Summary
Bir yaklaşım, biyokimyasal zar proteinlerinin in vivo protein-protein etkileşimleri (PPI) tanımlamak için tarif edilmektedir. Yöntem, protein çapraz-bağlama, afinite arıtma ve kütle spektrometrisi birleştirir, ve hemen hemen herhangi bir hücre tipi ya da organizma için uyarlanabilir. Bu yaklaşımla, geçici PPI bile tespiti mümkün olur.
Abstract
Zar proteinleri, hücre canlılığı için gerekli olan ve bu nedenle önemli bir terapötik hedef 1-3 bulunmaktadır. Bu kompleksler 4 işlev için, bunların etkileşimleri belirlemek ve karakterize etmek için yöntemler 5 gereklidir. Bu amaçla, biz Membran-OMURGA 6 denilen Membran Strep-protein etkileşim deney geliştirdi. Bu teknik, Strep-işaretli zar yem proteinin afinite saflaştırma ile geri dönüşümlü çapraz bağlayıcı formaldehit kullanılarak çapraz bağlama, in vivo olarak bir araya getirmektedir. İşlem sırasında, çapraz bağlanmış av proteinleri membran yem protein ile birlikte saf hale getirilir ve daha sonra kaynatılarak ayrılır. Membran omurga kullanılarak zar proteinlerinin protein-protein etkileşimleri (PPI) analiz Bu yüzden, iki ana görevleri icra edilebilir: ilk olarak, immün, tarafından önerilen bir etkileşim ortağının ikinci onay, kütle spektrometrisi analizi ile yeni etkileşim ortaklarının tespiti . Dahası, lafinite ow, geçici PPIs Bu teknik ile tespit edilebilir. Son olarak, Membran-OMURGA membran proteinlerinin PPI tanımlamak için güçlü bir tarama aracı olarak geçerli hale, hemen hemen herhangi bir hücre tipine uyarlanabilir.
Introduction
Bir proteinin işlevini anlamak için onun etkileşim ortaklarını bilmek önemlidir. Çeşitli klasik teknikler çözünür proteinlerin etkileşimi ortaklarının tespiti için kullanılabilir. Ancak, bu teknikler, hidrofobik doğası 4 dolayı zar proteinleri kolaylıkla transfer edilemez. Bu sınırlamayı aşmak için, Membran Strep-protein etkileşim deneyi (Membran-OMURGA) 6 geliştirdik. Bu çözünür proteinler 7 için uygundur olan OMURGA yöntemine dayanmaktadır.
Çapraz bağlama maddesi, iki formaldehid avantajlarından zara OMUR faydaları: ilk olarak, formaldehit kolayca nüfuz membranlar ve bu nedenle, bir canlı hücrenin 8'in interactome kesin bir görüntüsünü oluşturur olabilir. İkincisi, formaldehit çapraz bağlantılar 9 kaynatılarak ters olabilir. Burada, bu iki avantajı zar prote sürekli değil, aynı zamanda geçici bir PPI, sadece tanımlamak için kullanılırins 6.
Kısaca, Strep-eklentisi, integral zar yem proteinin C-ucuna kaynaştırılır. Membran yem proteini eksprese eden hücreler, çapraz bağlantıları membran proteinine yem proteinleri av formaldehid (Şekil 1) ile birlikte inkübe edilir. Av proteinleri modifikasyonları gerekli değildir. Daha sonra, membran fraksiyonu hazırlanır. Bu nedenle, membran proteinleri proteinleri afinite arıtma kullanarak av proteinleri ile birlikte saf hale deterjan tedavisi ve yem ile eritilir. Daha sonra, çapraz-link kaynatma ile tersine çevrilir ve yem ve eş-elüt av proteinler SDS-PAGE ile ayrılmıştır. Son olarak, av proteinleri bağışıklık beneklenme analizi veya kütle spektroskopisi ile tespit edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: protokolde belirtilen tamponlar ile ilgili detaylı bilgiler Tablo 1'de kullanılabilir.
1.. Formaldehit Yaşayan hücreler içinde Çapraz bağlama ile protein-protein etkileşimleri Fixation
- Büyüme ortamı, stok çözümleri ve tampon P1 hazırlamak başlamak için
- 500 ml ortam hazırlayın: orta yem zar proteini ve av proteinleri arasındaki etkileşimi destek koşulları sağlamalıdır. Buna ek olarak, bir deney bir etkileşim (çapraz bağlanması olmayan, örneğin) beklenen koşullar altında gerçekleştirilmelidir.
Not: stresli olan ve olmayan stresli bakterilerde protein-protein etkileşimleri karşılaştırın. Bu nedenle, bir 2 L Erlenmeyer şişesi içinde stres yaratıcı bir madde (örneğin, 0.5 M NaCI) ile tamamlamak 500 ml Luria Bertani (LB) ortamı (Tablo 1) hazırlanması. Kontrolü için, 0.17 M NaCl (pH 7.0) normal LB ortamını kullanın. - Tris-tamponu hazırlayın (20 mM Tris-HCl, pH 8.0) ve 0.1 M etilendiamin tetraasetik asit (EDTA), pH 8.0 stok çözeltisi (Tablo 1).
- Tampon P1 hazırlayın. Tris-tampon maddesi içinde 0.5 M bir son konsantrasyona kadar sakroz çözülür. Süzme ile sterilize tampon P1 ve 4 ° C'de saklayın
- 500 ml ortam hazırlayın: orta yem zar proteini ve av proteinleri arasındaki etkileşimi destek koşulları sağlamalıdır. Buna ek olarak, bir deney bir etkileşim (çapraz bağlanması olmayan, örneğin) beklenen koşullar altında gerçekleştirilmelidir.
- Bir vektör bir C-terminal Strep-eklentisi füzyonu ile yem zar proteini sentezleyen hücrelerin büyümesine. Yeterli bir süre için yem zar proteinlerinin ifadesini teşvik eder.
Not: Bu 500 ml ortam için 250 ul 1 M izopropil-β-D-tiogalaktopiranosid (IPTG) eklenmesi ile erken-log fazında (A 600 = 0.3) de (nihai konsantrasyon: 0.5 mM), bakteriyel yem zar proteinlerinin sentezlenmesini uyaran . Yeterli ifadesine olanak tanımak için, geç log fazında (A 600 = 1.2) kadar bakteri inkübe edin. - 300 ml'lik bir minimum hacimde her iki kültür santrifüj bardak hazırla ve buz üzerine yerleştirin.
- Formaldehit çapraz bağlanmasını gerçekleştirmek.
CAUDOĞRULANAMADI: Formaldehit son derece toksik Biz güvenlik davlumbaz altında çalışmanızı öneririz..- Bir güvenlik davlumbaz altında kültür damarı aktarın. (- X) ve çapraz bağlama formaldehid (+ X) da dahil olmak üzere bir iki numune, çapraz-bağlama atlama içine her bir örnek ayrıldı. % 0.6 'lik bir son konsantrasyon elde etmek üzere 250 ml kültüre 4 ml% 37 formaldehit çözeltisi ekleyin.
- Geri kültür damarları transferi ve daha önce olduğu gibi 20 dakika daha hücreler büyür.
- Bir güvenlik davlumbaz altında santrifüj tüplerine içine kültürleri doldurun. 30 dakika boyunca 3000 x g'de santrifüj ile hücreler toplayın.
- Dikkatli bir güvenlik davlumbaz altında yukarı pipetleme süpernatant atın. Toksik formaldehit içeren süpernatant toplayın ve uygun şekilde atın.
- Membran proteini hazırlanması sırasında en iyi verimi ulaşmak için, ilk olarak spheroplastlar hazırlar. Burada, Gram-negatif bakterilerin sferoplast oluşumu için bir protokol sağlar:
- Prepare tampon P2 (Tablo 1) liyofilize toz. Yavaşça, 1.5 ml bir tüp içinde, 0.1 M EDTA, pH 8 içinde 2 mg lizozim çözülür. Her deney günü için taze tampon P2 hazırlar.
- Proteaz inhibitörü (tampon P3) ile Tris-tamponu hazırlayın. Tris-tampon maddesi içinde 10 ml'lik, 10 mM'lik bir son konsantrasyona değin 0.1 ml 1 M fenilmetilsülfonilflüorür (PMSF) (Tablo 1) ekleyin. Proteaz inhibitörü olarak PMSF düzgün çalışmasını sağlamak için, hemen tampon kullanın.
- Proteaz inhibitörü ve bir 15 ml konik tüp transfer çözeltisi ile 10 ml Tris-tampon maddesi içinde yeniden süspanse hücre topakları.
- 1 ml tampon P2 ilave edin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
- 30 dakika boyunca 3000 x g'de santrifüj ile spheroplastlar toplayın ve dikkatli bir şekilde supernatant atın.
- -20 ° C de bir gece inkübe sferoplast granül
2. Strep-eklentisi Membran protein saflaştırılması (yem)
- Buz üzerinde sferoplast pelet yerleştirin. </ Li>
- Sferoplast pelet, buz üzerinde çözülme süre boyunca, her bir sferoplast hazırlanması için, 10 ml tampon P3 hazırlar. Yavaşça 10 ml Tris-tampon maddesi içinde 1 mg DNaseI çözülür. Kullanımdan hemen önce 0.1 ml 1 M PMSF ekleyin.
- 6 ml taze hazırlanmış P3 pelet tekrar. Spheroplastlar engellemek amacıyla, her bir patlama ile 1 dakika duraklama ile buz üzerinde sürekli olarak 1 dakika boyunca bir numune dört kez sonikasyon.
- Hasat hücre artıkları için 10 dakika 10,000 x g'de santrifüjleyin örnek. Ultrasantrifüj işlemi, tüp, bir pipet kullanılarak süpernatan aktarın.
- 30 dakika boyunca 100,000 x g'de membran fraksiyonu Pelet. Çözündürülerek olmadan Tris-tampon maddesi içinde dikkatli bir şekilde pelet yıkayın. Bir ince kağıt (örneğin, Kleenex) ile tüp kurutun. Herhangi bir zamanda pelet rahatsız kaçının.
- 1 ml Tris-tampon maddesi içinde dikkatli bir pelet (= zar) yeniden süspanse edin. Örneğin, BCA analizi ile protein konsantrasyonunu belirlemek için, 20 ul bir kısım kullanın. Bu adımda, membranlar şok li dondurulabilirsterlin azot ve -80 ° C'de saklandı
3. Strep-eklentisi Membran yem Protein ve SDS-PAGE ile saflaştırılması
- Tris-tamponu ile 5 mg / ml membran fraksiyonunun konsantrasyonu protein normalize. Ultrasantrifüj işlemi bir tüp içinde 2.5 ml membran fraksiyonu (5 mg / ml) alın ve zar proteinleri çözündürülmesi amacıyla,% 2'lik bir nihai konsantrasyona ulaşmak için% 20 Triton X-100 ve 0.25 ml ekleyin. Bir mikro-manyetik çubuk ilave edilir ve 1 saat boyunca buz üzerinde karıştırılmıştır.
Not: genel olarak, deterjan olarak Triton X-100 kullanılarak iyi sonuçlar vermesine rağmen, bu optimizasyonu için deterjan değiştirmek için yararlı olabilir. Bu bağlamda, ilgili yem zar proteininin fonksiyonel saflaştırılması için kullanılan deterjan ile en iyi sonuçları vardır. - Adım 3.1 yerine getirirken, 50 ml (Tablo 1) W ve 5 ml tampon E tampon hazırlar. 10 ml 5x tampon W konsantre ml 50 kadar doldurun ve 150 ul% 20 Triton X-100 ekleyin.
- 1 ml 5x Buffe doldurunr E 10 ml'ye konsantre ve 30 ul% 20 Triton X-100 ilave edin. 8 ml tampon W ile bir 1 ml Strep-taktin superflow yerçekimi akışlı sütuna Denge
Not: Bu saflaştırma işlemi sırasında herhangi bir tampon maddesi içinde kritik misel konsantrasyonunun (cmc) üstünde bir konsantrasyonu, 10-kat içinde çözündürme için kullanılan deterjan eklemek için gereklidir.
- 1 ml 5x Buffe doldurunr E 10 ml'ye konsantre ve 30 ul% 20 Triton X-100 ilave edin. 8 ml tampon W ile bir 1 ml Strep-taktin superflow yerçekimi akışlı sütuna Denge
- Çözünmeyen membran fraksiyonu pelet haline getirmek üzere, 30 dakika boyunca 100,000 x g'de çözündürme örnek ve ultrasantrifuju gelen mikro-manyetik çubuk çıkarın. Daha fazla saflaştırma için bir pipet kullanılarak süpernatantı.
- Kolona süpernatant yerleştirin. Sadece yerçekimi akışı ile sütun çalıştırın. Bu yıkama adımı 5x tekrar 5 ml tampon W. ile sütun yıkayın.
- Bu yıkama adımı 4x tekrarlayın 1 ml tampon E. ile membran yem proteinleri Zehir.
- Bir santrifüj filtre birimi ile elüsyon fraksiyonları 2, 3, ve 4-300 ul konsantre edin.
- 50 ul 5x SDS-PAG ile her bir numunenin 200 ul karıştırınE yükleme boyası. 125 ul hacimde her hazırlık ayrıldı. Formaldehit çapraz bağlantıları tersine çevirmek için, 95 ° C'de 20 dakika boyunca her bir preparasyonun bir kısım kaynatın. Numuneler tezgah üstünde en az 10 dakika boyunca oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin.
- Immunoblotting için uygun olan bir poliakrilamid jel tek bir şerit için yük Her bir numune, 30 ul. Iyi yönlendirme için bir Prestained molekül ağırlığı bir kalem kullanın ve SDS-PAGE 10 çalıştırın.
4. İmmünoblot Analizi Etkileşim Ortaklar Onayla
- Bir kez, örneğin 3,8 ile yan-kuru bir nitroselüloz zara transfer proteinleri aşama tamamlanır.
- Spesifik etiketleme önlemek için membran engelleyin. % 0.05 Tween-20 (TBS-T) son bir konsantrasyon ile takviye edilmiş Tris-tamponlu tuzlu su içinde hacim başına% 3 ağırlık elde etmek sığır serum albümini (BSA) tartı ile blokaj tamponu hazırlayın. Membran karşılamak için blokaj tamponu yeterli bir hacmi kullanın. Oda sıcaklığında 1 saat için bloke membran.
- Seyreltiknd zamanki gibi av proteini spesifik bir ilk antikor kuluçkaya yatmaktadır. İkinci antikor olarak bir HRP-bağlı antikor kullanarak.
- Yüksek hassasiyet ile bir kemilüminesan algılama kiti kullanılarak immüno geliştirin. Klasik bir film işleme yordamı veya dijital görüntüleme ekipmanı kullanarak sinyalini izleyin.
5. Etkileşim Ortaklar tanımak NanoLC-ESI-MS/MS Yüksek Çözünürlük Deneyleri
- Belirlenmelidir özel bir antikor, av proteini ya da bilinmeyen bir etkileşim ortakları için kullanılabilir durumda, tanımlama için kütle spektrometresi (MS) kullanılır. Keratin kirlenmesini önlemek amacıyla, protein ayrılması için precasted jelleri kullanın.
- Gümüş, üreticinin protokolüne göre, bir MS-uyumlu bir boyama kiti kullanılarak SDS-PAGE leke. Cam tanklarda tüm boyama ve yıkama adımları gerçekleştirin.
- Tüketim ilgili bantları ve yüksek çözünürlüklü LC / MS 9 bu analiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Membran OMURGA analiz zar proteinlerinin ortak arıtma ve geçici olarak etkileşimli protein ortakları sağlar. Co-saflaştırma çapraz bağlama ajanı formaldehit kullanılarak elde edilir. Formaldehit konsantrasyonu ve çapraz bağlama süresi: İki parametre spesifik olmayan çapraz bağlantı engellemek için kritik öneme sahiptir. Formaldehid aşırı yeterli ama kullanımı kolay immunoblotting ile kontrol edilebilir. Formaldehit çapraz bağlanmış protein kompleksleri, SDS işlenerek kaynama değil ile ayrılabilir. Bu nedenle, bir unboiled numunenin bağışıklık-lekeleme üst kısmında yayma gibi Strep-işaretli zar yem protein lekeleme sonra görselleştirilebilir.
Gerekli tüm kontroller de dahil olmak üzere bir zar OMURGA deneyi, temsili bir sonucu, Şekil 2'de gösterilmiştir. Yem protein olarak Escherichia coli integral zar proteini CpxA 6,11 kullanılmıştır. CpxA bir sensör kinaz ve bir oluşmaktadırBüyük bir ekstrasitoplazmik sensor alanı ve bir C-terminal yüksek ölçüde korunmuş bir sitoplazmik katalitik bir alanı 12 entegre iki zar-ötesi domen (TMD) ile N-terminal etki sensörü. Stimülasyon sonra CpxA kendi doğasındaki tepkisi regülatörü CpxR geçirir. Aktive CpxR cevaba aracılık kapalı yayılır. Membran omurga için, Strep-tag CpxA (CpxA-Strep) içinde C-terminine kaynaştırılmıştır. CpxA-Strep başka proteinler veya protein kompleksleri yeterli çapraz bağlanmasını gösteren unboiled formaldehid ile tedavi edilen numunede bir yayma (Şekil 2, satır 3 karşı line 1) olarak tespit edilir çapraz bağlanmış. Ayrıca, av proteini olarak kendi doğasındaki yanıt düzenleyici protein CpxR CpxA-Strep ile doğrudan bir protein-protein etkileşimi formaldehit çapraz bağlanma özgüllüğünü destek (Şekil 2, satır 4 karşı hat 2) formaldehit varlığında tek tespit edilebilir.
Membran OMURGA analiz temsilcisi sonucu sunulmaktadır iŞekil 3, n. Şekil 2'nin kişilerce gelen örnekler gümüş lekeli. Ok, haşlanmış örnek için spesifik olan bir grup işaret ediyor. Nedeniyle arka plan, MS analizi de CpxR 6 yanı sıra diğer proteinleri tanımlanmıştır. Bu nedenle, non-formaldehit muamele numune, her zaman arka plan gürültü ve belirli etkileşim ortağı atamak, analiz edilmelidir.
Tablo 1: zar-omurga için gerekli Tamponlar ve reaktifler.
| Tampon / Reaktif / Orta | Çalışma konsantrasyonu | yorum | |
|---|---|---|---|
| LB | 10 g Tryptone 5 g maya hülasası 10 g NaCl L 1, pH 7.0 'ye ayarlayın | Luria Broth ortam | |
| IPTG | 1 M izopropil-β-D-tiogalaktopiranosid | 0.5 mM | |
| Tris-tampon | 20 mM Tris-HCI, pH 8 | NaOH ile pH 8.0 'e ayarlayın | |
| 0,1 M EDTA, pH 8 | 0.1 M EDTA | NaOH ile pH 8.0 'e ayarlayın | |
| PMSF | 100% izopropanol içinde 1 M fenilmetilsülfonilflüorür | 10 mM | PMSF su içinde% 100 izopropanol, kararlıdır ama! Stok çözelti, -20 ° C'de saklanabilir; PMSF tampon içinde seyreltilmesi önce oda sıcaklığına adapte edilmesi gerekmektedir; tamponlar içeren PMSF preparat 10 dakika içinde kullanılmalıdır. |
| P1 | 20 mM Tris-HCI, pH 8.0 0.5 M Sukroz | ||
| P2 | 2 mg / ml lisozim 0.1 M EDTA, pH 7.5 içinde | ||
| P3 | 20 mM Tris-HCI, pH 8.0 10 mM PMSF | Derhal kullanınrilmesi sonra hazırlık | |
| Deterjan | % 20 Triton X-100 | Çözünmesi için% 2 | |
| Tampon W | 10 ml 5x 50 ml konsantre doldurun eklemek 150 ul% 20 Triton X-100 | 100 mM Tris-HCI, pH 8.0 150 mM NaCl 1 mM EDTA% 0.06 Triton X-100 | 5x konsantre Strep-eklentisi protein saflaştırma tampon seti (IBA) bir parçasıdır |
| Tampon E | 1 ml 5x 10 ml konsantre doldurun eklemek 30 ul% 20 Triton X-100 | 100 mM Tris-HCI, pH 8.0 150 mM NaCl 1 mM EDTA 2.5 mM Dethiobiotin% 0.06 Triton X-100 | 5x konsantre Strep-eklentisi protein saflaştırma tampon seti (IBA) bir parçasıdır |
| 5x SDS-PAGE yükleme boyası | 0,3125 M Tris-HCI, pH 6.8 % 10 SDS 0.5 M DTT % 50 gliserol |
Şekil 1. Strep-etiketli zar proteini ifade eden yem. A) Bakteri formaldehit ile muamele edilir yem protein olarak, bir Escherichia coli zar proteini kullanılarak Membran-OMURGA prosedürünün akış şeması. Formaldehit zarının nüfuz eder ve çapraz bağlar membran fraksiyonu hazırlanır ve zar proteinleri deterjan işlenerek eritilir) membran yem protein. B'ye proteinleri av. Daha sonra, av proteinleri yem protein ile birlikte saflaştırılır. C) Formaldehit çapraz bağlantıları kaynatma ile tersine çevrilir ve proteinler SDS-PAGE ile ayrılmıştır. Son olarak, av proteinleri immunoblotting ya da (D) ile, ya da MS-ana ile tanımlanırlizis (E). resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 2. Bir zar proteini bir PPI izlemek için kullanılan temsili immunoblot. Zar yem protein olarak bir plazmidden CpxA-strep üreten bakteriler, bir OD 1 600 LB ortamı içinde yetiştirilen ve 20 dakika boyunca formaldehit (CH2 O) maruz bırakıldı. Iç membran fraksiyonu zar proteinleri deterjan muamelesi ile eriyebilir hale getirilip, elde edilmiştir ve CpxA-Strep saflaştınldı (sütun 1 ve 2). Bakteriler formaldehit muamele (sütun 3 ve 4) olmaksızın CpxA-strep ya üreten veya formaldehid ile işlenmemiş boş vektör taşıyan (kulvarlar 5 ve 5) kontrol olarak kullanıldı. Her bir numunenin örnekleri 20 dakika boyunca 95 ° C'de kaynatılmıştır(Kulvarlar 2, 4, ve 6) CpxA-Strep ikinci çapraz bağlanmış proteinleri ayırmak için. Proteinler bir% 12.5 SDS-PAGE ile ayrıldı. CpxA-Strep (51 kDa) büyüklüğüne ve ilgili av proteinleri CpxR (26 kDa) göre Bağışıklık uygulandı ve leke ayrıldı. Immunoblotun iki kısmına, sırasıyla, CpxA ve CpxR karşı yükselen poliklonal antikorlarla birlikte inkübe edildi. Daha sonra, blotlar ayrıca bir anti-tavşan at (HRP) antikor ile muamele edilmiş ve SuperSignal West Pico Chemiluminescent substratı kullanılarak geliştirilmiştir. Ok ucu CpxA parçalanma ürünleri belirtir. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 3,. Bir i tanımlanması için kullanılan Örnek gümüş-lekeli SDS-PAGEMS analizi ile bir zar proteini nteraction, ortak olarak. Şekil 2'nin kişilerce karşılık gelen Örnekler gümüş lekeli. Ok MS analizi ile analiz edilmiş ve CpxA 5 etkileşim ortak olarak CpxR doğruladı bir grup işaret ediyor. Lane 7 gösterileri CpxR-His 6 saflaştırılmış ve şerit 8 gösterileri arıtılmış CpxA-His 6. protein. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Membran OMURGA analiz onaylamak ve membran proteinlerinin bu noktada bilinmeyen bir etkileşim ortakları tanımlamak için birini sağlayan biyokimyasal bir yaklaşımdır. Membran OMURGA bir Strep-etiketli yem zar proteini saflaştırılması ile formaldehid ile çapraz bağlanması vivo olarak bir araya getirmektedir. Immüno-lekeleme ile kombinasyon tahmin etkileşim ortaklarının onay (Şekil 2) kolaylaştırır. Buna ek olarak, MS analizi ile kombine bilinmeyen etkileşim ortaklarının kimlik (Şekil 3) izin verir. Her iki uygulamalar için, av proteinini modifiye için bir gereklilik yoktur. Ayrıca, Membran OMURGA endojen av proteinleri 6 saptanmasını izin vermek için yeterince hassastır.
Burada, gram-negatif bakterilerin membran proteinleri için optimize edilmiş bir protokol mevcut. Gram-negatif bakterilerin zarf ek olarak, çevre ve parça arasındaki sitoplazma ayıransitoplazmik zar, bir dış zar ve bir murein sakkuluslar. Bu nedenle, protokol sözde spheroplastlar sonuçlanan dış membran kaldırılmasını ve murein sakkuluslar içerir. Bu tür protokollerin çoğu hücre tipi için uygun olduğu için, protokol çoğu zar proteinleri için uyarlanabilir olmalıdır. Buna ek olarak, aşağıdaki noktalar dikkate alınmalıdır.
Her şeyden önce, vektör kopya sayısı, yem zar protein yeterli zar proteini saflaştırılması ve spesifik olmayan etkileşimleri önlemek için düşük bir düzeyde izin vermek için yüksek seviyede arasında dengelenmelidir fazla üretmek için kullanılan
İkinci olarak, bir zar proteinleri için bir N-terminal füzyon, bir C-terminal füzyon daha uygun olabilir. Her iki durumda da, füzyonun işlevselliği trans-tamamlama ile teyit edilmelidir.
Üçüncü olarak, diğer afinite saflaştırma protokolleri, FLAG saflaştırma gibi, aynı zamanda daha sonra MS analizi ile uyumludur vetandem afinite saflaştırma (TAP). Biz bu sadece 8 amino asitler (WSHPQFEK) ile küçük boyutlu Strep-tag II tercih ederim.
Dördüncü olarak, kullanılan formaldehit ve çapraz bağlama süresi konsantrasyonu, spesifik olmayan çapraz-bağlama meydana gelmesini önlemek için optimize edilmelidir. Formaldehid bir aşırı yeterli değil kullanımı çapraz bağlanmış ve bağlantı dışı membran yem protein (Şekil 2) arasındaki oran olarak unboiled örneklerin immunoblotting ile izlenebilir. Çapraz bağlanmış protein immüno-üst kısmında bir leke olarak göç ederler. Un-bağlantılı proteinler tedavi edilmemiş bir protein olarak göç ederler. Çapraz bağlantılı ve bağlantısız protein arasındaki oran yaklaşık 3:1 olmalıdır.
Beşinci olarak, çözünme için bütün zar proteinleri için "genel deterjan" yoktur. Bu nedenle, bazı durumlarda, zar yem protein çözünme için uygun deterjan belirlenmelidir. Bu şekilde, seçilen deterjan Strep-eklentisi sütunu ile uyumlu olmalıdırn.
Son olarak, gümüş boyama işlemi daha sonra MS analizi ile uyumlu olmak zorundadır. MS uyumlu gümüş boyama kitleri farklı tedarikçilerden temin edilebilir. Biz benzer iyi sonuçlar ile farklı olanları kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu araştırma SH Deutsche Forschungsgemeinschaft GraKo1121, Hu1011/2-1 ve SFB940 hibeler ile desteklenmiştir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Formaldehyde | Roth | 4979.1 | Should not be older than one year |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| Micromagnetic rod | Roth | 0955.2 | 5 mm in length, 2 mm in diameter |
| Triton X-100 | Roth | 6683.1 | standard detergent for solubilization |
| n-Dodecyl-β-maltoside | Glycon | D97002-C | the best detergent to solubilze CpxA |
| 1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column | IBA | 2-1207-050 | |
| Strep-tag protein purification buffer set | IBA | 2-1002-001 | Contains buffer W and buffer E |
| Amicon Ultra-4 centrifugal filter | Millipore | UFC803024 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate | Pierce | 34080 | |
| SilverQuest Silverstaining kit | Invitrogen | LC6070 | |
| FireSilver Staining Kit | Proteome Factory | P-S-2001 | |
| Ultracentrifuge |
References
- Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. L. Predicting transmembrane protein topology with a hidden markov model: application to complete genomes. J. Mol. Biol. 305, 567-580 (2001).
- Bakheet, T. M., Doig, A. J. Properties and identification of human protein drug targets. Bioinformatics. 25, 451-457 (2009).
- Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M.
- Daley, D. O. The assembly of membrane proteins into complexes. Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 420-424 (2008).
- Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. Histidine kinases and response regulators in networks. Curr. Opin. Microbiol. 15, 118-124 (2012).
- Müller, V. S., Jungblut, P. R., Meyer, T. F., Hunke, S. Membrane-SPINE: An improved method to identify protein-protein interaction partners of membrane proteins in vivo. Proteomics. 11, 2124-2128 (2011).
- Herzberg, C., et al. SPINE: A method for the rapid detection and analysis of protein-protein interactions in vivo. Proteomics. 7, 4032-4035 (2007).
- Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions. J. Mass Spectrom. 43, 699-715 (2008).
- Hernandez, P., Müller, M., Appel, R. D. Automated protein identification by tandem mass spectrometry: Issues and strategies. Mass Spectrom. Rev. 25, 235-254 (2006).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Hunke, S., Keller, R., Müller, V. S. Signal integration by the Cpx-envelope stress system. FEMS Microbiol. Lett. 326, 12-22 (2012).
- Weber, R. F., Silverman, P. M. The Cpx proteins of Escherichia coli K12 : Structure of the CpxA polypeptide as an inner membrane component. J. Mol. Biol. 203, 467-478 (1988).
