Summary
Un enfoque bioquímico se describe para identificar in vivo interacciones proteína-proteína (PPI) de proteínas de membrana. El método combina la reticulación de proteínas, purificación por afinidad y espectrometría de masas, y es adaptable a casi cualquier tipo de célula u organismo. Con este enfoque, incluso la identificación de los IBP transitorios se hace posible.
Abstract
Las proteínas de membrana son esenciales para la viabilidad celular y son, por tanto, importantes objetivos terapéuticos 1-3. Desde que funcionan en los complejos 4, los métodos para identificar y caracterizar sus interacciones son necesarias 5. Con este fin, hemos desarrollado el Strep-proteína de membrana experimento de interacción, denominada membrana-COLUMNA 6. Esta técnica combina en vivo entrecruzamiento reversible mediante el formaldehído reticulante con la purificación por afinidad de una proteína de membrana de cebo-Strep etiquetado. Durante el procedimiento, las proteínas presa reticulados son co-purificadas con la proteína cebo membrana y posteriormente separados por ebullición. Por lo tanto, dos grandes tareas se pueden ejecutar en el análisis de las interacciones proteína-proteína (PPI) de las proteínas de membrana mediante membrana-COLUMNA: en primer lugar, la confirmación de un compañero de interacción propuesto por inmunotransferencia, y en segundo lugar, la identificación de nuevos socios de la interacción mediante el análisis de espectrometría de masas . Además, incluso lOW afinidad, IBP transitorios son detectables por esta técnica. Por último, la Membrana-ESPINA es adaptable a casi cualquier tipo de célula, por lo que es aplicable como herramienta de detección de gran alcance para identificar los IBP de proteínas de membrana.
Introduction
Para entender la función de una proteína que es esencial conocer sus compañeros de interacción. Varias técnicas clásicas están disponibles para la identificación de parejas de interacción de proteínas solubles. Sin embargo, estas técnicas no son fácilmente transferibles a proteínas de la membrana debido a su naturaleza hidrófoba 4. Para superar esta limitación, hemos desarrollado la membrana Strep-proteína interacción experimento (Membrana-COLUMNA) 6. Se basa en el método de columna vertebral, que era sólo es adecuado para proteínas solubles 7.
Beneficios de membrana-espina dorsal de dos ventajas de la formaldehído agente de reticulación: primero, el formaldehído pueden penetrar fácilmente las membranas y por lo tanto genera una instantánea precisa de la interactoma de una célula viva 8. En segundo lugar, formaldehído enlaces cruzados pueden revertirse mediante ebullición 9. Aquí, estas dos ventajas se utilizan para identificar no sólo los IBP permanentes pero también transitorios de prot membranains 6.
En breve, un Strep-etiqueta se fusiona al C-terminal de la proteína cebo integral de membrana. Las células que expresan la proteína cebo de membrana se incuban con formaldehído que los enlaces cruzados se aprovechan de las proteínas a la proteína cebo membrana (Figura 1). No son necesarias modificaciones de las proteínas de la presa. A continuación, la fracción de membrana se prepara. Por lo tanto, las proteínas de membrana se solubilizan por tratamiento con detergente y cebo proteínas son co-purificadas con sus proteínas presa utilizando la purificación por afinidad. Posteriormente, la reticulación se invierte por ebullición, y el cebo y sus proteínas presa co-eluidos se separan por SDS-PAGE. Finalmente, las proteínas presa pueden ser identificados por análisis de inmunotransferencia o espectrometría de masas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Nota: La información detallada sobre los buffers que fija el Protocolo se encuentra disponible en la Tabla 1.
1. La fijación de las interacciones proteína-proteína por formaldehído entrecruzamiento en células vivas
- Para comenzar a preparar los medios de crecimiento, las soluciones madre y tampón P1
- Preparar medio 500 ml: El medio debe ofrecer condiciones que apoyan la interacción entre la proteína cebo membrana y las proteínas de la presa. Además, un experimento debe realizarse en condiciones en que no se espera interacción (por ejemplo, sin entrecruzamiento).
Nota: Se comparan las interacciones proteína-proteína en bacterias estresadas y no estresadas. Por lo tanto, preparamos 500 ml de medio Luria Bertani (LB) (Tabla 1) que complementamos con un agente de inducción de estrés (por ejemplo, NaCl 0,5 M) en un matraz Erlenmeyer de 2 l. Para el control, se utiliza medio normal LB con NaCl 0,17 M (pH 7,0). - Preparar tampón Tris (20 mM de Tris-HCl, pH 8,0) y 0,1 M de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), pH de la solución de stock 8,0 (Tabla 1).
- Prepare el tampón P1. Disolver la sacarosa a una concentración final de 0,5 M en tampón Tris. Esterilizar tampón P1 por filtración y almacenarlo a 4 ° C.
- Preparar medio 500 ml: El medio debe ofrecer condiciones que apoyan la interacción entre la proteína cebo membrana y las proteínas de la presa. Además, un experimento debe realizarse en condiciones en que no se espera interacción (por ejemplo, sin entrecruzamiento).
- Se cultivan las células que expresan la proteína cebo membrana con un Strep-tag de fusión C-terminal de un vector. Inducir la expresión de proteínas de cebo de la membrana durante un tiempo suficiente.
Nota: Se inducen la expresión de proteínas cebo membrana bacteriana en la fase temprana-log (a 600 = 0,3) mediante la adición de 250 l 1 M isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG) a 500 ml de medio (concentración final: 0,5 mM) . Para permitir una expresión suficiente, nos Incubar las bacterias hasta que la última fase-log (A 600 = 1,2). - Preparar para cada cultura dos vasos de centrífuga con un volumen mínimo de 300 ml cada uno y colocarlos en hielo.
- Realice formaldehído entrecruzamiento.
CAUCIÓN: El formaldehído es altamente tóxico Recomendamos trabajar bajo una campana de seguridad..- Transferir el recipiente de cultivo bajo una campana de seguridad. Dividir cada muestra en dos muestras, una omisión de reticulación (- X) y uno incluyendo el formaldehído de reticulación (X +). Añadir 4 ml de solución de formaldehído al 37% a la cultura de 250 ml hasta alcanzar una concentración final de 0,6%.
- La transferencia de los recipientes de cultivo de vuelta y hacer crecer las células durante 20 minutos más que antes.
- Llene sus culturas en los tubos de centrifugación bajo una campana de humos seguridad. Recoger las células por centrifugación a 3000 xg durante 30 min.
- Desechar el sobrenadante con la pipeta cuidadosamente bajo una campana de humos seguridad. Recoger tóxico sobrenadante que contiene formaldehído y disponer de ella adecuadamente.
- Con el fin de alcanzar un rendimiento óptimo durante la preparación de proteína de membrana, preparar esferoplastos primero. Aquí, proporcionamos un protocolo para la formación de esferoplastos de bacterias Gram-negativos:
- Prepartampón E P2 (Tabla 1) a partir de polvo liofilizado. Disolver suavemente 2 mg de lisozima en 0,1 M EDTA, pH 8, en un tubo de 1,5 ml. Siempre prepare tampón P2 recién para el día del experimento.
- Preparar tampón Tris con inhibidor de la proteasa (tampón P3). Para 10 ml de tampón Tris, añadir 0,1 ml de 1 M de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) (Tabla 1) a una concentración final de 10 mM. Utilice el tampón de inmediato, para garantizar el funcionamiento correcto de PMSF como inhibidor de la proteasa.
- Resuspender los sedimentos celulares en 10 ml de Tris-tampón con inhibidor de la proteasa y la solución de la transferencia a un tubo cónico de 15 ml.
- Añadir 1 ml de tampón P2 e incubar en hielo durante 30 min.
- Recoger esferoplastos por centrifugación a 3000 xg durante 30 min y desechar el sobrenadante cuidadosamente.
- Incubar los pellets esferoplastos noche a -20 ° C.
2. Purificación de Strep-tag de proteínas de membrana (Bait)
- Coloque pellet esferoplasto en hielo. </ Li>
- Durante el tiempo de los pellets de esferoplastos se descongelan en hielo, preparar 10 ml de tampón P3 para cada preparación de esferoplastos. Disolver suavemente 1 mg de ADNasa I en 10 ml de tampón Tris. Añadir 0,1 ml de 1 M PMSF justo antes del uso.
- Resuspender el sedimento en 6 ml de P3 recién preparada. Sonicar la muestra cuatro veces durante 1 min en hielo continuamente con 1 min de pausa entre cada ráfaga, con el fin de interrumpir esferoplastos.
- Centrifugar la muestra a 10.000 xg durante 10 min a restos celulares de la cosecha. Transferir el sobrenadante con una pipeta a un tubo de ultracentrífuga.
- Pellet la fracción de membrana a 100.000 xg durante 30 min. Lavar el sedimento cuidadosamente en tampón Tris sin disolverla. Secar el tubo con un tejido de papel (por ejemplo pañuelos de papel). Evitar alterar el sedimento en cualquier momento.
- Resuspender el sedimento (= membranas) con cuidado en 1 ml de tampón Tris. Utilice una alícuota de 20 l para determinar la concentración de proteína mediante el ensayo de BCA por ejemplo. En este paso, las membranas se pueden choque congelados en lilibras de nitrógeno y se almacenó a -80 ° C.
3. Purificación de Strep-tag Membrana Bait proteínas y SDS-PAGE
- Normalizar la concentración de proteína de la fracción de membrana a 5 mg / ml con tampón Tris. Tomar 2,5 ml de fracción de membrana (5 mg / ml) en un tubo de ultracentrífuga y añadir 0,25 ml de 20% de Triton X-100 para llegar a una concentración final de 2%, con el fin de solubilizar las proteínas de la membrana. Añadir una varilla de micro-magnético y se agita en hielo durante 1 h.
Nota: Aunque en general tenemos buenos resultados utilizando Triton X-100 como detergente, puede ser útil para cambiar el detergente para la optimización. A este respecto, tenemos mejores resultados con los detergentes utilizados para la purificación funcional de la respectiva proteína cebo membrana. - Durante la realización de la etapa 3.1, preparar 50 ml de tampón W y 5 ml de tampón E a partir de (Tabla 1). Llenar hasta 10 ml 5x tampón W concentrado a 50 ml y añadir 150 l 20% de Triton X-100.
- Llenar 1 ml 5x buffeR E concentrado a 10 ml y añadir 30 l 20% de Triton X-100. Equilibrar una columna de flujo de 1 ml de Strep-Tactin gravedad SuperFlow con 8 ml de tampón de W.
Nota: Es esencial para añadir el detergente que se usa para la solubilización en una concentración 10 veces por encima de la concentración micelar crítica (CMC) en cualquier tampón durante el procedimiento de purificación.
- Llenar 1 ml 5x buffeR E concentrado a 10 ml y añadir 30 l 20% de Triton X-100. Equilibrar una columna de flujo de 1 ml de Strep-Tactin gravedad SuperFlow con 8 ml de tampón de W.
- Retire la varilla de micro-magnética de la muestra de solubilización y ultracentrífuga a 100.000 xg durante 30 min, para sedimentar la fracción de membrana insolubles. Eliminar el sobrenadante con una pipeta para su posterior purificación.
- Cargar el sobrenadante a la columna. Ejecute la columna sólo con flujo por gravedad. Lavar la columna con 5 ml de tampón de W. Repita este paso de lavado 5x.
- Eluir cebo proteínas de membrana con 1 ml de tampón E. Repita este paso de elución de 4x.
- Concentrar las fracciones de elución 2, 3, y de 4 a 300 L con una unidad de filtro centrífugo.
- Mezclar 200 l de cada muestra con 50 l 5x de SDS-PAGCarga de colorante E. Dividir cada preparado en 125 ml de alícuotas. Hervir una alícuota de cada preparación durante 20 min a 95 ° C, para revertir formaldehído enlaces cruzados. Deje que las muestras se enfríen a temperatura ambiente durante al menos 10 minutos en el banco superior.
- De carga 30 l de cada muestra a un solo carril de un gel de poliacrilamida-adecuado para inmunotransferencia. Use un marcador prestained peso molecular para la mejor orientación y ejecutar SDS-PAGE 10.
4. Análisis de inmunotransferencia para confirmar los compañeros de interacción
- Una vez paso 3.8 se completa, proteínas de transferencia a una membrana de nitrocelulosa por ejemplo semiseco.
- Bloquear la membrana para evitar que el etiquetado no específica. Preparar tampón de bloqueo mediante el pesaje de albúmina de suero bovino (BSA) para lograr 3% en peso por volumen en solución salina tamponada con Tris suplementado con una concentración final de 0,05% de Tween-20 (TBS-T). Utilice un volumen suficiente de tampón de bloqueo para cubrir la membrana. Bloquear la membrana durante 1 hora a TA.
- Diluir unand incubar el primer anticuerpo específico presa de proteínas como de costumbre. Utilice un anticuerpo unido a HRP como el segundo anticuerpo.
- Desarrollar el inmunoblot utilizando un kit de detección de quimioluminiscencia con una alta sensibilidad. Supervisar la señal utilizando un procedimiento de procesamiento de películas clásicas o equipos de imagen digital.
5. Los experimentos de alta resolución NanoLC-ESI-MS/MS identificar a los socios de interacción
- En caso de que ningún anticuerpo específico disponible para la presa de proteínas o compañeros de interacción desconocidos se debe identificar, utilizar la espectrometría de masas (MS) para la identificación. Con el fin de evitar la contaminación de la queratina, utilizar geles PREFABRICADOS DE HORMIGON para la separación de proteínas.
- Silver Stain la SDS-PAGE usando un kit de tinción compatibles-MS de acuerdo con el protocolo del fabricante. Realice todos los pasos de tinción y lavado de tanques de vidrio.
- Impuestos Especiales respectivas bandas y analizar estos por alta resolución LC / MS 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Análisis COLUMNA membrana permite la co-purificación de proteínas de membrana y proteínas asociados transitoriamente interactúan. El co-purificación se logra mediante el uso de la formaldehído agente de reticulación. Dos parámetros son fundamentales para evitar inespecíficos enlaces cruzados: la concentración de formaldehído y el tiempo de reticulación. El uso suficiente, pero no excesiva de formaldehído puede ser fácilmente controlado por inmunotransferencia. Complejos de proteínas reticuladas-formaldehído se pueden separar por ebullición, pero no por tratamiento con SDS. Por lo tanto, se pueden visualizar después de borrar de la proteína cebo membrana marcada con Strep como frotis en la sección superior de la inmuno-blot de una muestra sin hervir.
Un resultado representativo de un ensayo de membrana COLUMNA, incluyendo todos los controles necesarios, se presenta en la Figura 2. Como cebo de proteína se utilizó la integral CpxA proteína de membrana de Escherichia coli 6,11. CpxA es una quinasa sensor y consta de unSensor de dominio N-terminal con dos dominios transmembrana (TMD) que integran un gran dominio del sensor extracytoplasmic y un dominio citoplásmico muy conservadas C-terminal catalítico 12. Después de la estimulación, CpxA activa su cognado CPXR regulador de la respuesta. Activado CPXR difunde fuera de mediar la respuesta. Para membrana columna vertebral, el Strep-tag se fusiona al C-terminal de CpxA (CpxA-Strep). CpxA-Strep reticulado a otras proteínas o complejos proteicos se detecta como una mancha en la muestra sin hervir tratada con formaldehído (Figura 2, línea 1 frente a la línea 3), indicando suficiente reticulación. Por otra parte, una interacción proteína-proteína directa de CpxA-Strep con sus afines regulador de respuesta de las proteínas CPXR como la proteína presa sólo es detectable en la presencia de formaldehído (Figura 2, línea 2 frente a la línea 4) el apoyo a la especificidad de formaldehído entrecruzamiento.
Un resultado representativo de un análisis de la membrana COLUMNA se presenta in Figura 3. Las muestras correspondientes a los de la Figura 2 se tiñeron con plata. La flecha indica una banda que es específica para la muestra hervida. Debido a los antecedentes, el análisis de MS también identificó otras proteínas además de CPXR 6. Por lo tanto, la muestra no formaldehído tratada siempre debe ser analizada, para asignar el ruido de fondo y el compañero de interacción específico.
Tabla 1: Los tampones y reactivos necesarios para la membrana de la columna vertebral.
| Buffer / reactivo / medio | La concentración de trabajo | comentario | |
|---|---|---|---|
| LB | 10 g de triptona 5 g de extracto de levadura 10 g de NaCl a 1 L, ajustar el pH a 7,0 | Medio Luria Broth | |
| IPTG | 1 M isopropil-β-D-tiogalactopiranósido | 0,5 mM | |
| Tampón Tris | 20 mM de Tris-HCl, pH 8 | Ajustar el pH a 8,0 utilizando NaOH | |
| 0,1 M EDTA, pH 8 | 0,1 M EDTA | Ajustar el pH a 8,0 utilizando NaOH | |
| PMSF | 1 M de fluoruro de fenilmetilsulfonilo en 100% de isopropanol | 10 mM | PMSF es estable en isopropanol al 100% pero no en agua! La solución Stock se pueden almacenar a -20 ° C; PMSF tiene que ser adaptado a la temperatura ambiente antes de diluir en tampón; PMSF que contiene tampones se debe utilizar en dentro de 10 min de la preparación. |
| P1 | 20 mM de Tris-HCl, pH 8,0 0,5 M de sacarosa | ||
| P2 | 2 mg / ml de lisozima en 0,1 M EDTA, pH 7,5 | ||
| P3 | 20 mM de Tris-HCl, pH 8,0 MM de PMSF 10 | Use inmediatamentetamente después de la preparación | |
| Detergente | 20% de Triton X-100 | 2% para la solubilización | |
| Buffer W | Llenar 10 ml 5x concentrar a 50 ml añadir 150 l 20% de Triton X-100 | 100 mM de Tris-HCl, pH 8,0 150 mM de NaCl EDTA 1 mM, 0,06% de Triton X-100 | 5x concentrado es parte de Strep-etiqueta de purificación de proteínas juego de tampones (IBA) |
| Tampón E | Llenar 1 ml 5x concentrar a 10 ml añadir 30 l 20% de Triton X-100 | 100 mM de Tris-HCl, pH 8,0 150 mM de NaCl 1 mM EDTA 2,5 mM de Dethiobiotin 0,06% de Triton X-100 | 5x concentrado es parte de Strep-etiqueta de purificación de proteínas juego de tampones (IBA) |
| 5x SDS-PAGE colorante de carga | 0,3125 M de Tris-HCl, pH 6,8 10% de SDS 0.5 M DTT 50% de glicerol |
Figura 1. Diagrama de flujo del procedimiento de membrana-columna vertebral empleando una proteína de membrana de Escherichia coli como proteína cebo. A) Las bacterias que expresan la proteína cebo membrana Strep-etiquetados son tratados con formaldehído. El formaldehído penetra las membranas y los enlaces cruzados se aprovechan las proteínas a la membrana de la proteína cebo. B) La fracción de membrana se prepara y proteínas de la membrana se solubilizan por tratamiento con detergente. Posteriormente, las proteínas presa son co-purificadas con la proteína cebo. C) de formaldehído enlaces cruzados se invierten por ebullición y las proteínas se separan por SDS-PAGE. Finalmente, las proteínas presa se seguirán mediante inmunotransferencia (D) o identificados por EM-Analisis (E). Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 2. Inmunoblot representativo utilizado para controlar un IBP de una proteína de membrana. Bacterias productoras de CpxA-Strep partir de un plásmido como cebo de proteína de membrana, se cultivaron en medio LB hasta una DO 600 de 1 y expuesto a formaldehído (CH2O) durante 20 min. Se preparó la fracción de membrana interna, proteínas de membrana se solubilizaron por tratamiento con detergente y CpxA-Strep se purificó (carriles 1 y 2). Las bacterias productoras de ya sea CpxA-Strep sin tratamiento con formaldehído (carriles 3 y 4) o que lleva el vector vacío con tratamiento con formaldehído (carriles 5 y 5) sirvieron como controles. Las alícuotas de cada muestra se sometió a ebullición a 95 ° C durante 20 min(carriles 2, 4, y 6) para separar las proteínas reticuladas de CpxA-Strep. Las proteínas se separaron en un 12,5% de SDS-PAGE. La inmunotransferencia se realizó y la mancha de transferencia se separa de acuerdo con el tamaño de CpxA-Strep (51 kDa) y las proteínas presa respectivos CPXR (26 kDa). Las dos partes de la inmunotransferencia se incubaron con anticuerpos policlonales producidos contra CpxA y CPXR, respectivamente. Posteriormente, las transferencias se trataron adicionalmente con un anti-conejo picante (HRP) de anticuerpos y se desarrollaron usando el sustrato SuperSignal West Pico quimioluminiscente. La punta de flecha marca los productos de degradación de CpxA. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 3. Representante de SDS-PAGE teñido con plata utilizado para la identificación de un isocio nteraction de una proteína de membrana por análisis de MS. Las muestras correspondientes a los de la Figura 2 se tiñeron de plata. La flecha indica una banda que se analizó mediante análisis de MS y que confirmó CPXR como la pareja de interacción de CpxA 5. Carril 7 muestra purificados CPXR-Su 6 y 8 carriles shows purificados CpxA-Su 6 proteínas. Haz clic aquí para ver la imagen más grande .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Análisis COLUMNA membrana es un enfoque bioquímico que permite a uno para confirmar e identificar a este punto desconocidos compañeros de interacción de proteínas de membrana. COLUMNA membrana combina in vivo reticulación por formaldehído con la purificación de una proteína cebo membrana-Strep etiquetado. La combinación con inmunotransferencia facilita la confirmación de parejas de interacción predichas (Figura 2). Además, la combinación con el análisis de MS permite la identificación de los socios de la interacción desconocidos (Figura 3). Para ambas aplicaciones, no hay ningún requisito para modificar su presa de proteínas. Por otra parte, Membrana ESPINA es suficientemente sensible para permitir la detección de proteínas endógenas presa 6.
A continuación, presentamos un protocolo optimizado para proteínas de la membrana de las bacterias gram-negativas. El sobre de bacterias gram-negativas separa el citoplasma de la medio ambiente y poseen, además de lamembrana citoplasmática, una membrana externa y un sáculo de mureína. Por lo tanto, nuestro protocolo incluye la eliminación de la membrana externa y el sáculo de mureína, lo que resulta en las llamadas esferoplastos. Debido a que estos protocolos están disponibles para la mayoría de tipos de células, el protocolo debe ser adaptable para la mayoría de las proteínas de membrana. Además, los siguientes puntos deben ser considerados.
En primer lugar, el número de copias del vector utilizado para sobreproducir la proteína cebo membrana tiene que ser equilibrada entre un alto nivel para permitir la purificación de proteínas suficiente membrana y un nivel bajo para evitar interacciones inespecíficas
En segundo lugar, para algunas proteínas de la membrana una fusión N-terminal puede ser más óptima de una fusión C-terminal. En ambos casos, la funcionalidad de la fusión debe ser confirmado por trans-complementación.
, Otros protocolos de purificación de afinidad Los terceros también son compatibles con el análisis de MS posterior, tales como la purificación FLAG ypurificación por afinidad en tándem (TAP). Nosotros preferimos la etiqueta Strep-II debido a su pequeño tamaño, con sólo 8 aminoácidos (WSHPQFEK).
En cuarto lugar, la concentración de formaldehído utilizado y el tiempo de reticulación debe ser optimizado para prevenir la reticulación no específica. Un uso suficiente pero no excesiva de formaldehído puede ser monitoreado por inmunotransferencia de las muestras no sometidas a ebullición como la relación entre reticulado y nonlinked cebo de proteína de membrana (Figura 2). Proteínas reticuladas migran como una mancha en la parte superior de la inmunotransferencia. Un proteínas ligadas a la migración como la proteína no tratada. La relación entre el reticulado y la proteína no vinculada debe ser aproximadamente 3:1.
En quinto lugar, no hay un "detergente en general" para todas las proteínas de membrana para la solubilización. Por lo tanto, en algunos casos, el detergente apropiado para la solubilización de la proteína cebo membrana tiene que ser determinada. De este modo, el detergente elegido debe ser compatible con la Colum Strep-tagn.
Por último, el procedimiento de tinción de plata tiene que ser compatible con el análisis de MS subsiguiente. Kits de tinción de plata compatibles MS están disponibles a partir de diferentes proveedores. Se utilizó los diferentes con buenos resultados comparables.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por subvenciones de la Deutsche Forschungsgemeinschaft GraKo1121, Hu1011/2-1 y SFB940 a SH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Formaldehyde | Roth | 4979.1 | Should not be older than one year |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| Micromagnetic rod | Roth | 0955.2 | 5 mm in length, 2 mm in diameter |
| Triton X-100 | Roth | 6683.1 | standard detergent for solubilization |
| n-Dodecyl-β-maltoside | Glycon | D97002-C | the best detergent to solubilze CpxA |
| 1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column | IBA | 2-1207-050 | |
| Strep-tag protein purification buffer set | IBA | 2-1002-001 | Contains buffer W and buffer E |
| Amicon Ultra-4 centrifugal filter | Millipore | UFC803024 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate | Pierce | 34080 | |
| SilverQuest Silverstaining kit | Invitrogen | LC6070 | |
| FireSilver Staining Kit | Proteome Factory | P-S-2001 | |
| Ultracentrifuge |
References
- Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. L. Predicting transmembrane protein topology with a hidden markov model: application to complete genomes. J. Mol. Biol. 305, 567-580 (2001).
- Bakheet, T. M., Doig, A. J. Properties and identification of human protein drug targets. Bioinformatics. 25, 451-457 (2009).
- Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M.
- Daley, D. O. The assembly of membrane proteins into complexes. Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 420-424 (2008).
- Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. Histidine kinases and response regulators in networks. Curr. Opin. Microbiol. 15, 118-124 (2012).
- Müller, V. S., Jungblut, P. R., Meyer, T. F., Hunke, S. Membrane-SPINE: An improved method to identify protein-protein interaction partners of membrane proteins in vivo. Proteomics. 11, 2124-2128 (2011).
- Herzberg, C., et al. SPINE: A method for the rapid detection and analysis of protein-protein interactions in vivo. Proteomics. 7, 4032-4035 (2007).
- Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions. J. Mass Spectrom. 43, 699-715 (2008).
- Hernandez, P., Müller, M., Appel, R. D. Automated protein identification by tandem mass spectrometry: Issues and strategies. Mass Spectrom. Rev. 25, 235-254 (2006).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Hunke, S., Keller, R., Müller, V. S. Signal integration by the Cpx-envelope stress system. FEMS Microbiol. Lett. 326, 12-22 (2012).
- Weber, R. F., Silverman, P. M. The Cpx proteins of Escherichia coli K12 : Structure of the CpxA polypeptide as an inner membrane component. J. Mol. Biol. 203, 467-478 (1988).
