Summary
एक जैव रासायनिक दृष्टिकोण झिल्ली प्रोटीन के vivo प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत (पीपीआई) की पहचान करने के लिए वर्णित है. विधि प्रोटीन पार से जोड़ने, आत्मीयता शुद्धि और मास स्पेक्ट्रोमेट्री जोड़ती है, और लगभग किसी भी कोशिका प्रकार या जीव के लिए अनुकूल है. इस दृष्टिकोण के साथ, क्षणिक PPIs के भी पहचान संभव हो जाता है.
Abstract
झिल्ली प्रोटीन सेल व्यवहार्यता के लिए आवश्यक हैं और इसलिए महत्वपूर्ण चिकित्सकीय लक्ष्य 1-3 कर रहे हैं. वे परिसरों 4 में समारोह के बाद, उनकी बातचीत की पहचान और विशेषताएँ करने के तरीकों 5 जरूरी हैं. यह अंत करने के लिए, हम झिल्ली रीढ़ 6 बुलाया झिल्ली Strep, प्रोटीन बातचीत प्रयोग, विकसित की है. इस तकनीक को एक Strep टैग झिल्ली चारा प्रोटीन की आत्मीयता शुद्धि के साथ प्रतिवर्ती पार linker formaldehyde का उपयोग कर पार से जोड़ने विवो में जोड़ती है. प्रक्रिया के दौरान, पार से जुड़े शिकार प्रोटीन झिल्ली चारा प्रोटीन के साथ सह शुद्ध किया और बाद में उबलते से अलग होती है. झिल्ली रीढ़ का उपयोग झिल्ली प्रोटीन के प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत (PPIs) का विश्लेषण इसलिए, जब दो प्रमुख कार्यों को क्रियान्वित किया जा सकता है: पहला, immunoblotting, और से एक प्रस्तावित बातचीत साथी की पुष्टि दूसरा, मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण से नई बातचीत के भागीदारों की पहचान . इसके अलावा, यहां तक कि एलआत्मीयता ओउ, क्षणिक PPIs इस तकनीक द्वारा detectable हैं. अंत में, झिल्ली रीढ़ झिल्ली प्रोटीन की PPIs की पहचान करने के लिए एक शक्तिशाली प्रदर्शन उपकरण के रूप में इसे लागू कर रही है, लगभग किसी भी कोशिका प्रकार के लिए अनुकूल है.
Introduction
एक प्रोटीन के समारोह को समझने के लिए यह अपनी बातचीत भागीदारों पता करने के लिए आवश्यक है. कई शास्त्रीय तकनीक घुलनशील प्रोटीन की बातचीत के भागीदारों की पहचान के लिए उपलब्ध हैं. हालांकि, इन तकनीकों उनके हाइड्रोफोबिक प्रकृति 4 की वजह से प्रोटीन झिल्ली आसानी से हस्तांतरणीय नहीं हैं. इस सीमा को पार करने के लिए, हम झिल्ली Strep, प्रोटीन बातचीत प्रयोग (झिल्ली रीढ़) 6 को विकसित किया है. यह घुलनशील प्रोटीन 7 के लिए ही उपयुक्त था जो रीढ़ पद्धति पर आधारित है.
पार से जोड़ने एजेंट formaldehyde के दो फायदे से झिल्ली रीढ़ लाभ: पहला, formaldehyde आसानी झिल्ली घुसना और इसलिए एक जीवित कोशिका 8 interactome का एक सटीक स्नैपशॉट उत्पन्न कर सकते हैं. दूसरा, formaldehyde पार से लिंक 9 उबलते द्वारा उलट हो सकता है. इधर, इन दो फायदे झिल्ली prote की स्थायी लेकिन यह भी क्षणिक PPIs न केवल पहचान के लिए इस्तेमाल कर रहे हैंआईएनएस 6.
संक्षेप में, एक Strep टैग अभिन्न झिल्ली चारा प्रोटीन की सी टर्मिनस से जुड़े हुए है. झिल्ली चारा प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं पार से लिंक झिल्ली चारा प्रोटीन के लिए प्रोटीन का शिकार जो formaldehyde (चित्रा 1) के साथ incubated हैं. शिकार प्रोटीन के संशोधन की जरूरत नहीं कर रहे हैं. अगला, झिल्ली अंश तैयार है. इसलिए, झिल्ली प्रोटीन प्रोटीन आत्मीयता शुद्धि का उपयोग कर अपने शिकार प्रोटीन के साथ सह शुद्ध कर रहे हैं डिटर्जेंट उपचार और चारा द्वारा solubilized रहे हैं. बाद में, पार से लिंक उबलते से उलट है, और चारा और उसके सह eluted शिकार प्रोटीन एसडीएस पृष्ठ से अलग हो रहे हैं. अंत में, शिकार प्रोटीन immunoblot विश्लेषण या मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पहचाना जा सकता है.
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Protocol
नोट: प्रोटोकॉल में संकेत दिया बफ़र्स के बारे में विस्तृत जानकारी तालिका 1 में उपलब्ध है.
1. Formaldehyde जीवित कोशिकाओं में पार से जोड़ने से प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की फिक्सेशन
- विकास मीडिया, शेयर समाधान और बफर P1 तैयार शुरू करने के लिए
- 500 मिलीलीटर मध्यम तैयार: मध्यम झिल्ली चारा प्रोटीन और शिकार प्रोटीन के बीच बातचीत का समर्थन करने वाले स्थितियां प्रदान करना चाहिए. इसके अलावा, एक प्रयोग कोई बातचीत (पार से जोड़ने के बिना उदाहरण के लिए) की उम्मीद है जहां शर्तों के तहत किया जाना चाहिए.
नोट: हम पर बल दिया और गैर जोर दिया बैक्टीरिया में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की तुलना करें. इसलिए, हम एक 2 एल Erlenmeyer फ्लास्क में एक तनाव उत्प्रेरण एजेंट (जैसे 0.5 एम NaCl) के साथ पूरक है कि 500 मिलीलीटर Luria Bertani (पौंड) मध्यम (1 टेबल) तैयार करते हैं. नियंत्रण के लिए, हम 0.17 एम NaCl (7.0 पीएच) के साथ सामान्य लेग माध्यम का उपयोग. - Tris-बफर तैयार (20 मिमी Tris-एचसीएल, पीएच 8.0) और 0.1 एम ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA), 8.0 पीएच शेयर समाधान (1 टेबल).
- बफर P1 तैयार करें. Tris बफर में 0.5 एम की एक अंतिम एकाग्रता के लिए सुक्रोज भंग. निस्पंदन द्वारा बफर P1 जीवाणुरहित और यह 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
- 500 मिलीलीटर मध्यम तैयार: मध्यम झिल्ली चारा प्रोटीन और शिकार प्रोटीन के बीच बातचीत का समर्थन करने वाले स्थितियां प्रदान करना चाहिए. इसके अलावा, एक प्रयोग कोई बातचीत (पार से जोड़ने के बिना उदाहरण के लिए) की उम्मीद है जहां शर्तों के तहत किया जाना चाहिए.
- एक वेक्टर से एक सी टर्मिनल Strep टैग फ्यूजन के साथ झिल्ली चारा प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं को विकसित. एक पर्याप्त समय के लिए झिल्ली चारा प्रोटीन की अभिव्यक्ति को प्रेरित.
नोट: हम 500 मिलीलीटर मध्यम करने के लिए 250 μl 1 एम आइसोप्रोपिल-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) के अलावा द्वारा जल्दी लॉग चरण (ए 600 = 0.3) में (अंतिम एकाग्रता: 0.5 मिमी) जीवाणु झिल्ली चारा प्रोटीन की अभिव्यक्ति को प्रेरित . पर्याप्त अभिव्यक्ति देने के लिए, हम देर लॉग चरण (ए 600 = 1.2), जब तक बैक्टीरिया सेते हैं. - 300 मिलीलीटर प्रत्येक के लिए एक न्यूनतम मात्रा के साथ प्रत्येक संस्कृति दो अपकेंद्रित्र beakers के लिए तैयार है और बर्फ पर उन्हें जगह है.
- Formaldehyde पार से जोड़ने प्रदर्शन करना.
CAUTion: Formaldehyde बेहद जहरीला है हम एक सुरक्षा धूआं हुड के तहत काम करने की सिफारिश..- एक सुरक्षा धूआं हुड के तहत संस्कृति पोत स्थानांतरण. (- एक्स) और पार से जोड़ने formaldehyde (+ X) सहित एक दो नमूने, पार से जोड़ने को छोड़ते हुए एक में प्रत्येक नमूना भाजित. 0.6% की एक अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने के लिए 250 मिलीलीटर संस्कृति 4 एमएल 37% formaldehyde समाधान जोड़ें.
- वापस संस्कृति वाहिकाओं स्थानांतरण और पहले के रूप में और 20 मिनट के लिए कोशिकाओं को विकसित.
- एक सुरक्षा धूआं हुड के तहत अपकेंद्रित्र ट्यूबों में अपनी संस्कृतियों भरें. 30 मिनट के लिए 3000 XG पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा.
- ध्यान से एक सुरक्षा धूआं हुड के तहत यह ऊपर pipetting द्वारा सतह पर तैरनेवाला त्यागें. विषाक्त formaldehyde युक्त सतह पर तैरनेवाला लीजिए और ठीक तरह से व्यवस्थित.
- झिल्ली प्रोटीन की तैयारी के दौरान इष्टतम उपज तक पहुंचने के क्रम में, पहली स्फेरोप्लास्ट तैयार करते हैं. यहाँ, हम ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया के spheroplast गठन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं:
- Preparई बफर P2 (1 टेबल) lyophilized पाउडर से. धीरे से एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में, 0.1 एम EDTA, पीएच 8 में 2 मिलीग्राम लाइसोजाइम भंग. हमेशा प्रयोग के दिन के लिए हौसले बफर में p2 तैयार करते हैं.
- Protease अवरोध (बफर पी 3) के साथ Tris-बफर तैयार करें. Tris बफर के 10 एमएल, 10 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 0.1 एमएल 1 एम phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) (1 टेबल) जोड़ें. Protease अवरोध के रूप में PMSF के समुचित कार्य सुनिश्चित करने के लिए तुरंत बफर का प्रयोग करें.
- Protease अवरोध और एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब को हस्तांतरण समाधान के साथ 10 एमएल Tris-बफर में resuspend सेल छर्रों.
- 1 मिलीलीटर बफर में p2 जोड़ें और 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं.
- 30 मिनट के लिए 3000 XG पर centrifugation द्वारा स्फेरोप्लास्ट लीजिए और ध्यान से सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
- -20 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात spheroplast छर्रों सेते
2. Strep टैग झिल्ली प्रोटीन का शुद्धीकरण (चारा)
- बर्फ पर spheroplast गोली रखें. </ ली>
- Spheroplast छर्रों बर्फ पर पिघलना समय के दौरान, प्रत्येक spheroplast तैयारी के लिए 10 मिलीलीटर बफर पी 3 तैयार करते हैं. धीरे 10 एमएल Tris-बफर में 1 मिलीग्राम DNaseI भंग. बस का उपयोग करने से पहले 0.1 एमएल 1 एम PMSF जोड़ें.
- 6 मिलीलीटर हौसले से तैयार पी 3 में गोली Resuspend. स्फेरोप्लास्ट को बाधित करने के लिए, प्रत्येक फट के बीच 1 मिनट ठहराव के साथ बर्फ पर लगातार 1 मिनट के लिए नमूना चार बार Sonicate.
- फसल सेल मलबे को 10 मिनट के लिए 10,000 XG पर नमूना अपकेंद्रित्र. Ultracentrifuge एक ट्यूब के लिए एक विंदुक का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण.
- 30 मिनट के लिए 100.000 XG पर झिल्ली अंश गोली. यह भंग बिना Tris-बफर में सावधानी से गोली धो लें. एक कागज ऊतक (जैसे Kleenex) के साथ ट्यूब सूखी. किसी भी समय गोली परेशान करने से बचें.
- 1 एमएल Tris-बफर में सावधानी से गोली (= झिल्ली) Resuspend. जैसे बीसीए परख द्वारा प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए एक 20 μl विभाज्य का प्रयोग करें. इस चरण में, झिल्ली सदमे ली में जमे हुए किया जा सकता हैरुपये नाइट्रोजन और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत
3. Strep टैग झिल्ली चारा प्रोटीन और एसडीएस पृष्ठ की शुद्धि
- Tris बफर के साथ 5 मिलीग्राम / मिलीलीटर झिल्ली अंश के प्रोटीन एकाग्रता मानक के अनुसार. Ultracentrifuge एक ट्यूब में 2.5 मिलीलीटर झिल्ली अंश (5 मिलीग्राम / एमएल) ले लो और झिल्ली प्रोटीन solubilize के क्रम में, 2% की एक अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने के लिए 20% ट्राइटन X-100 के 0.25 मिलीलीटर जोड़ें. एक माइक्रो चुंबकीय छड़ी जोड़ें और 1 घंटे के लिए बर्फ पर हलचल.
नोट: सामान्य में हम डिटर्जेंट के रूप में ट्राइटन X-100 का उपयोग कर अच्छे परिणाम है, यद्यपि यह अनुकूलन के लिए डिटर्जेंट बदलने के लिए उपयोगी हो सकता है. इस संबंध में, हम संबंधित झिल्ली चारा प्रोटीन के कार्यात्मक शुद्धि के लिए इस्तेमाल किया उन डिटर्जेंट के साथ सबसे अच्छा परिणाम है. - 3.1 कदम प्रदर्शन करते हुए 50 मिलीलीटर (1 टेबल) से पश्चिम और 5 एमएल बफर ई बफर तैयार. 10 मिलीलीटर 5x बफर डब्ल्यू ध्यान केंद्रित मिलीलीटर 50 तक भरें और 150 μl 20% ट्राइटन X-100 जोड़ें.
- 1 मिलीलीटर 5x buffe भरेंआर ई 10 मिलीलीटर के लिए ध्यान केंद्रित करने और 30 μl 20% ट्राइटन X-100 जोड़ें. 8 मिलीग्राम बफर डब्ल्यू के साथ एक 1 मिलीलीटर Strep-Tactin superflow गुरुत्वाकर्षण प्रवाह स्तंभ संतुलित करना
नोट: यह शोधन प्रक्रिया के दौरान किसी भी बफर में महत्वपूर्ण मिसेल एकाग्रता (सीएमसी) के ऊपर एक एकाग्रता 10 गुना में solubilization के लिए इस्तेमाल डिटर्जेंट जोड़ने के लिए आवश्यक है.
- 1 मिलीलीटर 5x buffe भरेंआर ई 10 मिलीलीटर के लिए ध्यान केंद्रित करने और 30 μl 20% ट्राइटन X-100 जोड़ें. 8 मिलीग्राम बफर डब्ल्यू के साथ एक 1 मिलीलीटर Strep-Tactin superflow गुरुत्वाकर्षण प्रवाह स्तंभ संतुलित करना
- अघुलनशील झिल्ली अंश गोली, 30 मिनट के लिए 100.000 XG पर solubilization नमूना और ultracentrifuge से सूक्ष्म चुंबकीय छड़ी निकालें. आगे की शुद्धि के लिए एक पिपेट का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला निकालें.
- स्तंभ के लिए सतह पर तैरनेवाला लोड करें. केवल गुरुत्वाकर्षण प्रवाह के साथ स्तंभ चलाएँ. इस धोने कदम 5x दोहराएँ 5 एमएल बफर डब्ल्यू के साथ स्तंभ धो लें.
- इस क्षालन कदम 4x दोहराएँ 1 मिलीलीटर बफर ई. के साथ झिल्ली चारा प्रोटीन Elute.
- एक केन्द्रापसारक फिल्टर यूनिट के साथ क्षालन भिन्न 2, 3, और 4-300 μl ध्यान लगाओ.
- 50 μl 5x एसडीएस पीएजी साथ प्रत्येक नमूने के 200 μl मिक्सई लोडिंग डाई. 125 μl aliquots में प्रत्येक तैयारी भाजित. Formaldehyde पार से लिंक करने के लिए रिवर्स, 95 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए हर तैयारी का एक विभाज्य उबाल लें. नमूने बेंच शीर्ष पर कम से कम 10 मिनट के लिए आरटी के लिए शांत हो जाओ.
- Immunoblotting के लिए उपयुक्त एक polyacrylamide जेल के एक सिंगल लेन को लोड प्रत्येक नमूने से 30 μl. सर्वश्रेष्ठ उन्मुखीकरण के लिए एक prestained आणविक वजन मार्कर का उपयोग करें और एसडीएस पृष्ठ 10 चलाते हैं.
4. Immunoblot विश्लेषण बातचीत भागीदारों की पुष्टि करने के लिए
- एक बार 3.8 जैसे semidry द्वारा एक nitrocellulose झिल्ली को, स्थानांतरण प्रोटीन पूरा हो गया है कदम.
- Unspecific लेबलिंग को रोकने के लिए झिल्ली ब्लॉक. 0.05% बीच 20 (टीबीएस-टी) के अंतिम एकाग्रता के साथ पूरक Tris बफर खारा में मात्रा प्रति 3% वजन हासिल करने के लिए गोजातीय सीरम albumin (BSA) वजन द्वारा अवरुद्ध बफर तैयार करें. झिल्ली को कवर करने के लिए अवरुद्ध बफर की पर्याप्त मात्रा का प्रयोग करें. आरटी पर 1 घंटे के लिए झिल्ली ब्लॉक.
- एक पतलाएन डी हमेशा की तरह शिकार प्रोटीन विशिष्ट पहली एंटीबॉडी सेते हैं. दूसरा एंटीबॉडी के रूप में एक एचआरपी से जुड़े एंटीबॉडी का प्रयोग करें.
- उच्च संवेदनशीलता के साथ एक chemiluminescent जांच किट का उपयोग कर immunoblot का विकास करना. एक शास्त्रीय फिल्म प्रसंस्करण प्रक्रिया या डिजिटल इमेजिंग उपकरणों का उपयोग कर संकेत मॉनिटर.
5. इंटरेक्शन भागीदारों की पहचान करने के लिए NanoLC-ESI-MS/MS उच्च संकल्प प्रयोगों
- पहचान की जानी चाहिए कोई विशिष्ट एंटीबॉडी शिकार प्रोटीन या अज्ञात बातचीत भागीदारों के लिए उपलब्ध है उस मामले में, पहचान के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) का उपयोग करें. केरातिन प्रदूषण को रोकने के क्रम में, प्रोटीन अलग होने के लिए precasted जैल का उपयोग करें.
- रजत निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक एमएस संगत धुंधला किट का उपयोग कर एसडीएस पृष्ठ दाग. कांच टैंक में सब धुंधला और वाशिंग चरणों को पूरा करें.
- आबकारी संबंधित बैंड और उच्च संकल्प नियंत्रण रेखा / एमएस 9 से इन विश्लेषण.
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Representative Results
झिल्ली रीढ़ विश्लेषण झिल्ली प्रोटीन की सह शुद्धि और क्षणिक बातचीत प्रोटीन भागीदारों की अनुमति देता है. सह शुद्धि पार से जोड़ने एजेंट formaldehyde का उपयोग करके हासिल की है. Formaldehyde एकाग्रता और पार से जोड़ने समय: दो मापदंडों unspecific पार से लिंक को रोकने के लिए महत्वपूर्ण हैं. formaldehyde के अत्यधिक पर्याप्त नहीं, बल्कि उपयोग आसानी से immunoblotting द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है. Formaldehyde पार से जुड़े प्रोटीन परिसरों एसडीएस उपचार से उबलते लेकिन नहीं द्वारा अलग किया जा सकता है. इसलिए, वे एक कच्चा नमूना की प्रतिरक्षा दाग की ऊपरी खंड में धब्बा रूप Strep टैग झिल्ली चारा प्रोटीन की सोख्ता के बाद से देखे जा सकते हैं.
सभी आवश्यक नियंत्रण सहित एक झिल्ली रीढ़ परख के एक प्रतिनिधि परिणाम, चित्रा 2 में प्रस्तुत किया है. चारा प्रोटीन के रूप में ई. कोलाई का अभिन्न झिल्ली प्रोटीन CpxA 6,11 इस्तेमाल किया गया था. CpxA एक सेंसर kinase है और एक के होते हैंएक बड़े extracytoplasmic सेंसर डोमेन और एक सी टर्मिनल अत्यधिक संरक्षित cytoplasmic उत्प्रेरक डोमेन 12 को एकीकृत दो transmembrane डोमेन (TMD) के साथ एन टर्मिनल सेंसर डोमेन. उत्तेजना के बाद, CpxA अपने आत्मीय प्रतिक्रिया नियामक CpxR सक्रिय. सक्रिय CpxR प्रतिक्रिया मध्यस्थता के लिए रवाना diffuses. झिल्ली रीढ़ के लिए, Strep टैग CpxA (CpxA-Strep) के सी टर्मिनस से इनकार किया गया था. CpxA-Strep अन्य प्रोटीन या प्रोटीन परिसरों पर्याप्त पार से जोड़ने का संकेत कच्चा formaldehyde के इलाज के नमूने में एक धब्बा (चित्रा 2, 3 लाइन बनाम लाइन 1) के रूप में पहचान की है करने के लिए पार से जुड़े. इसके अलावा, शिकार प्रोटीन के रूप में अपने आत्मीय प्रतिक्रिया नियामक प्रोटीन CpxR साथ CpxA-Strep का प्रत्यक्ष प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत formaldehyde पार से जोड़ने की विशिष्टता का समर्थन (चित्रा 2, 4 लाइन बनाम लाइन 2) formaldehyde की उपस्थिति में ही पता लगाने योग्य है.
एक झिल्ली रीढ़ विश्लेषण का एक प्रतिनिधि परिणाम प्रस्तुत किया है मैंn चित्रा 3. चित्रा 2 से उन लोगों के लिए इसी नमूने चांदी दाग रहे थे. तीर उबला हुआ नमूने के लिए विशिष्ट है कि एक बैंड के निशान. कारण पृष्ठभूमि के लिए, एमएस विश्लेषण भी CpxR 6 अलावा अन्य प्रोटीन की पहचान की. इसलिए, गैर formaldehyde इलाज नमूना हमेशा पृष्ठभूमि शोर और विशिष्ट बातचीत साथी आवंटित करने, विश्लेषण किया जाना चाहिए.
तालिका 1: झिल्ली रीढ़ के लिए आवश्यक बफ़र और अभिकर्मकों.
| बफर / अभिकर्मक / मध्यम | काम एकाग्रता | टिप्पणी | |
|---|---|---|---|
| लेग | 10 ग्राम tryptone 5 ग्राम खमीर निकालने 10 छ NaCl एल 1 को, 7.0 पीएच को समायोजित | Luria रसा मध्यम | |
| IPTG | 1 एम इसोप्रोपाइल-β-D-thiogalactopyranoside | 0.5 मिमी | |
| Tris बफर | 20 मिमी Tris-एचसीएल, पीएच 8 | NaOH का उपयोग 8.0 पीएच को समायोजित करें | |
| 0,1 एम EDTA, पीएच 8 | 0.1 एम EDTA | NaOH का उपयोग 8.0 पीएच को समायोजित करें | |
| PMSF | 100% isopropanol में 1 एम Phenylmethylsulfonylfluoride | 10 मिमी | PMSF पानी में 100% isopropanol में स्थिर है लेकिन नहीं! शेयर समाधान -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है; PMSF बफर में गिराए पहले कमरे के तापमान के लिए अनुकूलित किया गया है, बफ़र्स युक्त PMSF तैयारी के 10 मिनट के भीतर में इस्तेमाल किया जाना चाहिए. |
| P1 | 20 मिमी Tris-एचसीएल, 8.0 पीएच 0.5 एम सुक्रोज | ||
| इस p2 | 2 मिलीग्राम / एमएल lysozyme 0.1 एम EDTA, 7.5 पीएच में | ||
| पी 3 | 20 मिमी Tris-एचसीएल, 8.0 पीएच 10 मिमी PMSF | तुरंत प्रयोग करेंately के बाद तैयारी | |
| डिटर्जेंट | 20% ट्राइटन X-100 | Solubilization के लिए 2% | |
| बफर डब्ल्यू | 10 मिलीलीटर 5x 50 मिलीलीटर के लिए ध्यान केंद्रित भरें जोड़ने के 150 μl 20% ट्राइटन X-100 | 100 मिमी Tris-एचसीएल, 8.0 पीएच 150 मिमी NaCl 1 मिमी EDTA 0.06% ट्राइटन X-100 | 5x ध्यान केंद्रित Strep टैग प्रोटीन शुद्धि बफर सेट (आईबीए) का हिस्सा है |
| बफर ई | 1 मिलीलीटर 5x 10 मिलीलीटर के लिए ध्यान केंद्रित भरें जोड़ने के लिए 30 μl 20% ट्राइटन X-100 | 100 मिमी Tris-एचसीएल, 8.0 पीएच 150 मिमी NaCl 1 मिमी EDTA 2.5 मिमी Dethiobiotin 0.06% ट्राइटन X-100 | 5x ध्यान केंद्रित Strep टैग प्रोटीन शुद्धि बफर सेट (आईबीए) का हिस्सा है |
| 5x एसडीएस पृष्ठ लोडिंग डाई | 0.3125 एम Tris-एचसीएल, 6.8 पीएच 10% एसडीएस 0.5 एम डीटीटी 50% ग्लिसरॉल |
चित्रा 1. Strep टैग झिल्ली चारा प्रोटीन व्यक्त. A) जीवाणु formaldehyde के साथ व्यवहार कर रहे हैं चारा प्रोटीन के रूप में एक Escherichia कोलाई झिल्ली प्रोटीन का उपयोग झिल्ली रीढ़ प्रक्रिया के चार्ट प्रवाह. Formaldehyde झिल्ली प्रवेश और पार से लिंक झिल्ली अंश तैयार किया जाता है और झिल्ली प्रोटीन डिटर्जेंट उपचार द्वारा solubilized कर रहे हैं) झिल्ली चारा प्रोटीन. बी करने के लिए प्रोटीन शिकार करते हैं. बाद में, शिकार प्रोटीन चारा प्रोटीन के साथ सह शुद्ध कर रहे हैं. सी) Formaldehyde पार से लिंक उबलते द्वारा उलट हैं और प्रोटीन एसडीएस पृष्ठ से अलग हो रहे हैं. अंत में, शिकार प्रोटीन या तो immunoblotting (डी) द्वारा निगरानी या एमएस एना द्वारा पहचाने जाते हैंसेल (ई). बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 2. एक झिल्ली प्रोटीन की एक पीपीआई निगरानी के लिए इस्तेमाल प्रतिनिधि immunoblot. झिल्ली चारा प्रोटीन के रूप में एक प्लाज्मिड से CpxA-Strep उत्पादक जीवाणु, एक आयुध डिपो 1 की 600 पौंड माध्यम में वृद्धि हुई है और 20 मिनट के लिए formaldehyde (सीएच 2 हे) के संपर्क में थे. भीतरी झिल्ली अंश झिल्ली प्रोटीन डिटर्जेंट उपचार द्वारा solubilized गया, तैयार किया गया था और CpxA-Strep शुद्ध किया गया था (1 गलियों और 2). बैक्टीरिया formaldehyde उपचार (गलियों 3 और 4) के बिना CpxA-Strep या तो उत्पादन या formaldehyde के उपचार के साथ खाली वेक्टर ले जाने (गलियों 5 और 5) नियंत्रण के रूप में सेवा की. प्रत्येक नमूने की aliquots 20 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर उबले गया(गलियों 2, 4, और 6) CpxA-Strep से पार से जुड़े प्रोटीन को अलग करना. प्रोटीन 12.5% एसडीएस पृष्ठ में अलग हो गए थे. CpxA-Strep (51 केडीए) के आकार और संबंधित शिकार प्रोटीन CpxR (26 केडीए) के अनुसार immunoblotting प्रदर्शन किया था और धब्बा अलग हो गया था. immunoblot के दो भागों क्रमश: CpxA और CpxR के खिलाफ उठाया पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी के साथ incubated रहे थे. बाद में, blots आगे एक विरोधी खरगोश घोड़े (एचआरपी) एंटीबॉडी के साथ इलाज किया और SuperSignal पश्चिम पिको chemiluminescent सब्सट्रेट का उपयोग कर विकसित किया गया था. Arrowhead CpxA की गिरावट उत्पादों के निशान. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 3. एक मैं की पहचान के लिए प्रयोग किया जाता प्रतिनिधि चांदी से सना हुआ एसडीएस पृष्ठएमएस विश्लेषण से एक झिल्ली प्रोटीन की nteraction साथी. चित्रा 2 से उन लोगों के लिए इसी नमूने चांदी दाग रहे थे. तीर एमएस विश्लेषण द्वारा विश्लेषण किया गया था जो और CpxA 5 की बातचीत के साथी के रूप में CpxR की पुष्टि की है, जो एक बैंड के निशान. लेन 7 शो CpxR उनकी 6 शुद्ध और 8 लेन शो शुद्ध किया CpxA उनकी 6 प्रोटीन. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
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Discussion
झिल्ली रीढ़ विश्लेषण की पुष्टि करने और झिल्ली प्रोटीन के इस बिंदु अज्ञात बातचीत भागीदारों की पहचान करने के लिए एक सक्षम बनाता है एक जैव रासायनिक दृष्टिकोण है. झिल्ली रीढ़ एक Strep टैग झिल्ली चारा प्रोटीन की शुद्धि के साथ formaldehyde द्वारा विवो पार से जोड़ने में जोड़ती है. immunoblotting साथ संयोजन भविष्यवाणी की बातचीत के भागीदारों की पुष्टि (चित्रा 2) की सुविधा. इसके अतिरिक्त, एमएस विश्लेषण के साथ संयोजन अज्ञात बातचीत भागीदारों की पहचान (चित्रा 3) के परमिट. दोनों अनुप्रयोगों के लिए, अपने शिकार प्रोटीन को संशोधित करने के लिए कोई आवश्यकता नहीं है. इसके अलावा, झिल्ली रीढ़ अंतर्जात शिकार प्रोटीन 6 का पता लगाने की अनुमति के लिए पर्याप्त रूप से संवेदनशील है.
यहाँ, हम ग्राम नकारात्मक जीवाणुओं की झिल्ली प्रोटीन के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल उपस्थित थे. ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया के लिफाफे के अलावा, पर्यावरण और posses से कोशिका द्रव्य अलग करती हैcytoplasmic झिल्ली, एक बाहरी झिल्ली और एक murein sacculus. इसलिए, हमारे प्रोटोकॉल तथाकथित स्फेरोप्लास्ट में जिसके परिणामस्वरूप, बाहरी झिल्ली को हटाने और murein sacculus शामिल हैं. इस तरह के प्रोटोकॉल का सबसे प्रकार की कोशिकाओं के लिए उपलब्ध होते हैं, क्योंकि हमारे प्रोटोकॉल सबसे झिल्ली प्रोटीन के लिए अनुकूल होना चाहिए. इसके अलावा, निम्नलिखित बातों पर विचार किया जाना चाहिए.
सबसे पहले, वेक्टर की प्रतिलिपि संख्या झिल्ली चारा प्रोटीन पर्याप्त झिल्ली प्रोटीन शुद्धीकरण और unspecific बातचीत को रोकने के लिए एक कम स्तर की अनुमति के लिए एक उच्च स्तर के बीच संतुलित किया जाना है overproduce के लिए इस्तेमाल किया
दूसरा, कुछ झिल्ली प्रोटीन के लिए एक एन टर्मिनल संलयन एक सी टर्मिनल संलयन से अधिक इष्टतम हो सकता है. दोनों ही मामलों में, संलयन की कार्यक्षमता पार पूरक द्वारा पुष्टि की जानी चाहिए.
तीसरा, अन्य आत्मीयता शुद्धि प्रोटोकॉल झंडा शुद्धि के रूप में, यह भी बाद में एमएस विश्लेषण के साथ संगत कर रहे हैं औरमिलकर संबंध शुद्धीकरण (नल). हम क्योंकि केवल 8 अमीनो एसिड (WSHPQFEK) के साथ अपने छोटे आकार के Strep टैग द्वितीय पसंद करते हैं.
चौथा, इस्तेमाल किया formaldehyde और पार से जोड़ने समय की एकाग्रता unspecific पार से जोड़ने को रोकने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. Formaldehyde के एक अत्यधिक पर्याप्त नहीं बल्कि उपयोग पार से जुड़े और nonlinked झिल्ली चारा प्रोटीन (चित्रा 2) के बीच अनुपात के रूप में कच्चा नमूनों की immunoblotting द्वारा नजर रखी जा सकती है. क्रॉस से जुड़े प्रोटीन immunoblot के ऊपरी हिस्से में एक धब्बा के रूप में विस्थापित. संयुक्त राष्ट्र से जुड़े प्रोटीन अनुपचारित प्रोटीन के रूप में विस्थापित. पार से जुड़े और लिंक रद्द प्रोटीन के बीच अनुपात के बारे में 3:01 होना चाहिए.
पांचवां, solubilization के लिए सभी झिल्ली प्रोटीन के लिए कोई "सामान्य डिटर्जेंट" वहाँ है. इसलिए, कुछ मामलों में झिल्ली चारा प्रोटीन की solubilization के लिए उपयुक्त डिटर्जेंट निर्धारित किया है. इस प्रकार, चुना डिटर्जेंट Strep टैग colum के साथ संगत होना चाहिएएन.
अंत में, चांदी धुंधला प्रक्रिया बाद में एमएस विश्लेषण के साथ संगत किया जाना है. एमएस संगत चांदी धुंधला किट विभिन्न आपूर्तिकर्ताओं से उपलब्ध हैं. हम तुलनीय अच्छे परिणाम के साथ विभिन्न लोगों को इस्तेमाल किया.
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Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
इस शोध एसएच लिए ड्यूश Forschungsgemeinschaft GraKo1121, Hu1011/2-1 और SFB940 का अनुदान द्वारा समर्थित किया गया
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Formaldehyde | Roth | 4979.1 | Should not be older than one year |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| Micromagnetic rod | Roth | 0955.2 | 5 mm in length, 2 mm in diameter |
| Triton X-100 | Roth | 6683.1 | standard detergent for solubilization |
| n-Dodecyl-β-maltoside | Glycon | D97002-C | the best detergent to solubilze CpxA |
| 1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column | IBA | 2-1207-050 | |
| Strep-tag protein purification buffer set | IBA | 2-1002-001 | Contains buffer W and buffer E |
| Amicon Ultra-4 centrifugal filter | Millipore | UFC803024 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate | Pierce | 34080 | |
| SilverQuest Silverstaining kit | Invitrogen | LC6070 | |
| FireSilver Staining Kit | Proteome Factory | P-S-2001 | |
| Ultracentrifuge |
References
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