118-124 (2012).
- Müller, V. S., Jungblut, P. R., Meyer, T. F., Hunke, S. Membrane-SPINE: An improved method to identify protein-protein interaction partners of membrane proteins in vivo. Proteomics. 11, 2124-2128 (2011).
- Herzberg, C., et al. SPINE: A method for the rapid detection and analysis of protein-protein interactions in vivo. Proteomics. 7, 4032-4035 (2007).
- Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions. J. Mass Spectrom. 43, 699-715 (2008).
- Hernandez, P., Müller, M., Appel, R. D. Automated protein identification by tandem mass spectrometry: Issues and strategies. Mass Spectrom. Rev. 25, 235-254 (2006).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Hunke, S., Keller, R., Müller, V. S. Signal integration by the Cpx-envelope stress system. FEMS Microbiol. Lett. 326, 12-22 (2012).
- Weber, R. F., Silverman, P. M. The Cpx proteins of Escherichia coli K12 : Structure of the CpxA polypeptide as an inner membrane component. J. Mol. Biol. 203, 467-478 (1988).
