Summary
Eine biochemische Ansatz beschrieben, um die in vivo-Protein-Protein-Interaktionen (PPI) der Membranproteine zu identifizieren. Das Verfahren kombiniert Proteinvernetzung, Affinitätsreinigung und Massenspektrometrie, und ist an fast jedem Zelltyp oder Organismus. Mit diesem Ansatz wird auch die Identifizierung der transienten PPI möglich.
Abstract
Membranproteine sind essentiell für die Lebensfähigkeit der Zellen und sind daher wichtige therapeutische Ziele 3.1. Da sie in den Komplexen 4 funktionieren, sind Methoden zur Identifizierung und Charakterisierung ihrer Wechselwirkungen notwendig 5. Zu diesem Zweck haben wir die Membran Strep-Protein-Wechselwirkung Experiment genannt Membran-Dorn 6. Diese Technik kombiniert in vivo Vernetzen unter Verwendung des reversiblen Vernetzungsmittel Formaldehyd mit Affinitätsreinigung von Strep-tag eine Membran Köderprotein. Während des Verfahrens sind vernetzte Beuteproteine mit der Membran Köderprotein co-gereinigt und anschließend durch Kochen getrennt. Daher können zwei wichtige Aufgaben bei der Analyse von Protein-Protein-Interaktionen (PPI) von Membranproteinen mit Membran-Dorn ausgeführt werden: erstens die Bestätigung einer vorgeschlagenen Interaktionspartner durch Immunoblotting, und zweitens die Identifizierung neuer Interaktionspartner von Massenspektrometrie-Analyse . Außerdem, selbst low Affinität, sind vorübergehende PPI durch diese Technik nachweisbar. Schließlich ist Membran-SPINE anpassungsfähig an nahezu jeden Zelltyp, so dass es zutreffend als ein leistungsfähiges Werkzeug, um Screening PPI von Membranproteinen zu identifizieren.
Introduction
Um die Funktion eines Proteins zu verstehen, ist es wichtig, seinen Interaktionspartnern kennen. Mehreren klassischen Techniken zur Identifizierung von Interaktionspartnern von löslichen Proteinen zur Verfügung. Jedoch sind diese Techniken nicht ohne weiteres übertragbar, um Proteine aufgrund ihrer hydrophoben Natur 4 Membran. Um diese Einschränkung zu überwinden, haben wir die Membran Strep-Protein-Wechselwirkung Experiment (Membran-spine) 6 entwickelt. Es basiert auf der Methode DORN, die nur für lösliche Proteine geeignet war 7 basiert.
Membran-SPINE profitiert von zwei Vorteile des Vernetzungsmittels Formaldehyd: erste Formaldehyd kann leicht durchdringen Membranen und erzeugt eine genaue Momentaufnahme der Interaktom einer lebenden Zelle 8 daher. Zweitens kann Formaldehyd vernetzt durch Kochen 9 umgekehrt werden. Hier werden diese beiden Vorteile verwendet, um nicht nur dauerhaft, sondern auch vorübergehende PPI Membran Prote identifizierenIns 6.
Kurz gesagt, ein Strep-Tag an den C-Terminus des integralen Membranköderprotein fusioniert ist. Zellen, die den Membranköderprotein exprimieren, werden mit Formaldehyd vernetzt Beute-Proteine an die Membran Köder-Protein (Fig. 1) inkubiert. Modifikationen der Beuteproteine sind nicht erforderlich. Als nächstes wird die Membranfraktion bereit. Daher sind Membranproteine durch Detergens-Behandlung und Köder-Proteine sind mit ihrer Beute Proteinen unter Verwendung von Affinitätsreinigung gereinigt Zusammenarbeit gelöst. Anschließend wird die Vernetzung durch Kochen umgekehrt, und der Köder und deren koeluierte Beute-Proteine werden durch SDS-PAGE getrennt. Schließlich kann Beuteproteine durch Immunoblot-Analyse bzw. Massenspektroskopie identifiziert werden.
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Protocol
Hinweis: Detaillierte Informationen zur Puffer im Protokoll angegeben ist in Tabelle 1 verfügbar.
1. Fixierung von Protein-Protein-Interaktionen durch Formaldehyd-Vernetzungs in lebenden Zellen
- Um zu beginnen vorzubereiten Wachstumsmedien, Stammlösungen und Puffer P1
- Bereiten 500 ml Medium: Das Medium sollte Bedingungen, die die Wechselwirkung zwischen Membran Köderprotein und Beuteproteine unterstützen. Darüber hinaus sollte ein Versuch unter Bedingungen, bei denen keine Wechselwirkung zu erwarten ist (z. B. ohne Vernetzung) durchgeführt werden.
Anmerkung: Wir vergleichen Protein-Protein-Wechselwirkungen bei gestressten und nicht gestressten Bakterien. Daher bereiten wir 500 ml Luria Bertani (LB)-Medium (Tabelle 1), die wir mit einem Stress-Induktionsmittel (zB 0,5 M NaCl) in einem 2 l-Erlenmeyerkolben zu ergänzen. Zur Steuerung verwenden wir normale LB-Medium mit 0,17 M NaCl (pH 7,0). - Vorbereitung Tris-Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0) und 0,1 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), pH-Wert 8,0-Stammlösung (Tabelle 1).
- Bereiten Puffer P1. Auflösen Saccharose auf eine Endkonzentration von 0,5 M Tris-Puffer. Sterilisieren Puffer P1 durch Filtration und speichern sie bei 4 ° C
- Bereiten 500 ml Medium: Das Medium sollte Bedingungen, die die Wechselwirkung zwischen Membran Köderprotein und Beuteproteine unterstützen. Darüber hinaus sollte ein Versuch unter Bedingungen, bei denen keine Wechselwirkung zu erwarten ist (z. B. ohne Vernetzung) durchgeführt werden.
- Wachsen Zellen, die den Membranköderprotein mit einem C-terminalen Strep-tag-Fusions von einem Vektor exprimiert. Induzieren die Expression von Membranproteinen Köder für eine ausreichende Zeit.
Anmerkung: Wir induzieren die Expression der bakteriellen Membran Köderproteine in einem frühen logarithmischen Phase (A 600 = 0,3) durch Zugabe von 250 ul 1 M isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) bis zu 500 ml Medium (Endkonzentration: 0,5 mM) . Um eine ausreichende Expression zu ermöglichen, Inkubation wir die Bakterien bis in die späten Log-Phase (A 600 = 1.2). - Bereiten Sie für jede Kultur zwei Zentrifugenbecher mit einem Mindestvolumen von jeweils 300 ml und legen sie auf Eis.
- Führen Formaldehyd-Vernetzung.
CAUTION: Formaldehyd ist giftig Wir empfehlen unter einem Sicherheits Abzug arbeiten..- Übertragen Sie das Kulturgefäß unter einer Abzugshaube Sicherheit. Aufgeteilt jede Probe in zwei Proben, eine Auslassung Vernetzungs (- X) und eine darunter Formaldehydvernetzungs (X +). 4 ml 37% ige Formaldehydlösung und 250 ml Kultur bis zu einer Endkonzentration von 0,6% zu erreichen.
- Übertragen Sie die Kulturgefäße zurück und wachsen Zellen für weitere 20 min wie zuvor.
- Füllen Sie Ihre Kulturen in die Zentrifugenröhrchen unter einem Sicherheits Abzug. Sammle die Zellen durch Zentrifugation bei 3.000 × g für 30 min.
- Überstand verwerfen durch vorsichtiges Pipettieren es unter einer Abzugshaube Sicherheit. Sammeln giftige Formaldehyd-haltigen Überstand und entsorgen Sie es ordnungsgemäß.
- Um eine optimale Ausbeute bei der Membranproteinpräparat zu erreichen, bereiten erste Spheroplasten. Hier stellen wir ein Protokoll für Sphäroblastenbildung von Gram-negativen Bakterien:
- Prepare Puffer P2 (Tabelle 1) von lyophilisierten Pulvers. Leicht auflösen 2 mg Lysozym in 0,1 M EDTA, pH 8, in einem 1,5-ml-Röhrchen. Immer frisch zubereiten Puffer P2 für den Tag des Experiments.
- Vorbereitung Tris-Puffer mit Protease-Inhibitor (Puffer P3). Zu 10 ml Tris-Puffer, 0,1 ml 1 M Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) (Tabelle 1) bis zu einer Endkonzentration von 10 mM. Verwenden Sie die Puffer sofort, um die ordnungsgemäße Funktion der PMSF als Protease-Inhibitor zu gewährleisten.
- Resuspendieren Zellpellets in 10 ml Tris-Puffer mit Protease-Inhibitor und Transferlösung in ein 15 ml konischen Röhrchen.
- 1 ml Puffer P2 und Inkubation auf Eis für 30 min.
- Sammeln Spheroplasten durch Zentrifugation bei 3000 × g für 30 min und Überstand verwerfen sorgfältig.
- Sphäroplast die Pellets über Nacht bei -20 ° C inkubieren
2. Reinigung von Strep-Tag Membrane Protein (Bait)
- Zeigen Sphäroplast Pellet auf Eis. </ Li>
- Während der Zeit, die Sphäroplast Pellets auf Eis auftauen, bereiten 10 ml Puffer P3 für jeden Spheroplastenpräparation. Vorsichtig lösen 1 mg DNaseI in 10 ml Tris-Puffer. 0,1 ml 1 M PMSF kurz vor der Verwendung.
- Das Pellet in 6 ml frisch zubereitet P3. Beschallen die Probe viermal für 1 min kontinuierlich auf Eis mit 1 min Pause zwischen jedem Burst, um die Sphäroplasten zu stören.
- Zentrifugieren Sie die Probe bei 10.000 g für 10 min bis zur Ernte Zelltrümmer. Den Überstand mit einer Pipette, ein Ultrazentrifugenröhrchen.
- Pellet die Membranfraktion bei 100.000 × g für 30 min. In Tris-Puffer waschen das Pellet vorsichtig, ohne dass es sich auflöst. Trocknen Sie das Rohr mit einem Papiertuch (zB Kleenex). Vermeiden Sie die Pelletjederzeit zu stören.
- Das Pellet (= Membranen) vorsichtig in 1 ml Tris-Puffer. Verwenden ein 20 ul Aliquot der Proteinkonzentration durch zB BCA-Assay zu bestimmen. Bei diesem Schritt können die Membranen Schock li gefrorenquid Stickstoff und bei -80 ° C gelagert
3. Reinigung von Strep-Tag Membrane Protein-Köder-und SDS-PAGE
- Normalisierung der Proteinkonzentration der Membranfraktion zu 5 mg / ml mit Tris-Puffer. Nehmen Sie 2.5 ml Membranfraktion (5 mg / ml) in ein Ultrazentrifugenröhrchen und Zugabe von 0,25 ml 20% Triton X-100 auf eine Endkonzentration von 2% zu erreichen, um die Membranproteine zu solubilisieren. Fügen Sie eine Mikro-Magnetstab und rühren auf Eis für 1 Stunde.
Anmerkung: Obwohl im Allgemeinen haben wir gute Ergebnisse mit Triton X-100 als Detergens, könnte es sinnvoll, die Reinigungsmittel für die Optimierung zu ändern. In dieser Hinsicht haben wir die besten Ergebnisse mit solchen Reinigungsmitteln für die Reinigung von funktionellen jeweiligen Membran Köderprotein verwendet. - Während der Ausführung von Schritt 3.1, bereiten 50 ml Puffer B und 5 ml von Puffer E (Tabelle 1). Füllen Sie 10 ml 5x Puffer W Konzentrat auf 50 ml und fügen Sie 150 ul 20% Triton X-100.
- Füllen Sie 1 ml 5x buffer E-Konzentrat auf 10 ml und fügen Sie 30 ul 20% Triton X-100. Ins Gleichgewicht einer 1 ml Strep-Tactin Superflow Schwerkraftsäule mit 8 ml Puffer W.
Hinweis: Es ist wichtig, um das Reinigungsmittel zur Solubilisierung in einer Konzentration 10-fach über der kritischen Mizellenkonzentration (CMC) in jedem Puffer während des Reinigungsverfahrens verwendet hinzuzufügen.
- Füllen Sie 1 ml 5x buffer E-Konzentrat auf 10 ml und fügen Sie 30 ul 20% Triton X-100. Ins Gleichgewicht einer 1 ml Strep-Tactin Superflow Schwerkraftsäule mit 8 ml Puffer W.
- Entfernen der mikromagnetischen Stab aus der Solubilisierung Probe und Ultrazentrifuge bei 100.000 × g für 30 min, um das unlösliche Membranfraktion zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette zur weiteren Reinigung.
- Laden der Überstand auf die Säule. Führen Sie die Spalte nur mit Schwerkraft. Die Säule wird mit 5 ml Puffer W. Wiederholen Sie diesen Waschschritt 5x.
- Eluiere Membranproteine Köder mit 1 ml Puffer E. Wiederholen Sie diesen Schritt 4x Elution.
- Konzentrieren Elutionsfraktionen 2, 3, und 4 bis 300 ul einer Zentrifugalfiltereinheit.
- Mischungs 200 &mgr; l jeder Probe mit 50 &mgr; l 5 × SDS-PAGE Ladefarbstoff. Split jedes Präparat in 125 ul Aliquots. Man kocht ein Aliquot von jedem Präparat 20 Minuten lang bei 95 ° C zu Formaldehyd vernetzt umkehren. Lassen Proben abkühlen auf RT für mindestens 10 Minuten auf der Bank der Spitze.
- Last 30 ul von jeder Probe auf eine einzelne Spur einer Polyacrylamid-Gel für Immunoblotting. Verwenden Sie eine vorgefärbte Molekulargewichtsmarker für beste Orientierung und führen SDS-PAGE-10.
4. Immunoblot-Analyse, um Interaktionspartner bestätigen
- Sobald der Schritt 3.8 abgeschlossen ist, die Übertragung Proteine auf eine Nitrocellulose-Membran durch halbtrockenen zB.
- Blockieren der Membran, um unspezifische Markierung zu verhindern. Vorbereitung Blockierungspuffer durch Wiegen Rinderserumalbumin (BSA) zu 3% Gewicht pro Volumen in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit einer endgültigen Konzentration von 0,05% Tween-20 (TBS-T) ergänzt erzielen. Verwenden Sie eine ausreichende Menge an Blockierungspuffer, um die Membran zu decken. Sperrung der Membran für 1 h bei RT.
- Verdünnen Sie einnd bebrüten die Beute Protein-spezifischen ersten Antikörper wie gewohnt. Verwenden ein HRP-verknüpften Antikörper als der zweite Antikörper.
- Entwickeln Sie die Immunoblot mit einem Chemilumineszenz-Nachweis-Kit mit hoher Empfindlichkeit. Überwachung des Signals mit einem klassischen Film Veredelung oder Digital-Imaging-Ausrüstung.
5. NanoLC-ESI-MS/MS Hohe Auflösung Experimente zur Wechselwirkung Partner identifizieren
- Im Fall, dass keine spezifischen Antikörper für die Beuteprotein oder unbekannte Interaktionspartner verfügbar gemacht werden sollen, verwenden Sie die Massenspektrometrie (MS) zur Identifizierung. Um Keratin Kontamination zu verhindern, verwenden vorgefertigte Gele für die Protein-Trennung.
- Silberfärbung der SDS-PAGE unter Verwendung eines MS-kompatibel Färbekit nach dem Protokoll des Herstellers. Führen Sie alle Färbe-und Waschschritte in Glastanks.
- Verbrauch jeweiligen Bands und analysieren diese durch hochauflösende LC / MS-9.
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Representative Results
Membran SPINE-Analyse erlaubt die Co-Reinigung von Membranproteinen und transient interacting protein Partnern. Die Co-Reinigung unter Verwendung der Vernetzungsmittel Formaldehyd erreicht. Zwei Parameter sind wichtig, um unspezifische Vernetzungen verhindern: die Formaldehyd-Konzentration und der Vernetzungszeit. Die ausreichende, aber nicht übermäßige Verwendung von Formaldehyd kann leicht durch Immunoblotting gesteuert werden. Formaldehyd vernetztem Protein-Komplexe durch Kochen aber nicht durch SDS-Behandlung abgetrennt werden. Sie können daher nach dem Blotten des Strep-markierten Membranköderprotein als Abstrich in dem oberen Abschnitt des immun Blot eines ungekochten Probe sichtbar gemacht werden.
Ein repräsentatives Ergebnis einer Membran DORN Assays, einschließlich aller notwendigen Kontrollen, ist in Fig. 2 dargestellt. Als Köderprotein das integrale Membranprotein CpxA von Escherichia coli wurde 6,11 eingesetzt. CpxA eine Sensorkinase und besteht aus einemN-terminale Domäne Sensor mit zwei Transmembrandomänen (TMD) Integration einer großen extrazytoplasmatische Sensor-Domäne und eine C-terminale cytoplasmatische hoch konservierte katalytische Domäne 12. Nach der Stimulation aktiviert CpxA seinen zugehörigen Antwortregulator CpxR. Aktiviert CpxR diffundiert aus, um die Reaktion zu vermitteln. Für Membran DORN wurde das Strep-Tag an den C-Terminus von CpxA (CpxA-Strep) fusioniert. CpxA-Strep zu anderen Proteinen oder Proteinkomplexe als Abstrich in der ungekochte Formaldehyd behandelten Probe (Abbildung 2, Zeile 1 gegen Zeile 3), die ausreichende Vernetzung erkannt vernetzt. Darüber hinaus ist eine direkte Protein-Protein-Interaktion von CpxA-Strep mit seinen zugehörigen Antwortregulator-Protein CpxR als Beuteprotein nachweisbar nur in Gegenwart von Formaldehyd (Abbildung 2, Zeile 2 gegen Linie 4), der die Spezifität der Formaldehyd-Vernetzung.
Ein repräsentatives Ergebnis einer Membran SPINE Analyse vorgestellt in 3. Proben, die denen von Fig. 2 wurden silbergefärbt. Der Pfeil markiert eine Bande, die spezifisch für die Probe gekocht wird. Aufgrund der Hintergrund, MS-Analyse auch neben CpxR 6 weitere Proteine identifiziert. Daher sollte das nicht-Formaldehyd behandelten Probe immer ausgewertet werden, um Hintergrundgeräusche und spezifische Interaktionspartner zuordnen.
Tabelle 1: Puffer und Reagenzien für die Membran-SPINE erforderlich.
| Puffer / Reagenzien / Medium | Arbeitskonzentration | Kommentar | |
|---|---|---|---|
| LB | 10 g Trypton 5 g Hefeextrakt 10 g NaCl zu 1 L, pH-Wert auf 7,0 | Luria Broth-Medium | |
| IPTG | 1 M Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid | 0,5 mM | |
| Tris-Puffer | 20 mM Tris-HCl, pH 8, | PH-Wert auf 8,0 mit NaOH | |
| 0,1 M EDTA, pH 8, | 0,1 M EDTA | PH-Wert auf 8,0 mit NaOH | |
| PMSF | 1 M Phenylmethylsulfonylfluorid in Isopropanol 100% | 10 mM | PMSF ist stabil in 100% Isopropanol, aber nicht im Wasser! Stammlösung bei -20 ° C gelagert werden; PMSF hat auf Raumtemperatur vor der Verdünnung in Puffer angepasst werden; PMSF enthaltenden Puffer sollten innerhalb von 10 min nach der Herstellung verwendet werden. |
| P1 | 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 0,5 M Sucrose | ||
| P2 | 2 mg / ml Lysozym in 0,1 M EDTA, pH 7,5 | ||
| P3 | 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 10 mM PMSF | Verwenden Sie sofortbar nach Vorbereitung | |
| Waschmittel | 20% Triton X-100 | 2% für die Solubilisierung | |
| Buffer W | Füllen Sie 10 ml 5x konzentrieren, um 50 ml Add 150 ul 20% Triton X-100 | 100 mM Tris-HCl, pH 8,0 150 mM NaCl 1 mM EDTA, 0,06% Triton X-100 | 5x Konzentrat ist Teil der Strep-Tag Proteinreinigung Puffersatz (IBA) |
| Puffer E | Füllen Sie 5x 1 ml Konzentrat auf 10 ml Add 30 ul 20% Triton X-100 | 100 mM Tris-HCl, pH 8,0 150 mM NaCl 1 mM EDTA 2,5 mM Dethiobiotin 0,06% Triton X-100 | 5x Konzentrat ist Teil der Strep-Tag Proteinreinigung Puffersatz (IBA) |
| 5x SDS-PAGE-Ladepuffer | 0,3125 M Tris-HCl, pH 6,8 10% SDS 0,5 M DTT 50% Glycerin |
Fig. 1 ist. Flussdiagramm der Membran-SPINE Verfahren unter Verwendung eines Escherichia coli Membranprotein als Köder-Protein. A) Bakterien die Strep-markierten Membran Köder-Protein exprimieren, werden mit Formaldehyd behandelt. Formaldehyd dringt Membranen und Querverbindungen Beute-Proteine an die Membran Köderprotein. B) Die Membranfraktion wird vorbereitet und Membranproteine werden durch Detergens-Behandlung gelöst. Anschließend werden Beuteproteine mit dem Köderprotein co-gereinigt. C) Formaldehyd vernetzt werden umgekehrt durch Kochen und Proteine durch SDS-PAGE getrennt. Schließlich werden Beuteproteine entweder durch Immunoblotting (D) überwacht oder von MS-ana identifiziertLyse (E). Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
2. Verwendet, um ein PPI eines Membranproteins überwacht repräsentativen Immunoblot. Bakterien produziert CpxA-Strep von einem Plasmid als Membranköderprotein, wurden in LB-Medium bis zu einer OD 600 von 1 gezüchtet und Formaldehyd (CH 2 O) für 20 min ausgesetzt. Der innere Membranfraktion wurde hergestellt, Membranproteine wurden durch die Behandlung mit Detergenz solubilisiert und CpxA-Strep gereinigt wurde (Spuren 1 und 2). Bakterien, die entweder CpxA-Strep ohne Formaldehyd-Behandlung (Spuren 3 und 4) oder Tragen des leeren Vektor mit Formaldehyd-Behandlung (Bahnen 5 und 5) diente als Kontrolle. Aliquote jeder Probe wurden bei 95 ° C für 20 min gekocht(Bahnen 2, 4 und 6), um vernetzte Proteine aus CpxA-Strep trennen. Proteine wurden in einem 12,5% SDS-PAGE getrennt. Immunoblotting wurde nach der Größe CpxA-Strep (51 kDa) und den jeweiligen Beuteproteine CpxR (26 kDa) durchgeführt und der Blot wurde abgetrennt. Die beiden Teile des Immunoblots wurden mit polyklonalen Antikörpern gegen CpxA und CpxR angehoben inkubiert sind. Anschließend wurden die Blots mit einem weiteren Anti-Kaninchen-Pferd (HRP)-Antikörper behandelt und unter Verwendung des Supersignal West-Pico Chemilumineszenz-Substrat entwickelt. Die Pfeilspitze markiert Abbauprodukte von CpxA. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
3. Repräsentative silbergefärbten SDS-PAGE für die Identifizierung eines i verwendetnteraction Partner eines Membranproteins durch MS-Analyse. Proben, die denen von Fig. 2 wurden mit Silber gefärbt. Der Pfeil markiert eine Band, die von MS-Analyse untersucht wurde und CpxR als Interaktionspartner von CpxA 5 bestätigt. Lane 7 zeigt gereinigt CpxR-His 6 und Spur 8 zeigt gereinigt CpxA-His 6-Protein. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
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Discussion
Membran SPINE Analyse ist ein biochemischer Ansatz, ermöglicht ein, um zu bestätigen und um zu diesem Punkt unbekannte Interaktionspartner von Membranproteinen zu identifizieren. Membran SPINE vereint in vivo Vernetzung durch Formaldehyd mit Reinigung eines Strep-markierten Membranköderprotein. Die Kombination mit Immunoblotting erleichtert den Nachweis von vorhergesagten Wechselwirkungspartner (Fig. 2). Zusätzlich wird die Verbindung mit MS-Analyse erlaubt die Identifikation unbekannter Interaktionspartner (Abbildung 3). Für beide Anwendungen ist es nicht erforderlich zu modifizieren Beute-Protein. Darüber hinaus ist die Membran DORN ausreichend empfindlich, um die Detektion von endogenen Beuteproteine 6 zu ermöglichen.
Hier stellen wir ein Protokoll für Membranproteine von gram-negativen Bakterien optimiert. Der Umschlag von gram-negativen Bakterien trennt das Cytoplasma von der Umgebung und besitzen neben derCytoplasmamembran, einer äußeren Membran und ein Mureinsacculus. Daher umfasst unser Protokoll die Entfernung der äußeren Membran und der Mureinsacculus, was zu so genannten Spheroplasten. Da solche Protokolle sind für die meisten Zelltypen verfügbar sind, sollte unser Protokoll für die meisten Membranproteine anpassungsfähig sein. Darüber hinaus sollten die folgenden Punkte berücksichtigt werden.
Erstens, die Kopienzahl des Vektors zur Überproduktion der Membran Köderprotein ist zwischen einem hohen Niveau ausgewogen sein, um eine ausreichende Membranproteinreinigung und eine geringe unspezifische Wechselwirkungen zu vermeiden erlauben
Zweitens, für einige Membranproteine eine N-terminale Fusion kann optimaler als eine C-terminale Fusion sein. In beiden Fällen sollte die Funktionalität des Fusions von trans-Komplementierung bestätigt werden.
Drittens anderen Affinitätsreinigung Protokolle sind auch mit anschließender MS-Analyse kompatibel ist, wie z. B. Reinigung und FLAGTandem-Affinitätsreinigung (TAP). Wir bevorzugen die Strep-tag II wegen seiner geringen Größe mit nur 8 Aminosäuren (WSHPQFEK).
Viertens sollte die Konzentration von Formaldehyd und der Vernetzungszeit optimiert werden, um unspezifische Vernetzung zu verhindern. Eine ausreichende, jedoch nicht übermäßige Verwendung von Formaldehyd durch Immunoblotting von ungekochten Proben als das Verhältnis zwischen vernetzten und nonlinked Membran Köder-Protein (Fig. 2) überwacht werden. Vernetzte Proteine wandern als ein Abstrich im oberen Teil des Immunoblots. Un-Linked-Proteine wandern als unbehandelte Protein. Das Verhältnis zwischen vernetzten und unverknüpften Proteins sollte etwa 3:1 betragen.
Fünftens gibt es keine "allgemeine Reinigungsmittel" für alle Membranproteine zur Solubilisierung. Daher wird in einigen Fällen das entsprechende Reinigungsmittel für die Solubilisierung der Membran Köderprotein zu bestimmen. Dabei muss die gewählte Reinigungsmittel mit dem Strep-Tag colum kompatibel seinn.
Schließlich weist der Silberfärbungsverfahren mit anschließender MS-Analyse kompatibel zu sein. MS kompatible Silberfärbung Kits sind von verschiedenen Anbietern erhältlich. Wir haben verschiedene, vergleichbar mit guten Ergebnissen.
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Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Fördermittel der Deutschen Forschungsgemeinschaft GraKo1121, Hu1011/2-1 und SFB940 SH unterstützt
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Formaldehyde | Roth | 4979.1 | Should not be older than one year |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| Micromagnetic rod | Roth | 0955.2 | 5 mm in length, 2 mm in diameter |
| Triton X-100 | Roth | 6683.1 | standard detergent for solubilization |
| n-Dodecyl-β-maltoside | Glycon | D97002-C | the best detergent to solubilze CpxA |
| 1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column | IBA | 2-1207-050 | |
| Strep-tag protein purification buffer set | IBA | 2-1002-001 | Contains buffer W and buffer E |
| Amicon Ultra-4 centrifugal filter | Millipore | UFC803024 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate | Pierce | 34080 | |
| SilverQuest Silverstaining kit | Invitrogen | LC6070 | |
| FireSilver Staining Kit | Proteome Factory | P-S-2001 | |
| Ultracentrifuge |
References
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