Summary
Биохимический подход описан обнаружить прижизненно белок-белковых взаимодействий (PPI) мембранных белков. Метод сочетает в себе белок сшивание, аффинной очистки и масс-спектрометрии, и адаптируется к почти любой тип клеток или организма. При таком подходе даже определение переходных ИПП становится возможным.
Abstract
Мембранные белки имеют важное значение для жизнеспособности клеток и, следовательно, важные терапевтические мишени 1-3. Поскольку они функционируют в комплексах 4, методы выявления и характеризуют их взаимодействия необходимы 5. С этой целью мы разработали Стрептококковое-белка эксперимент взаимодействия мембраны, называется мембраной SPINE 6. Этот метод сочетает в естественных условиях сшивающего помощью обратимой сшивающего линкера формальдегида с аффинной очистки с Strep-меченого белка мембраны приманки. Во время процедуры сшитые добычи протеины совместно очищались с приманкой мембранного белка и затем разделяют путем кипячения. Таким образом, две основные задачи могут быть выполнены при анализе белок-белковых взаимодействий (ИЦП) мембранных белков с помощью мембранного позвоночника: во-первых, подтверждение предложенной партнером взаимодействия иммуноблоттингом, и, во-вторых, выявление новых партнеров взаимодействия с помощью масс-спектрометрического анализа . Более того, даже лой близость, переходные ИПП обнаруживаются по этой методике. Наконец, мембрана-SPINE адаптируется к почти любой тип клеток, что делает его применимым в качестве мощного инструмента скрининга для выявления ИЦП мембранных белков.
Introduction
Чтобы понять функцию белка важно знать своих партнеров взаимодействия. Несколько классические методы доступны для идентификации взаимодействия партнеров растворимых белков. Однако эти методы не легко передаваться с мембранными белками из-за их гидрофобной природы 4. Чтобы преодолеть это ограничение, мы разработали Стрептококковое-белка взаимодействия эксперимент мембраны (мембраны позвоночника) 6. Он основан на методе позвоночника, который был пригоден только для растворимых белков 7.
Мембрана-ПОЗВОНОЧНИКА выгоды от двух преимуществ сшивающего агента формальдегида: во-первых, формальдегид легко проникают мембраны и, следовательно, создает точную снимок интерактома живой клетки 8. Во-вторых, формальдегид поперечные связи может быть отменено путем кипячения 9. Здесь, эти два преимущества используются для идентификации не только постоянные, но и переходных ИЦП мембранного защмодули 6.
Вкратце, Strep-тег слит с С-концом интегрального мембранного белка приманки. Клетки, экспрессирующие приманки мембранный белок инкубируют с формальдегидом, который сшивает охотятся белки с белком мембраны приманки (рис. 1). Модификации хищных белков не нужны. Далее, мембранную фракцию готов. Таким образом, мембранные белки, солюбилизируются лечения моющего средства и наживки белки совместно очищались с добычей белков с использованием аффинной очистки. Впоследствии сшивки восстанавливается посредством кипячения, и приманка и его со-элюированные белки добычи разделены SDS-PAGE. Наконец, добычи протеины могут быть идентифицированы путем иммуноблот-анализа или масс-спектрометрии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Подробная информация о буферах, указанных в протоколе имеется в таблице 1.
1. Фиксация белок-белковых взаимодействий на Формальдегид Сшивающие в живых клетках
- Для начала подготовить роста средств массовой информации, растворы и буфера P1
- Приготовления 500 мл среды: среда должна обеспечить условия, которые поддерживают взаимодействие между мембраной приманки белка и кормовых белков. Кроме того, один эксперимент следует проводить в условиях, когда никакое взаимодействие не ожидается (например, без сшивки).
Примечание: Мы сравниваем белок-белковых взаимодействий в напряженных и не напряженных бактерий. Таким образом, мы приготовления 500 мл Luria Bertani (LB) среды (табл. 1), что мы с дополнением стрессовых агента (например, 0,5 М NaCl) в колбе Эрленмейера 2 л. Для контроля мы используем нормальную среду LB с 0,17 М NaCl (рН 7,0). - Подготовка Трис-буфера (20 мМ Трис-HCl, рН 8,0) и 0,1 М этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), рН 8,0 раствор (табл. 1).
- Подготовка буфера P1. Растворить сахарозу до конечной концентрации 0,5 М в Трис-буфере. Стерилизация буфера P1 путем фильтрации и хранить его при температуре 4 ° С.
- Приготовления 500 мл среды: среда должна обеспечить условия, которые поддерживают взаимодействие между мембраной приманки белка и кормовых белков. Кроме того, один эксперимент следует проводить в условиях, когда никакое взаимодействие не ожидается (например, без сшивки).
- Расти клетки, экспрессирующие приманки мембранный белок с С-концевым Strep-метки синтеза из вектора. Индуцируют экспрессию мембранных белков приманки в течение достаточного времени.
Примечание: Мы индуцируют экспрессию бактериальных белков мембраны приманки на стадии раннего журнала (600) = 0,3 добавлением 250 мкл 1 М изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (IPTG) до 500 мл среды (конечная концентрация: 0,5 мм) . Чтобы обеспечить достаточное выражение, не инкубировать бактерии до этапа позднего журнала (600 = 1.2). - Подготовка к каждой культуры двух центрифуг стаканы с минимальным объемом 300 мл каждая и разместить их на льду.
- Выполните формальдегида сшивания.
КАУАЦИЯ: Формальдегид является высокотоксичным Мы рекомендуем работать под безопасности вытяжной шкаф..- Перенести культуры судно под безопасности вытяжной шкаф. Сплит каждую пробу в двух образцах, один минуя сшивания (- X) и один в том числе формальдегид сшивания (+ X). Добавить 4 мл 37% раствора формальдегида в 250 мл культуры, чтобы достичь конечной концентрации 0,6%.
- Перенесите культуры сосуды назад и роста клеток в течение дополнительных 20 мин, как и раньше.
- Заполните культур в центрифужные пробирки под безопасности вытяжной шкаф. Сбор клеток путем центрифугирования при 3000 х г в течение 30 мин.
- Удалите супернатант тщательно пипетки его под безопасности вытяжной шкаф. Сбор токсичных формальдегидсодержащего супернатант и утилизируйте его должным образом.
- Для достижения оптимального выхода во время подготовки мембранный белок, подготовить сферопластов в первую очередь. Здесь мы обеспечиваем протокол для формирования сферопластного грамотрицательных бактерий:
- Подгое буфер Р2 (табл. 1) из лиофилизированного порошка. Осторожно растворить 2 мг лизоцима в 0,1 М ЭДТА, рН 8, в 1,5 мл трубки. Всегда готовьте буфера Р2 недавно на день эксперимента.
- Подготовка Трис-буфер с ингибитора протеазы (буфер Р3). К 10 мл Трис-буфера, добавляют 0,1 мл 1 М фенилметилсульфонилфторида (PMSF) (табл. 1) до конечной концентрации 10 мМ. Немедленно использовать буфер, чтобы обеспечить надлежащее функционирование PMSF в качестве ингибитора протеазы.
- Ресуспендируют осадок клеток в 10 мл Трис-буфере с ингибитором протеаз и переноса раствора в 15 мл коническую пробирку.
- Добавить 1 мл буфера Р2 и инкубировать на льду в течение 30 мин.
- Сбор сферопластов центрифугированием при 3000 х г в течение 30 мин и осторожно отбросить супернатант.
- Инкубируйте сферопластного гранулы в течение ночи при -20 ° С.
2. Очистка Стрептококковое-тега мембранный белок (Bait)
- Наведите сферопластного осадок на льду. </ Li>
- В течение времени, когда гранулы сферопластного оттаивания на льду, подготовить 10 мл буфера Р3 для каждого сферопластного препарата. Осторожно растворить 1 мг ДНКазой I в 10 мл Трис-буфера. Добавить 0,1 мл 1 M PMSF непосредственно перед использованием.
- Ресуспендируют гранул в 6 мл свежеприготовленный P3. Образец обрабатывают ультразвуком в четыре раза в течение 1 мин непрерывно на льду с 1 мин паузы между каждого пакета, чтобы нарушить сферопластов.
- Центрифуга образца при 10000 х г в течение 10 мин до сбора мусора клеток. Передача супернатант с помощью пипетки в ультрацентрифужную пробирку.
- Гранул мембранной фракции при 100000 х г в течение 30 мин. Тщательно Вымойте гранул в Трис-буфера без его растворения. Высушите трубку с бумажной салфеткой (например Kleenex). Избегать нарушая гранул в любое время.
- Ресуспендируют гранул (= мембраны) тщательно в 1 мл Трис-буфера. Используйте 20 мкл аликвоты для определения концентрации белка, например, путем BCA анализом. На этом этапе, мембраны могут быть заморожены в шок Liфунтов стерлингов азота и хранили при -80 ° С.
3. Очистка Стрептококковое-тега Мембрана Bait белка и SDS-PAGE
- Нормализация концентрации белка в мембранной фракции по 5 мг / мл с Трис-буфером. Возьмем 2,5 мл мембранной фракции (5 мг / мл) в ультрацентрифужную пробирку и добавляют 0,25 мл раствора 20% Тритона Х-100 до конечной концентрации 2%, для солюбилизации мембранных белков. Добавить микро-магнитный стержень и перемешивают на льду в течение 1 часа.
Примечание: Хотя в целом у нас есть хорошие результаты, используя Тритон Х-100, как моющее средство, было бы полезно, чтобы изменить моющее средство для оптимизации. В этом отношении, мы имеем лучшие результаты с этими моющих средств, используемых для функционального очистки соответствующего белка мембраны приманки. - При выполнении шаг 3.1, подготовить 50 мл буфера W и 5 мл буфера Е из (табл. 1). Заполнение 10 мл буфера 5х W концентрат до 50 мл и добавляют 150 мкл 20% Triton X-100.
- Пополнить 1 мл 5x bufféR E концентрат до 10 мл и добавляют 30 мкл 20% Тритона Х-100. Равновесие стрептококковая-Tactin сверхпоток тяжести столбец 1 мл потока с 8 мл буфера W.
Примечание: Важно, чтобы добавить моющее средство используется для растворения в концентрационном 10 раз выше критической концентрации мицеллообразования (ККМ) в любом буфере во время процедуры очистки.
- Пополнить 1 мл 5x bufféR E концентрат до 10 мл и добавляют 30 мкл 20% Тритона Х-100. Равновесие стрептококковая-Tactin сверхпоток тяжести столбец 1 мл потока с 8 мл буфера W.
- Удалить микро-магнитный стержень из образца солюбилизации и ультрацентрифуге при 100000 х г в течение 30 мин, для осаждения нерастворимого мембранной фракции. Удалить супернатант с помощью пипетки для дальнейшей очистки.
- Загрузить супернатанта на колонку. Запустите колонку только с самотеком. Промыть колонку 5 мл буферной W. Повторите этот этап промывки 5x.
- Элюции мембранные приманки белки с 1 мл буфера Е. Повторите эту элюирования шаг 4x.
- Концентрат элюированных фракций 2, 3 и 4 до 300 мкл с помощью центробежного фильтра.
- Смешайте 200 мкл каждого образца с 50 мкл 5х SDS-PAGE загрузка краситель. Сплит каждого препарата в 125 мкл аликвоты. Варить одну аликвоту каждого препарата в течение 20 мин при 95 ° С, в обратном формальдегида поперечные связи. Пусть образцы остыть до комнатной температуры в течение не менее 10 мин на верхней скамейке.
- Нагрузка 30 мкл из каждого образца для одной полосы из полиакриламидного гель-пригодной для иммуноблоттинга. Используйте предварительно окрашенный маркер молекулярного веса за лучший ориентации и запустить SDS-PAGE 10.
4. Иммуноблот Анализ для подтверждения Взаимодействие партнеров
- После того, как шаг 3.8 завершена, передачи белков на нитроцеллюлозную мембрану, например, путем полусухое.
- Блок мембраны для предотвращения неспецифической маркировки. Подготовка блокирующем буфере путем взвешивания бычьего сывороточного альбумина (BSA), чтобы достичь 3% вес на единицу объема в Трис-буферном солевом растворе с добавлением конечного концентрации 0,05% Tween-20 (TBS-T). Использование достаточный объем блокирующем буфере для покрытия мембраны. Блок мембрану в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Развестий инкубировать добычей белка специфическую первое антитело, как обычно. Использование HRP-антитела, связанный качестве второго антитела.
- Разработка иммуноблот с использованием хемилюминесцентного набора определения с высокой чувствительностью. Контролировать сигнал, используя классическую процедуру обработки пленки или цифрового оборудования обработки изображений.
5. NanoLC-ESI-MS/MS высокого разрешения Эксперименты для идентификации Взаимодействие партнеров
- В случае, что ни специфическое антитело не доступен для белка добычи или неизвестных партнеров взаимодействия должны быть определены, использовать масс-спектрометрии (MS) для идентификации. В целях предотвращения кератина загрязнения, использовать precasted гели для разделения белков.
- Серебряная пятно SDS-PAGE с использованием MS-совместимая окрашивания комплект в соответствии с протоколом производителя. Выполните все окрашивания и стиральные шаги в стеклянных баков.
- Акцизные соответствующие группы и проанализировать эти побочные высокого разрешения ЖХ / МС 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Анализ Мембрана SPINE позволяет совместное очистку мембранных белков и временно взаимодействующий белок партнеров. Совместное очистка достигается с помощью сшивающего агента формальдегид. Два параметра имеют решающее значение для предотвращения неспецифических перекрестных связей: концентрация формальдегида и времени сшивание. Достаточными, но не чрезмерное использование формальдегида можно легко контролировать с помощью иммуноблоттинга. Формальдегид сшитые белковые комплексы могут быть отделены путем кипячения, но не путем обработки SDS. Следовательно, они могут быть визуализированы после блоттинга из Strep-меченого белка мембраны приманки как мазок в верхней части иммунной-блоттинга с некипяченого образца.
Представитель результатом анализа Мембрана позвоночника, включая все необходимые элементы управления, представлена на рисунке 2. Как приманки белка интегральный мембранный белок CpxA кишечной палочки был использован 6,11. CpxA является киназа датчик и состоит изN-концевой домен датчик с двумя трансмембранных доменов (ПРО ТВД), объединяющих большое extracytoplasmic домен датчика и С-концевой высоко консервативный цитоплазматический каталитический домен 12. После стимуляции CpxA активизирует свою родственный регулятор ответ CpxR. Активированный CpxR диффундирует от стать посредником в ответ. Для мембраны позвоночника, Стрептококковое-тег был присоединен к С-концу CpxA (CpxA-Strep). CpxA-Strep сшитый с другими белками или белковых комплексов определяется как мазок в сырую обработанной формальдегидом образца (рис. 2, строка 1 в сравнении с линией 3), указывающий достаточное поперечное сшивание. Кроме того, непосредственное взаимодействие белок-белок CpxA-Strep с его родственного белка регулятора ответ CpxR как белок добычи только обнаруживаемый в присутствии формальдегида (рис. 2, строка 2 в сравнении с линией 4) поддержки специфичность формальдегида сшивки.
Представитель результатом анализа Мембрана ПОЗВОНОЧНИКА представлена ян Рисунок 3. Образцы, соответствующие тем фиг.2 были окрашивали серебром. Стрелка показывает группу, которая специфична для кипяченой образца. Благодаря фоновом режиме, МС-анализ также определены другие белки, кроме CpxR 6. Таким образом, не-формальдегид обработанный образец всегда должны быть проанализированы, чтобы назначить фоновый шум и конкретного партнера взаимодействия.
Таблица 1: Буферы и реагенты, требуемые для мембранного позвоночника.
| Буфер / Реагент / Средний | Работа концентрация | комментарий | |
|---|---|---|---|
| LB | 10 г Триптон 5 г дрожжевого экстракта 10 г NaCl в 1 л, отрегулировать рН до 7,0 | Лурия бульон среднего | |
| ИПТГ | 1 M изопропил-β-D-тиогалактопиранозид | 0,5 мМ | |
| Трис-буфера | 20 мМ Трис-HCl, рН 8 | Регулировка рН до 8,0 с помощью NaOH | |
| 0,1 М ЭДТА, рН 8 | 0,1 М ЭДТА | Регулировка рН до 8,0 с помощью NaOH | |
| ПМСФ | 1 М фенилметилсульфонилфторида в 100% изопропанола | 10 мМ | PMSF стабилен в 100% изопропанола, но не в воде! Маточный раствор можно хранить при -20 ° С; PMSF должна быть адаптирована к комнатной температуре перед разбавлением в буфере; PMSF, содержащий буферы должны быть использованы в течение 10 мин препарата. |
| P1 | 20 мМ Трис-HCl, рН 8,0 0,5 М сахарозы | ||
| Р2 | 2 мг / мл лизоцима в 0,1 М ЭДТА, рН 7,5 | ||
| P3 | 20 мМ Трис-HCl, рН 8,0 10 мМ PMSF | Используйте немедленноже после подготовки | |
| Моющее средство | 20% Triton X-100 | 2% для растворения | |
| Буфер Вт | Пополнить 10 мл 5x сконцентрироваться до 50 мл добавить 150 мкл 20% Triton X-100 | 100 мМ Трис-HCl, рН 8,0 150 мМ NaCl 1 мМ ЭДТА 0,06% Triton X-100 | 5x концентрат является частью Стрептококковое-тега очистки белков буфера набора (МБА) |
| Буфер Е | Пополнить 1 мл 5x сконцентрироваться до 10 мл добавить 30 мкл 20% Тритона Х-100 | 100 мМ Трис-HCl, рН 8,0 150 мМ NaCl 1 мМ ЭДТА 2,5 мМ Dethiobiotin 0,06% Triton X-100 | 5x концентрат является частью Стрептококковое-тега очистки белков буфера набора (МБА) |
| 5x SDS-PAGE загрузки красителя | 0,3125 М Трис-HCl, рН 6,8 10% SDS 0,5 М DTT 50% глицерина |
Рисунок 1. Блок-схема процедуры Мембранная ПОЗВОНОЧНИКА помощью мембранный белок кишечной палочки в качестве наживки белка. A) Бактерии, выражающие Стрептококковое-тегами мембраны приманки белка обрабатывают формальдегидом. Формальдегид проникает мембраны и поперечные связи добычу белки в мембрана приманка белка. B) мембранную фракцию получают и мембранные белки солюбилизируют путем обработки детергентом. Впоследствии добычи протеины совместно очищались с белком приманки. С) формальдегида поперечные связи отменено кипения и белки разделены SDS-PAGE. Наконец, жертва белки либо контролируется иммуноблотинга (D) или определить по MS-анализис (Е). Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 2. Представитель иммуноблот используется для мониторинга ИЦП белка мембраны. Бактерии, продуцирующие CpxA-Strep из плазмиды в качестве приманки белка мембраны, выращивали в LB среде до оптической плотности 600 из 1 и подвергают воздействию формальдегида (CH 2 O) в течение 20 мин. Внутренняя часть мембраны готовили, мембранные белки солюбилизировали путем обработки детергентом и CpxA-Strep очищали (дорожки 1 и 2). Бактерий, продуцирующих либо CpxA-Strep без формальдегида лечения (дорожки 3 и 4) или проведение пустой вектор с формальдегидом обработки (полосы 5 и 5) служили контролем. Аликвоты каждой пробы кипятили при 95 ° С в течение 20 мин(полосы 2, 4 и 6), чтобы отделить сшитых белков из CpxA-Strep. Белки разделяли в 12,5% SDS-PAGE. Иммуноблоттинг была выполнена и блот был отделен в соответствии с размером CpxA-Strep (51 кДа) и соответствующих кормовых белков CpxR (26 кДа). Две части иммуноблоттинга инкубировали с поликлональными антителами против CpxA и CpxR, соответственно. Затем блоты затем обрабатывают анти-кролик лошадь (HRP) антитела и разработано с использованием SuperSignal West Pico хемилюминесцентный субстрат. Стрелка знаменует продукты деградации CpxA. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 3. Представитель окрашивали серебром SDS-PAGE используется для идентификации в Interaction партнером мембранного белка с помощью анализа MS. Образцы, соответствующие тем фиг.2 были окрашивали серебром. Стрелка показывает полосу, которая была проанализирована с помощью анализа MS и который подтвердил CpxR в качестве партнера взаимодействия CpxA 5. Lane 7 показывает очищенный CpxR-His 6 и переулок 8 показывает очищенный CpxA-His 6 белок. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Анализ Мембрана позвоночник биохимический подход, который дает возможность подтвердить и определить к этой точке неизвестных партнеров взаимодействия мембранных белков. Мембрана SPINE сочетает в естественных условиях сшивки формальдегидом с очистке Strep-меченого белка мембраны приманки. Комбинация с иммуноблотинга облегчает подтверждение предсказанных партнеров взаимодействия (рис. 2). Кроме того, сочетание с анализом MS позволяет идентифицировать неизвестные партнеров взаимодействия (рис. 3). Для обоих приложений, нет никаких требований для изменения вашего добычу белок. Кроме того, мембрана SPINE достаточно чувствителен, чтобы обнаруживать эндогенных хищных белков 6.
Здесь мы приводим протокол, оптимизированный для мембранных белков грамотрицательных бактерий. Огибающая грамотрицательных бактерий отделяет цитоплазму от окружающей среды и получившая, в дополнение кцитоплазматическая мембрана, наружной мембраны и муреин саккулюс. Таким образом, наша протокол включает удаление наружной мембраны и муреин саккулюс, в результате чего так называемых сферопластов. Потому что такие протоколы доступны для большинства типов клеток, наш протокол должен быть адаптированы для большинства мембранных белков. Кроме того, следующие пункты должны быть рассмотрены.
Прежде всего, число копий вектора использовали перепроизводства мембранного белка приманка должна быть сбалансирована между высоком уровне, чтобы обеспечить очистку белка достаточно мембраны и низкий уровень, чтобы предотвратить неспецифических взаимодействий
Во-вторых, для некоторых мембранных белков N-концевого слитого может быть более оптимальным, чем С-концевым слиянием. В обоих случаях функциональность синтеза должно быть подтверждено транс-комплементации.
В-третьих, другие протоколы аффинной очистки также совместимы с последующим анализом MS, таких как очистка FLAG итандем аффинной очистки (TAP). Мы предпочитаем Strep-тег II из-за его небольшого размера с только 8 аминокислот (WSHPQFEK).
В-четвертых, концентрация формальдегида, используемого и времени сшивающего должны быть оптимизированы, чтобы предотвратить неспецифическую сшивки. Достаточное, но не избыточное использование формальдегида можно контролировать с помощью иммуноблоттинга в сырую образцов как соотношение между поперечными связями и nonlinked мембрана приманка белка (рис. 2). Сшитые белки мигрируют как мазок в верхней части иммуноблоттинга. Un-связанные белки мигрируют как необработанной белка. Соотношение между поперечными связями и несвязанного белка должно быть примерно 3:1.
В-пятых, нет "вообще моющее средство" для всех мембранных белков для растворения. Таким образом, в некоторых случаях целесообразно моющее средство для солюбилизации приманки мембранного белка должна быть определена. Таким образом, моющее средство выбрано, должны быть совместимы с Strep-метки Columн.
Наконец, процедура окрашивания серебром должен быть совместим с последующим анализом МС. MS совместимые комплекты окрашивания серебро доступны от разных поставщиков. Мы использовали различные те, с сопоставимыми хорошими результатами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантами Deutsche Forschungsgemeinschaft GraKo1121, Hu1011/2-1 и SFB940 к SH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Formaldehyde | Roth | 4979.1 | Should not be older than one year |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| Micromagnetic rod | Roth | 0955.2 | 5 mm in length, 2 mm in diameter |
| Triton X-100 | Roth | 6683.1 | standard detergent for solubilization |
| n-Dodecyl-β-maltoside | Glycon | D97002-C | the best detergent to solubilze CpxA |
| 1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column | IBA | 2-1207-050 | |
| Strep-tag protein purification buffer set | IBA | 2-1002-001 | Contains buffer W and buffer E |
| Amicon Ultra-4 centrifugal filter | Millipore | UFC803024 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate | Pierce | 34080 | |
| SilverQuest Silverstaining kit | Invitrogen | LC6070 | |
| FireSilver Staining Kit | Proteome Factory | P-S-2001 | |
| Ultracentrifuge |
References
- Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. L. Predicting transmembrane protein topology with a hidden markov model: application to complete genomes. J. Mol. Biol. 305, 567-580 (2001).
- Bakheet, T. M., Doig, A. J. Properties and identification of human protein drug targets. Bioinformatics. 25, 451-457 (2009).
- Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M.
- Daley, D. O. The assembly of membrane proteins into complexes. Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 420-424 (2008).
- Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. Histidine kinases and response regulators in networks. Curr. Opin. Microbiol. 15, 118-124 (2012).
- Müller, V. S., Jungblut, P. R., Meyer, T. F., Hunke, S. Membrane-SPINE: An improved method to identify protein-protein interaction partners of membrane proteins in vivo. Proteomics. 11, 2124-2128 (2011).
- Herzberg, C., et al. SPINE: A method for the rapid detection and analysis of protein-protein interactions in vivo. Proteomics. 7, 4032-4035 (2007).
- Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions. J. Mass Spectrom. 43, 699-715 (2008).
- Hernandez, P., Müller, M., Appel, R. D. Automated protein identification by tandem mass spectrometry: Issues and strategies. Mass Spectrom. Rev. 25, 235-254 (2006).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Hunke, S., Keller, R., Müller, V. S. Signal integration by the Cpx-envelope stress system. FEMS Microbiol. Lett. 326, 12-22 (2012).
- Weber, R. F., Silverman, P. M. The Cpx proteins of Escherichia coli K12 : Structure of the CpxA polypeptide as an inner membrane component. J. Mol. Biol. 203, 467-478 (1988).
