Summary
En biokemisk fremgangsmåde er beskrevet til at identificere in vivo protein-protein interaktioner (PPI) af membranproteiner. Fremgangsmåden kombinerer protein tværbinding affinitetsoprensning og massespektrometri, og kan tilpasses til næsten enhver celletype eller organisme. Med denne fremgangsmåde bliver det muligt selv identifikation af forbigående PPI.
Abstract
Membranproteiner er essentielle for cellelevedygtighed, og er derfor vigtige terapeutiske mål 1-3. Da de fungerer i komplekser 4, er det nødvendigt 5 metoder til at identificere og karakterisere deres samspil. Til dette formål har vi udviklet Membrane Strep-protein-interaktion eksperiment, kaldet Membrane-SPINE 6. Denne teknik kombinerer vivo tværbinding ved hjælp af den reversible tværbinder formaldehyd med affinitetsoprensning af et Strep-mærket membran bait protein. Under proceduren tværbundne prey-proteiner co-oprenset med membranen bait-proteinet og efterfølgende separeret ved kogning. Derfor kan to store opgaver skal udføres, når man analyserer protein-protein interaktioner (PPI) af membranproteiner hjælp Membran-SPINE: første, bekræftelse af en foreslået interaktion partner ved immunoblotting, og for det andet, identifikation af nye interaktions partnere ved massespektrometrianalyse . Selv low affinitet forbigående PPI er påviselige ved denne teknik. Endelig Membrane-SPINE kan tilpasses til næsten enhver celletype, hvilket gør den anvendelig som et kraftfuldt screeningsværktøj til at identificere producentprisindeks for membranproteiner.
Introduction
For at forstå funktionen af et protein, er det vigtigt at kende dens interaktionspartnere. Flere klassiske teknikker er til rådighed til identifikation af interaktions partnere opløselige proteiner. Men disse teknikker er ikke let overføres til membranproteiner på grund af deres hydrofobe natur 4. For at overvinde denne begrænsning, har vi udviklet Membrane Strep-protein interaktion eksperiment (Membrane-SPINE) 6.. Den er baseret på SPINE metode, som kun var egnet til opløselige proteiner 7.
Membran-Spine fordelene ved to fordele ved den tværbindingsmiddel formaldehyd: For det første kan formaldehyd let trænge membraner, og derfor frembringer et præcist øjebliksbillede af interactome i en levende celle 8. For det andet, kan formaldehyd tværbindinger vendes ved kogning 9. Her er disse to fordele bruges til at identificere ikke kun permanente, men også forbigående producentprisindeks membran proteins 6.
Kort fortalt er en Strep-mærke fusioneret til den C-terminale ende af integral membran agn protein. Celler, der udtrykker membran agn protein inkuberes med formaldehyd, som tværbindinger bytte proteiner til membranen agn protein (figur 1). Modifikationer af prey-proteiner er ikke nødvendig. Dernæst membranfraktionen er forberedt. Derfor er membranproteiner opløseliggøres ved detergentbehandling og agn proteiner co-oprenset med sine prey-proteiner ved hjælp af affinitetsoprensning. Efterfølgende tværbinding vendes ved kogning og agn og dens co-eluerede prey-proteiner adskilles ved SDS-PAGE. Endelig kan prey-proteiner identificeres ved immunoblotanalyse eller massespektrometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Detaljerede oplysninger om buffere er angivet i protokollen findes i tabel 1.
1.. Fiksering af protein-protein interaktioner med formaldehyd Cross-sammenkædning i levende celler
- Til at begynde at forberede vækst medier, stamopløsninger og buffer P1
- Forbered 500 ml medium: Mediet bør give vilkår, som understøtter samspillet mellem membranen bait protein og prey-proteiner. Desuden bør et eksperiment udføres under betingelser, hvor der forventes ingen interaktion (fx uden tværbinding).
Bemærk: Vi sammenligner protein-protein interaktioner i stressede og ikke-stressede bakterier. Derfor er vi klar 500 ml Luria Bertani (LB) medium (tabel 1), som vi supplerer med en stress-inducerende middel (fx 0,5 M NaCl) i en 2 L Erlenmeyer-kolbe. For kontrol, bruger vi normalt LB-medium med 0,17 M NaCl (pH 7,0). - Forbered Tris-puffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0) og 0,1 M ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), pH 8,0 stamopløsningen (tabel 1).
- Forbered buffer P1. Opløses saccharose til en endelig koncentration på 0,5 M i Tris-puffer. Steriliseres buffer P1 ved filtrering og opbevar det ved 4 ° C.
- Forbered 500 ml medium: Mediet bør give vilkår, som understøtter samspillet mellem membranen bait protein og prey-proteiner. Desuden bør et eksperiment udføres under betingelser, hvor der forventes ingen interaktion (fx uden tværbinding).
- Dyrk celler, der udtrykker membran agn protein med en C-terminal Strep-tag fusion fra en vektor. Inducere ekspressionen af membran bait-proteiner i et tilstrækkeligt tidsrum.
Bemærk: Vi inducere ekspression af bakterielle membran bait proteiner ved tidlig log-fase (A600 = 0,3) ved tilsætning af 250 pi 1 M isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) til 500 ml medium (slutkoncentration: 0,5 mM) . At give tilstrækkelig udtryk, vi inkuberes bakterierne indtil den sene log-fase (A 600 = 1,2). - Forbered dig hver kultur to centrifuge bægre med et minimum volumen på 300 ml hver og placere dem på is.
- Udfør formaldehyd krydsbinding.
CAUTION: Formaldehyd er meget giftigt Vi anbefaler arbejder under en sikkerheds emhætte..- Overfør kultur skibe under en sikkerheds emhætte. Split hver prøve i to prøver, én udelade krydsbinding (- X) og et herunder formaldehyd krydsbinding (+ X). Tilsæt 4 ml 37% formaldehyd-opløsning til 250 ml kultur for at nå en slutkoncentration på 0,6%.
- Overfør dyrkningsbeholderne tilbage og dyrke celler i yderligere 20 min som før.
- Fyld dine kulturer i centrifugeglassene under en sikkerheds emhætte. Saml cellerne ved centrifugering ved 3.000 x g i 30 minutter.
- Kassér supernatanten ved forsigtigt at pipettere det op under en sikkerheds emhætte. Saml giftige formaldehyd-holdige supernatant og bortskaffe det korrekt.
- For at nå den optimale udbytte under membranproteinet forberedelse, forberede spheroplaster først. Her giver vi en protokol for spheroplast dannelse af Gram-negative bakterier:
- Prepare puffer P2 (tabel 1), fra lyofiliseret pulver. Opløses forsigtigt 2 mg lysozym i 0,1 M EDTA, pH 8, i et 1,5 ml rør. Forberede Altid buffer P2 frisk for dagen af forsøget.
- Forbered Tris-buffer med proteasehæmmer (buffer P3). Til 10 ml af Tris-puffer, tilsættes 0,1 ml 1 M phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) (tabel 1) til en slutkoncentration på 10 mM. Brug bufferen umiddelbart at sikre en korrekt funktion af PMSF som proteaseinhibitor.
- Resuspender cellepellets i 10 ml Tris-buffer med proteasehæmmer og overføre opløsningen til en 15 ml konisk rør.
- Tilsæt 1 ml puffer P2 og inkuber på is i 30 minutter.
- Saml sfæroplaster ved centrifugering ved 3.000 x g i 30 minutter og kassér supernatanten omhyggeligt.
- Inkuber sfæroplast pellets natten over ved -20 ° C.
2. Oprensning af Strep-tag Membrane Protein (Bait)
- Placer spheroplast pellet på is. </ Li>
- I den tid sfæroplast pellets optøs på is, forberede 10 ml buffer P3 for hver sfæroplast præparat. Opløses forsigtigt 1 mg DNaseI i 10 ml Tris-buffer. Tilføj 0,1 ml 1 M PMSF, lige før brug.
- Resuspender pellet i 6 ml frisk fremstillet P3. Sonikeres prøven fire gange i 1 min kontinuerligt på is med 1 min pause mellem hver burst, for at forstyrre sfæroplaster.
- Centrifugeres prøven ved 10.000 xg i 10 minutter til høst cellerester. Supernatanten overføres ved hjælp af en pipette til et ultracentrifugerør.
- Pelletere membranfraktionen ved 100.000 x g i 30 minutter. Vask pelleten omhyggeligt i Tris-puffer uden at opløse det. Tør glasset med en papirserviet (f.eks Kleenex). Undgå at forstyrre pelleten til enhver tid.
- Resuspender pellet (= membraner) forsigtigt i 1 ml Tris-buffer. Anvend en 20 pi alikvot til bestemmelse af proteinkoncentrationen ved fx BCA assay. På dette trin kan membranerne chok frosset i liquid nitrogen og opbevaret ved -80 ° C.
3. Oprensning af Strep-tag Membrane Bait Protein-og SDS-PAGE
- Normalisere proteinkoncentration membranfraktionen til 5 mg / ml med Tris-puffer. Tag 2,5 ml membranfraktion (5 mg / ml) i et ultracentrifugerør, og der tilsættes 0,25 ml 20% Triton X-100 for at nå en slutkoncentration på 2%, med henblik på at solubilisere membranproteiner. Tilføj en mikro-magnetisk stang og rør på is i 1 time.
Bemærk: Selvom vi generelt har gode resultater ved hjælp af Triton X-100 som detergent, kan det være nyttigt at ændre vaskemiddel til optimering. I denne henseende har vi de bedste resultater med disse detergenter anvendes til funktionel oprensning af den respektive membran agn protein. - Under udførelsen af trin 3.1, forberede 50 ml buffer W og 5 ml buffer E fra (tabel 1). Fyld op til 10 ml 5x buffer W koncentrat til 50 ml, og der tilsættes 150 pi 20% Triton X-100.
- Fyld op 1 ml 5x buffer E koncentratet til 10 ml og tilsættes 30 pi 20% Triton X-100. Ækvilibrer en 1 ml Strep-Tactin superflow tyngdekraft flow søjle med 8 ml buffer W.
Bemærk: Det er vigtigt at tilføje, der anvendes til solubilisering i en koncentration 10 gange over den kritiske micellekoncentration (CMC) i en puffer under oprensningsproceduren detergent.
- Fyld op 1 ml 5x buffer E koncentratet til 10 ml og tilsættes 30 pi 20% Triton X-100. Ækvilibrer en 1 ml Strep-Tactin superflow tyngdekraft flow søjle med 8 ml buffer W.
- Fjern mikromagnetisk stang fra solubilisering prøven og ultracentrifuge ved 100.000 x g i 30 min for at pelletere fraktion uopløselig membran. Supernatanten fjernes ved hjælp af en pipette til yderligere oprensning.
- Load supernatanten til kolonnen. Kør kun kolonnen med tyngdekraften flow. Kolonnen udvaskes med 5 ml buffer W. Gentag dette vasketrin 5x.
- Eluer membran bait-proteiner med 1 ml buffer E. Gentag dette elueringstrin 4x.
- Koncentrer elueringsfraktionerne 2, 3, og 4 til 300 pi med en centrifugalfilterenhed.
- Bland 200 ul af hver prøve med 50 pi 5x SDS-PAGE lastning farvestof. Split hvert præparat i 125 ul portioner. Kog en aliquot af hvert præparat i 20 minutter ved 95 ° C, for at vende formaldehyd-tværbindinger. Lad prøverne køle ned til stuetemperatur i mindst 10 min på bænken toppen.
- Load 30 pi fra hver prøve til en enkelt bane i en polyacrylamid-gel egnet til immunoblotting. Brug en prestained molekylvægtmarkør for bedste orientering og køre SDS-SIDE 10.
4.. Immunoblotanalyse til Bekræft Interaktion Partnere
- Når trin 3.8 er afsluttet, overføre proteiner til en nitrocellulosemembran ved fx halvtør.
- Blokere membranen for at forhindre uspecifik mærkning. Forbered blokeringspuffer ved vejning bovint serumalbumin (BSA) for at opnå 3% vægt per volumen i Tris-bufret saltvand suppleret med endelig koncentration på 0,05%-20 Tween (TBS-T). Brug en tilstrækkelig mængde blokerende buffer til at dække membranen. Blokere membranen i 1 time ved stuetemperatur.
- Fortynd ennd inkuberes byttet protein specifikt første antistof som sædvanlig. Brug et HRP-bundet antistof, som det andet antistof.
- Udvikle immunblot under anvendelse af et kemiluminescerende kit detektion med høj følsomhed. Overvåg signal ved hjælp af en klassisk procedure film forarbejdning eller udstyr til digital billedbehandling.
5.. NanoLC-ESI-MS/MS høj opløsning Forsøg at identificere Interaktion Partnere
- I tilfælde af, at der ikke specifikt antistof er til rådighed for bytte-protein eller ukendte interaktionspartnere skal identificeres, anvende massespektrometri (MS) til identifikation. For at forhindre keratin kontaminering bruge precasted geler til protein separation.
- Sølvfarvning SDS-PAGE under anvendelse af en MS-kompatibel farvning kit ifølge producentens protokol. Udfør alle farvning og vasketrin i glas tanke.
- Forbrugsafgifter respektive bands og analysere disse ved høj opløsning LC / MS 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Membran SPINE analyse tillader co-oprensning af membranproteiner og transient interagerende protein partnere. Den co-oprensning opnås ved hjælp af cross-linking agent formaldehyd. To parametre er afgørende for at forhindre uspecifikke tværbindinger: formaldehydkoncentrationen og krydsbinding gang. Den tilstrækkelige, men ikke overdreven brug af formaldehyd kan let kontrolleres ved immunoblotting. Formaldehyd tværbundne protein-komplekser kan separeres ved kogning, men ikke ved SDS behandling. Derfor kan de visualiseres efter blotting af Strep-mærket membran bait protein som plet i den øverste del af immun-blot af en ukogt prøve.
Et repræsentativt resultat af en membran SPINE assay, herunder alle nødvendige kontroller, er vist i figur 2. Som lokkemad protein integreret membranprotein CpxA af Escherichia coli blev anvendt 6,11. CpxA er en sensor kinase og består af enN-terminal sensor domæne med to transmembrane domæner (TMD) integrerer en stor extracytoplasmic sensor domæne og en C-terminal stærkt konserverede cytoplasmatiske katalytisk domæne 12. Efter stimulering CpxA aktiverer dets kognate responsregulatorprotein CpxR. Aktiveret CpxR diffunderer ud for at mægle svaret. For Membrane SPINE blev Strep-mærke fusioneret til den C-terminale ende af CpxA (CpxA-Strep). CpxA-Strep tværbundet til andre proteiner eller protein-komplekser detekteres som en udstrygning i ukogt formaldehyd-behandlede prøve (fig. 2, linie 1 versus linje 3), hvilket indikerer en tilstrækkelig tværbinding. Desuden er en direkte protein-protein-interaktion CpxA-Strep med dets beslægtede responsregulatorprotein CpxR som bytte protein er kun detekterbart i nærværelse af formaldehyd (figur 2, linie 2 versus linje 4), der understøtter specificiteten af formaldehyd tværbinding.
Et repræsentativt resultat af en membran SPINE analyse præsenteres in Figur 3. Prøver svarende til dem i figur 2 var sølvfarvet. Pilen markerer et band, der er specifik for den kogte prøve. På grund af den baggrund, MS-analyse identificerede også andre proteiner foruden CpxR 6. Derfor bør det ikke-formaldehyd behandlede prøve altid skal analyseres, for at tildele baggrundsstøj og specifik interaktion partner.
Tabel 1: Buffere og reagenser, der er nødvendige for membran-SPINE.
| Buffer / Reagens / Medium | Arbejde koncentration | kommentar | |
|---|---|---|---|
| LB | 10 g trypton 5 g gærekstrakt 10 g NaCl til 1 L, justere pH til 7,0 | Luria Broth-medium | |
| IPTG | 1 M isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid | 0,5 mM | |
| Tris-buffer | 20 mM Tris-HCI, pH 8 | PH justeres til 8,0 ved anvendelse af NaOH | |
| 0,1 M EDTA, pH 8 | 0,1 M EDTA | PH justeres til 8,0 ved anvendelse af NaOH | |
| PMSF | 1 M phenylmethylsulfonylfluorid i 100% Isopropanol | 10 mM | PMSF er stabilt i 100% isopropanol, men ikke i vand! Stamopløsning kan opbevares ved -20 ° C; PMSF skal tilpasses til stuetemperatur før fortynding i puffer, PMSF buffere bør anvendes inden for 10 min efter fremstilling. |
| P1 | 20 mM Tris-HCI, pH 8,0 0,5 M Saccharose | ||
| P2 | 2 mg / ml lysozym i 0,1 M EDTA, pH 7,5 | ||
| P3 | 20 mM Tris-HCI, pH 8,0 10 mM PMSF | Brug straksdelbart efter tilberedning | |
| Vaskemiddel | 20% Triton X-100 | 2% for solubilisering | |
| Buffer W | Fyld op til 10 ml 5x koncentrat til 50 ml tilsættes 150 pi 20% Triton X-100 | 100 mM Tris-HCI, pH 8,0 150 mM NaCI 1 mM EDTA 0,06% Triton X-100 | 5x koncentrat er en del af Strep-tag proteinoprensning buffer sæt (IBA) |
| Buffer E | Fyld op 1 ml 5x koncentrat til 10 ml tilsættes 30 pi 20% Triton X-100 | 100 mM Tris-HCI, pH 8,0 150 mM NaCI 1 mM EDTA 2,5 mM dethiobiotin 0,06% Triton X-100 | 5x koncentrat er en del af Strep-tag proteinoprensning buffer sæt (IBA) |
| 5x SDS-PAGE loading dye | 0,3125 M Tris-HCI, pH 6,8 10% SDS 0,5 M DTT 50% glycerol |
Figur 1. Rutediagram for Membrane-SPINE procedure under anvendelse af en Escherichia coli-membranprotein som lokkemad protein. A) Bakterier udtrykkende Strep-mærket membran bait-protein behandles med formaldehyd. Formaldehyd trænger membraner og tværbindinger bytte proteiner til membranen bait-proteinet. B) Membranfraktionen fremstilles og membranproteiner opløseliggøres ved detergentbehandling. Efterfølgende prey-proteiner co-oprenset med agn protein. C) Formaldehyd-tværbindinger tilbageføres ved kogning og proteiner adskilles ved SDS-PAGE. Endelig prey-proteiner enten overvåges af immunoblotting (D) eller identificeres ved MS-analysis (E). Klik her for at se større billede .
Figur 2. Repræsentative immunoblot anvendes til at overvåge en PPI af membranprotein. Bakterier producerer CpxA-Strep fra et plasmid som membran bait-protein, blev dyrket i LB-medium til en OD600 på 1 og udsættes for formaldehyd (CH2O) i 20 min. Fraktionen indre membran blev fremstillet, membranproteiner blev solubiliseret ved detergentbehandling og CpxA-Strep blev oprenset (bane 1 og 2). Bakterier producerer enten CpxA-Strep uden formaldehyd behandling (bane 3 og 4), eller bærer den tomme vektor med formaldehyd behandling (bane 5 og 5) tjente som kontroller. Portioner af hver prøve blev kogt ved 95 ° C i 20 minutter(bane 2, 4 og 6) for at adskille tværbundne proteiner fra CpxA-Strep. Proteiner blev separeret på en 12,5% SDS-PAGE. Immunoblotting blev udført, og blottet blev adskilt efter størrelse CpxA-Strep (51 kDa) og de respektive prey-proteiner CpxR (26 kDa). De to dele af immunoblot inkuberet med polyklonale antistoffer rejst mod CpxA og CpxR hhv. Efterfølgende blev blots yderligere behandles med et anti-kanin hest (HRP)-antistof og udviklet ved hjælp af SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrat. Pilespidsen markerer nedbrydningsprodukter af CpxA. Klik her for at se større billede .
Figur 3. Repræsentant sølv-farvede SDS-PAGE, der anvendes til identifikation af en interaction partner i et membranprotein af MS-analyse. Prøver svarende til dem i figur 2, blev farvet med sølv. Pilen markerer et band, som blev analyseret ved MS-analyse, og som bekræftede CpxR samspillet partner CpxA 5.. Lane 7 viser renset CpxR-His 6 og bane 8 shows renset CpxA-His 6 protein. Klik her for at se større billede .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Membran SPINE analyse er en biokemisk tilgang, der gør det muligt at bekræfte og identificere til dette punkt ukendte interaktion partnere membranproteiner. Membran SPINE kombinerer in vivo krydsbinding af formaldehyd med oprensning af en Strep-mærket membran bait protein. Kombinationen med immunoblotting letter bekræftelse af forudsagte interaktionspartnere (figur 2). Derudover kombination med MS-analyse tillader identifikation af ukendte interaktion partnere (figur 3). For begge programmer, er der ikke noget krav om at ændre dit bytte protein. Desuden Membrane SPINE er tilstrækkelig følsom til at muliggøre påvisning af endogene prey-proteiner 6.
Her præsenteres en protokol optimeret til membranproteiner fra gramnegative bakterier. Konvolutten af gram-negative bakterier adskiller cytoplasma fra miljøet og besidder, i tillæg til dencytoplasmatiske membran, en ydre membran og en murein sacculus. Derfor vores protokol omfatter fjernelse af den ydre membran og murein sacculus, hvilket resulterer i såkaldte sfæroplaster. Da sådanne protokoller er tilgængelige for de fleste celletyper, bør vores protokol kunne tilpasses til de fleste membranproteiner. Derudover skal følgende punkter overvejes.
Først og fremmest kopitallet af vektor, der anvendes til at overproducere membranen agn protein har afbalanceres mellem et højt niveau for at give tilstrækkelig membranprotein oprensning og et lavt niveau for at undgå uspecifikke interaktioner
For det andet, for nogle membranproteiner en N-terminal fusion kan være mere optimale end en C-terminal fusion. I begge tilfælde bør funktionalitet fusion bekræftes af trans-komplementering.
Tredje andre affinity oprensningsprotokoller er også kompatible med efterfølgende MS-analyse, såsom FLAG oprensning ogtandem affinitetsoprensning (TAP). Vi foretrækker Strep-tag II på grund af sin lille størrelse med kun 8 aminosyrer (WSHPQFEK).
For det fjerde bør koncentrationen af formaldehyd anvendes, og de tværbindende tid optimeres for at forhindre uspecifik krydsbinding. Kan overvåges En tilstrækkelig, men ikke overdreven brug af formaldehyd ved immunblot af ukogte prøver som forholdet mellem tværbundet og nonlinked membran bait-protein (figur 2). Tværbundne proteiner migrerer som en udstrygning i den øvre del af immunoblot. Un-forbundne proteiner migrerer som ubehandlet protein. Forholdet mellem tværbundet og sammenkædet protein bør være omkring 3:1.
For det femte er der ingen "generelle detergent" for alle membranproteiner til solubilisering. Derfor, i nogle tilfælde passende detergent til opløseliggørelse af membranen agn protein skal bestemmes. Derved skal den valgte detergent være forenelig med Strep-tag-søjlen.
Endelig sølvfarvning procedure skal være forenelig med efterfølgende MS-analyse. MS kompatible Sølvfarvning kits er tilgængelige fra forskellige leverandører. Vi brugte forskellige dem med sammenlignelige gode resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af tilskud fra Deutsche Forschungsgemeinschaft GraKo1121, Hu1011/2-1 og SFB940 til SH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Formaldehyde | Roth | 4979.1 | Should not be older than one year |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| Micromagnetic rod | Roth | 0955.2 | 5 mm in length, 2 mm in diameter |
| Triton X-100 | Roth | 6683.1 | standard detergent for solubilization |
| n-Dodecyl-β-maltoside | Glycon | D97002-C | the best detergent to solubilze CpxA |
| 1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column | IBA | 2-1207-050 | |
| Strep-tag protein purification buffer set | IBA | 2-1002-001 | Contains buffer W and buffer E |
| Amicon Ultra-4 centrifugal filter | Millipore | UFC803024 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate | Pierce | 34080 | |
| SilverQuest Silverstaining kit | Invitrogen | LC6070 | |
| FireSilver Staining Kit | Proteome Factory | P-S-2001 | |
| Ultracentrifuge |
References
- Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. L. Predicting transmembrane protein topology with a hidden markov model: application to complete genomes. J. Mol. Biol. 305, 567-580 (2001).
- Bakheet, T. M., Doig, A. J. Properties and identification of human protein drug targets. Bioinformatics. 25, 451-457 (2009).
- Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M.
- Daley, D. O. The assembly of membrane proteins into complexes. Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 420-424 (2008).
- Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. Histidine kinases and response regulators in networks. Curr. Opin. Microbiol. 15, 118-124 (2012).
- Müller, V. S., Jungblut, P. R., Meyer, T. F., Hunke, S. Membrane-SPINE: An improved method to identify protein-protein interaction partners of membrane proteins in vivo. Proteomics. 11, 2124-2128 (2011).
- Herzberg, C., et al. SPINE: A method for the rapid detection and analysis of protein-protein interactions in vivo. Proteomics. 7, 4032-4035 (2007).
- Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions. J. Mass Spectrom. 43, 699-715 (2008).
- Hernandez, P., Müller, M., Appel, R. D. Automated protein identification by tandem mass spectrometry: Issues and strategies. Mass Spectrom. Rev. 25, 235-254 (2006).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Hunke, S., Keller, R., Müller, V. S. Signal integration by the Cpx-envelope stress system. FEMS Microbiol. Lett. 326, 12-22 (2012).
- Weber, R. F., Silverman, P. M. The Cpx proteins of Escherichia coli K12 : Structure of the CpxA polypeptide as an inner membrane component. J. Mol. Biol. 203, 467-478 (1988).
