Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Explant संस्कृति में दांत कीटाणुओं के विकास के बाद के लिए टुकड़ा संस्कृति विधि

doi: 10.3791/50824 Published: November 13, 2013

Summary

यहाँ विस्तार एक ऊतक हेलिकॉप्टर का उपयोग जबड़ा स्लाइस में संस्कृति दांत कीटाणुओं के लिए एक विधि हम. इस पद्धति अधिक पारंपरिक संस्कृति तरीकों का उपयोग कर उपलब्ध हेरफेर और वंश अनुरेखण, नहीं करने के लिए शानदार अवसर प्रदान करने, विकास के दौरान दांत के लिए अद्वितीय उपयोग की अनुमति देता.

Abstract

Explant संस्कृति विशिष्ट समय बिंदुओं पर अंगों के विकास और की जोड़ - तोड़ इसलिए विकास जीवविज्ञानी के लिए एक महत्वपूर्ण तरीका है की अनुमति देता है. कई अंगों के लिए यह पूर्व vivo संस्कृति दौरान निगरानी की अनुमति के लिए विकासशील ऊतक का उपयोग करने के लिए मुश्किल है. टुकड़ा संस्कृति विधि की अनुमति देता है ऊतक के लिए उपयोग इतना है कि morphogenetic आंदोलनों का पालन किया जा सकता है और विशेष सेल आबादी में गड़बड़ी या वंश पता लगाने के लिए लक्षित किया जा सकता है.

इस पत्र में हम प्रजातियों में से एक रेंज में दांत कीटाणुओं की संस्कृति के लिए बहुत सफल रहा है कि टुकड़ा संस्कृति की एक विधि का वर्णन. विधि अन्य जबड़े ऊतकों से घिरे vivo में मनाया है कि एक समान दर से विकसित जो दांत रोगाणु, के लिए उत्कृष्ट पहुँच प्रदान करता है. यह दांत और आसपास के ऊतक के बीच ऊतक बातचीत पर नजर रखी जा करने की अनुमति देता. इस पत्र दांत कीटाणुओं पर केंद्रित है, एक ही प्रोटोकॉल एक नंबर के विकास का पालन करने के लिए लागू किया जा सकता हैऐसे लार ग्रंथियों, मेकेल उपास्थि, नाक ग्रंथियों, जीभ, और कान के रूप में अन्य अंगों, के.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

प्रयोगों की एक संख्या के लिए यह संस्कृति ऊतक पूर्व vivo विकास का पालन करने के लिए सक्षम होने के लिए महत्वपूर्ण है. ऊतक विकसित करने की संस्कृति विकास की परिभाषित समय पर पहुँच प्रदान करता है और संस्कृति के माध्यम से कारकों के अलावा द्वारा जीन की हेरफेर, या भरी हुई मनकों पर, और अभिकर्मक और electroporation 1 के उपयोग के द्वारा की अनुमति देता है. कई प्रयोगों के लिए यह रूप में यह बढ़ती ऊतक morphogenesis से होकर गुजरती रूप वंश लेबल की कोशिकाओं के भाग्य का पालन करने के लिए, उदाहरण के लिए, ऊतक कल्पना करने में सक्षम होने के लिए महत्वपूर्ण है. इस भ्रूण से ऊतक का एक ब्लॉक सुसंस्कृत है जब स्पष्ट नहीं कर रहे हैं, जो गहरे भ्रूण के भीतर विकसित ऊतकों कि, के लिए विशेष रूप से समस्याग्रस्त हो सकता है. वे जबड़ा, जबडा और ललाट नाक प्रक्रिया के भीतर विकसित रूप में दांत, इस के अच्छे उदाहरण हैं. पूरे जबड़ा सुसंस्कृत है जब तय ऊतक के सेक्शनिंग के बाद दांत की सतही संरचनाओं देखा जा सकता है लेकिन आकारिकी में परिवर्तन ही विश्लेषण किया जा सकता है 3 का उपयोग गैस तरल इंटरफेस में तकनीक संस्कृतियों दांत रोगाणु स्लाइस,. ये टुकड़ा संस्कृतियों सीधे दांत के morphogenesis निम्नलिखित, और इस तरह के तामचीनी गाँठ और दंताकुर और कूप 1,4-7 के रूप में अलग घटकों के वंश अनुरेखण अनुमति देने में बहुत उपयोगी किया गया है. तकनीक माउस भ्रूण तक सीमित नहीं है और सफलतापूर्वक सुअर की संस्कृति लाइव स्लाइस और साँप दंत ऊतक 8,9 करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. दांत विकास कल्पना करने के लिए सक्षम होने के लाभ के अलावा, टुकड़ा विधि भी ऊतक की पतली स्लाइस इनक्यूबेटर से मध्यम और हवा से पोषक तत्वों के लिए उपयोग में वृद्धि हुई है कि लाभ है. इस विवो में विकास से मेल जो दांत रोगाणु, और शो invas के बेहतर विकास में परिणामpapilla 7 में endothelial कोशिकाओं के आयन. इसके विपरीत, पूरे जबड़ा संस्कृतियों में दांत कीटाणुओं विवो में उन लोगों की तुलना में धीमी विकसित और संस्कृति के केंद्र में लंबी अवधि संस्कृतियों में परिगलित अक्सर है. टुकड़ा संस्कृति में, दांत जबड़े का एक टुकड़ा के भीतर विकसित करता है, और आसपास के विकास हड्डी और अन्य ऊतकों के साथ अपनी बातचीत पर नजर रखी जा सकती है. हमारे विधि में ऊतक सीधे एक समर्थन मध्यम 10,11 में एम्बेड करने के लिए कोई ज़रूरत नहीं है और काट खंड के लिए ऊतक संलग्न करने के लिए किसी भी प्रणाली के लिए कोई जरूरत के साथ विच्छेदन के बाद कटा हुआ है. विधि कई mandibles एक सत्र में sectioned करने की अनुमति, इसलिए noninvasive और तेजी से है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. सेट अप

  1. (खनिज तेल के साथ lubricated एक sharpening पत्थर का उपयोग) विच्छेदन उपकरणों पैनापन और एक 70% इथेनॉल स्प्रे और सूखी गर्मी नसबंदी का उपयोग अंग संस्कृति के लिए उपयोग करने से पहले बाँझ. एक 12 वी की आपूर्ति का उपयोग 2 एम सोडियम हाइड्रोक्साइड में इलेक्ट्रोलिसिस का उपयोग कर विच्छेदन सुई तेज करें.
  2. 1% GlutaMAX और 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक विकसित Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम F12 (DMEM F12) से मिलकर भ्रूण अंगों के विच्छेदन और संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया संस्कृति के माध्यम से तैयार करें.

2. भ्रूण विच्छेदन

  1. गृह मंत्रालय या अन्य शासी निकाय द्वारा अनुमोदित के रूप में एक कार्यक्रम के एक विधि का उपयोग कर एक समय mated गर्भवती महिला चुनना. पेट के निचले हिस्से के चारों ओर त्वचा दूर काटना, और कैंची का उपयोग पेट खोल काटा. कम midline पर एक साथ कनेक्ट दो गर्भाशय सींग, जानें.
  2. बर्फ पर मध्यम से भरा एक ट्यूब में गर्भाशय और जगह काटना. When बर्फ पर, ऊतक कई घंटे के लिए छोड़ा जा सकता है.
  3. खुर्दबीन के नीचे मध्यम में एक पेट्री डिश में गर्भाशय और जगह निकालें. संभव भ्रूण dissections के प्रदूषण को कम करने के लिए एक लामिना का प्रवाह हुड में प्रदर्शन किया जाना चाहिए.
  4. गर्भाशय से भ्रूण काटना और उनके extraembryonic ऊतकों से उन्हें मुक्त.
  5. एक टंगस्टन सुई का उपयोग भ्रूण सिर काटना और मध्यम की एक ताजा डिश में सिर हस्तांतरण.
  6. मौखिक गुहा में एक सुई रखकर सिर से mandibles अलग करने और सिर के पीछे (आंकड़े 1 ए और 1 बी) की ओर के माध्यम से काटा. काट के लिए इंतज़ार कर रही है, जबकि पृथक mandibles अस्थायी रूप से बर्फ पर मध्यम में संग्रहित किया जा सकता है.
  7. पूरे जबड़ा स्लाइस के लिए E11.5-E15.5 दांत रोगाणु संस्कृति के लिए आदर्श होते हैं चरणों. E15.5 बाद जबड़ा में विकासशील हड्डी काट के लिए भी मुश्किल है. टूथ स्लाइस अभी भी बनाया जा सकता है लेकिन हड्डी (दंतिकास्थि और बनाने वायुकोशीय हड्डी) पहले से हटा दिया जाना चाहिए9 काट से पहले विच्छेदन. टंगस्टन सुई और संदंश का उपयोग सावधानी से हड्डी निकालें.

3. भ्रूण टुकड़ा करने की क्रिया

  1. एक मानक तालिका ऊतक हेलिकॉप्टर (चित्रा 1C) का उपयोग जबड़ा ऊतक स्लाइस तैयार करें. लगभग 200 mandibles के बाद एक ताजा ब्लेड का प्रयोग करें, और यह गिर जाता है यह बढ़ते डिस्क के साथ फ्लश निहित सुनिश्चित करें.
  2. बढ़ते डिस्क साफ करें और उपयोग करने से पहले 70% इथेनॉल के साथ ब्लेड. मशीन का उपयोग कर जब ब्लेड बहुत तेज है के रूप में देखभाल, ले लिया जाना चाहिए.
  3. नमूना की उम्र के हिसाब से माइक्रोन 200-400 के बीच का एक काटने दूरी पर हेलिकॉप्टर सेट, और पूरे दांत रोगाणु की आवश्यकता है पर निर्भर करता है. अधिकतम पर ब्लेड बल सेट करें.
  4. एक विंदुक या संदंश का उपयोग प्लास्टिक बढ़ते डिस्क के लिए एक जबड़ा स्थानांतरण. उन्मुखीकरण अभी भी स्पष्ट है यकीन है कि डिस्क बनाने पर जबड़ा की व्यवस्था. विकासशील जीभ उन्मुखीकरण का निर्धारण करने के लिए एक उपयोगी मील का पत्थर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. दाढ़ उपयोग वायुसेना के लिएकृन्तक के लिए वे (2A चित्रा में काट के विमान को देखें) के रूप में विकसित इन दांत के विभिन्न उन्मुखीकरण को प्रतिबिंबित करने के जबड़ा के माध्यम से एक बाण के समान टुकड़ा का उपयोग करते हुए rontal / अनुप्रस्थ अभिविन्यास, (चित्रा 1 बी में काट के विमान देखें).
  5. थोड़ा बढ़ते डिस्क पर जबड़ा सूखी क्रम में फिल्टर पेपर का उपयोग ऊतक चारों ओर से अतिरिक्त मध्यम निकालें.
  6. तुरंत सुखाने के बाद, हेलिकॉप्टर के परिपत्र स्टेनलेस स्टील की मेज पर डिस्क जगह है. पर मशीन चालू करें और प्रेस शुरू. तालिका एक ही समय में ब्लेड ले जाने काट हाथ उठाया है और / मिनट के लिए 200 स्ट्रोक पर गिरा जबकि बाएं से दाएं स्वचालित रूप से बहती है.
  7. ऊतक पूरी तरह से कटा हुआ होने के बाद मशीन को बंद कर दें. ब्लेड हाथ उठाया स्थिति में है सुनिश्चित करें और डिस्क को हटा दें. ब्लेड हाथ में अंगुलियों जगह या काट जब नायाब मशीन मत छोड़ो.
  8. बढ़ते डिस्क लें और तुरंत मध्यम टी जोड़ओ क्रम में डिस्क पर स्लाइस अत्यधिक सुखाने को रोकने के लिए. ध्यान से मध्यम के एक छोटे से पेट्री डिश (2A चित्रा) में एक टंगस्टन सुई और फिर पिपेट का उपयोग डिस्क के नीचे से कटा हुआ ऊतक बेदखल.
  9. एक सुई का उपयोग स्लाइस अलग और फिर एक stereomicroscope (आंकड़े -1 डी, 1E, और 2 बी) के तहत ब्याज की ऊतक युक्त ऊतक स्लाइस का चयन करें. मध्यम के साथ ताजा संस्कृति बर्तन में चयनित स्लाइस रखें.

4. स्लाइस संस्कृति

  1. निर्जलीकरण को रोकने के लिए बाहरी अच्छी तरह से करने के लिए autoclaved पानी की लगभग 2 मिलीलीटर जोड़कर और डिश के केंद्र में एक धातु ग्रिड स्थिति से संस्कृति के लिए तैयार सेंट्रल अच्छी तरह अंग संस्कृति व्यंजन तैयार (आंकड़े 3 ए और 3 बी).
  2. लगभग 4 सेमी स्टेनलेस स्टील के जाल की चादरों से 1.5 सेमी x स्ट्रिप्स में कटौती करके धातु ग्रिड तैयार करें. बीच में एक छेद बनाने के लिए और मोड़ करने के लिए एक छेद पंच का प्रयोग करेंएक कंपित अंत बनाने के पक्ष. ग्रिड पकवान (आंकड़े 3 ए और 3 बी) के नीचे करने के लिए समानांतर झूठ बोल रही है, केंद्रीय अच्छी तरह से भर में फ्लैट फिट होना चाहिए. उपयोग करने से पहले बाँझ ग्रिड आटोक्लेव.
  3. पारदर्शी पॉलीथीन terephthalate का एक टुकड़ा ग्रिड में छेद को कवर करने के लिए काफी बड़े (पीईटी) झिल्ली (ताकना आकार 0.4 माइक्रोन) में कटौती. चयनित टुकड़ा के साथ डिश में कटौती झिल्ली रखें.
  4. झिल्ली के शीर्ष पर टुकड़ा प्लेस और फिर ध्यान से केंद्र में चपटा टुकड़ा के साथ, मध्यम से बाहर झिल्ली उठा.
  5. केंद्र में परिपत्र छेद पर ग्रिड पर फिल्टर, जगह और झिल्ली के स्तर तक, अच्छी तरह से करने के लिए संस्कृति के माध्यम से लगभग 1 मिलीलीटर जोड़ें.
  6. जोड़तोड़ (उदाहरण 8) मध्यम करने के लिए प्रोटीन या छोटे अणु inhibitors जोड़ने के लिए.
  7. संस्कृति के 0 दिन में आकृति विज्ञान का एक रिकॉर्ड के लिए टुकड़ा तस्वीर.
  8. 5% सीओ की एक humidified वातावरण में बर्तन रखें
  9. औसत पर 7 दिनों के लिए नियमित अंतराल पर संस्कृतियों तस्वीर. संस्कृति के माध्यम से हर 48-72 घंटा बदलें. फोटोग्राफी के लिए नीचे (आंकड़े -2 सी ई) से एक प्रकाश स्रोत के साथ स्लाइस देखने.

5. वंश अनुरेखण

वंश अनुरेखण की आवश्यकता है, इस तरह के DiI या डियो के रूप में lipophilic रंगों चरण 4, टुकड़ा संस्कृति से पहले दांत रोगाणु में इंजेक्ट किया जा सकता है.

  1. एक सुई खींचने का उपयोग गिलास केशिका सुई खींचो.
  2. संदंश का उपयोग कर सुई की नोक तोड़ और नीचे डाई समाधान में टिप जगह है. डाई केशिका क्रिया द्वारा टिप भरता है, जबकि कुछ मिनट के लिए छोड़ दें.
  3. एक धारक में भरा सुई प्लेस और एक सुई लगानेवाला या मुंह वातशोषक टयूबिंग के माध्यम से देते हैं.
  4. लेबल होने की वजह से टुकड़ा के क्षेत्र को छू संस्कृति के माध्यम में सुई की नोक स्थिति. सुई एक के बाहर डाई की एक छोटी राशि विस्थापित करने के लिए हवा के दबाव लागू करेंऊतक पर होगी.
  5. सुई निकालें और प्रतिदीप्ति के तहत लेबलिंग के लिए जाँच करें.
  6. सफलतापूर्वक लेबल स्लाइस फिल्टर करने के लिए स्थानांतरित और चरण 4 में वर्णित के रूप में संवर्धित किया जा सकता है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

पहली दाढ़ दंत कूप के आंदोलन का पालन करने के लिए, 250 माइक्रोन ललाट स्लाइस ऊपर वर्णित विधि का उपयोग कर एक जबड़ा के माध्यम से ले जाया गया. दंत कूप के विकास के दांत के बाहरी तामचीनी उपकला (OEE) है कि चारों ओर mesenchyme की परत है, और पहले से periodontium 6 के ऊतक के गठन में भाग लेने के लिए दिखाया गया है. Mandibles E14.5, दांत विकास की टोपी मंच पर विच्छेदित किए गए. टुकड़ा में दंत उपकला की रूपरेखा स्पष्ट था, और संघनक दंत mesenchyme दांत उपकला (चित्रा -4 ए) के चारों ओर एक गहरे रंग की अंगूठी के रूप में पहचाना जा सकता है. DiI बहुभाषी ओर (चित्रा -4 ए) पर दांत टुकड़ा के बाहरी तामचीनी उपकला के बगल में mesenchyme में इंजेक्ट किया गया था. लेबलिंग के बाद स्लाइस 4 दिनों के लिए सुसंस्कृत थे और अंतराल (आंकड़े 4B और 4C) में फोटो खिंचवाने. में vivo दांत कीटाणुओं पर पहुंच गया होताE18.5 द्वारा बेल मंच, और एक अलग घंटी चरण आकार इस समय अवधि में एक ऐसी ही प्रगति का संकेत है, स्लाइस में मनाया गया. DiI के मौके दांत (आंकड़े 4B और 4C) की वृद्धि हुई के रूप में बाहरी दंत उपकला के आसपास का विस्तार कोशिकाओं के एक बैंड में विस्तार करने के लिए देखा गया था.

चित्रा 1
चित्रा 1. लाइव स्लाइस के गठन. (ए) E14.5 भ्रूण. धराशायी लाइनों कत्ल के लिए कम कटौती के साथ शुरू, एक विदारक सुई के साथ कटौती विमानों से संकेत मिलता है. (बी) के निचले जबड़े विच्छेदित. जीभ नीचे की ओर का सामना करना पड़ रहा है. ऊतक हेलिकॉप्टर के लिए खंड के विमान धराशायी लाइनों का उपयोग कर दिखाया गया है. (सी) तैयार नमूना (तीर) के साथ ब्लेड हाथ (बीए) और सफेद बढ़ते डिस्क (एमडी) दिखा ऊतक हेलिकॉप्टर. दाढ़ के माध्यम से (डी) प्रतिनिधि टुकड़ाक्षेत्र. तीर दाढ़ दांत कीटाणुओं को इंगित करें. एक दाढ़ टुकड़ा (ई) उच्च शक्ति देखें. दांत रोगाणु उपकला काले धब्बों के साथ दिए गए है. छवियाँ फ़ोटोशॉप का उपयोग बढ़ाई. टी = भाषा, डीबी = दंतिकास्थि हड्डी, एम सी = मेकेल उपास्थि. एक = 3 मिमी में स्केल बार. बी एंड डी = 1 मिमी में स्केल बार. ई = 500 माइक्रोन में स्केल बार. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. छेनी और ग्रंथि संस्कृति. (ए) sagittally कटा गया है कि E12.5 जबड़ा. विकासशील कृन्तक (Asterix के साथ रेखांकित सफेद धब्बे) और अवअधोहनुज ग्रंथियों (काले धब्बों के साथ रेखांकित किया और arrowed) बस से बाहर किया जा सकता है. (बी) के केंद्रीय 4 स्लाइस दिखा समान जबड़ा बाहर अलग कर दिया. विकासशील अवअधोहनुज ग्रंथि गएक दो और पार्श्व वर्गों (छवि के ऊपर) में संघनित mesenchyme (तीर) से घिरा हुआ एक कली के रूप में देखा जा. ग्रंथि के आसपास संघनक mesenchyme लाल रंग में उल्लिखित है. कृन्तक दो केंद्रीय स्लाइस (छवि के नीचे) में उपकला उमड़ना मंच (Asterix) पर हैं. (सी) 0 दिवस पर E14.0 पर एक छेनी के माध्यम से बाण के समान टुकड़ा. 1 दिन बाद (डी) एक ही टुकड़ा. संस्कृति में 3 दिन के बाद (ई) एक ही टुकड़ा. (सीई) तीर अंक छेनी और ओष्ठ ग्रीवा पाश बनाने के लिए. Arrowhead अवअधोहनुज ग्रंथि के विकास के लिए कहते हैं. ग्रीवा छोरों बढ़ने के रूप में लार ग्रंथि morphogenesis और लुमेन गठन शाखाओं में गुजरना जारी है, जबकि संस्कृति में दांत रोगाणु, पीछे की ओर फैली हुई है. छवियाँ फ़ोटोशॉप का उपयोग बढ़ाई. टी = भाषा, एम सी = मेकेल उपास्थि. एक सूचना और प्रसारण = 1 मिमी में स्केल बार. सी, डी, = 500 माइक्रोन ई में स्केल बार. यहां क्लिक करेंबड़ा आंकड़ा देखने के लिए.

चित्रा 3
चित्रा 3. संस्कृति विधि. (ए) संवर्धित टुकड़ा. संस्कृति एक धातु ग्रिड के माध्यम से मध्यम पर निलंबित एक पारदर्शी फिल्टर पर बैठता है. ग्रिड में एक छेद टुकड़ा नीचे से प्रकाश के साथ कल्पना की अनुमति देता है. संस्कृति विधि (बी) योजनाबद्ध.

चित्रा 4
चित्रा 4. दंत कूप के DiI लेबलिंग. (एसी) दाढ़ दांत रोगाणु और DiI वंश लेबल के स्थान के विकास दिखा प्रकाश और अंधेरे क्षेत्र छवियों विलय कर दिया. (ए) के दिन 0. दांत रोगाणु (Arrowhead) टोपी चरण में है. DiI दांत की बहुभाषी तरफ दंत कूप की कोशिकाओं लेबल. (बी (सी) दिन 4. दांत रोगाणु घंटी चरण में पहुंच गया है और DiI लेबल की कोशिकाओं के विकास बाहरी तामचीनी उपकला चारों ओर एक चाप में बाहर फैल देखा जाता है. छवियाँ स्क्रीन मोड का उपयोग परतों विलय के बाद फ़ोटोशॉप में तेज किया गया है. दांत की उपकला काले धब्बों के साथ रेखांकित किया. आंतरिक तामचीनी उपकला भीतर झूठ बोल डी पी = दंताकुर. बाहरी तामचीनी उपकला चारों ओर चलाता है जो लोमो = चिकित्सकीय कूप,. एम सी मेकेल उपास्थि =. एक में स्केल बार, बी, सी = 500 माइक्रोन. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

दांत संस्कृति का यह तरीका दांत रोगाणु के लिए पहुंचने वाले लाभ सही वंश उपकला या mesenchyme भीतर अनुरेखण और मोतियों की नियुक्ति की अनुमति, उत्कृष्ट है है. विकासशील दांत रोगाणु के निर्धारित क्षेत्रों इसलिए विशेष रूप से निशाना बनाया जा सकता है. संस्कृति के दौरान दांत रोगाणु की बदलती आकृति विज्ञान पीछा किया जा सकता है, और जोड़तोड़ का प्रभाव जल्दी से आकलन किया.

इन सही कटा नहीं किया जा सकता के रूप में विधि, हालांकि, इस तरह के दंती और तामचीनी के रूप में मुश्किल ऊतकों की पर्याप्त गठन से पहले युवा दांत कीटाणुओं के लिए ही उपयुक्त है. Mandibles के बाद E15.5 यह काट से पहले हड्डी को दूर करने के लिए आवश्यक है. इस संभावित बारीकी E16.5 से हड्डी के साथ जुड़ा हुआ है जो दांत रोगाणु, हानिकारक का नुकसान है. हम सफलतापूर्वक दांत की वजह से तामचीनी के बयान को काटने के लिए हेलिकॉप्टर के लिए भी मुश्किल हो जाता है, जिसके बाद प्रसव के बाद दिन 4 को विच्छेदित दांत कीटाणुओं तक कटा हुआ है. टुकड़ा एमethod कली चरण 1,6 यानी, E13.5 से दांत कीटाणुओं पर अच्छी तरह से काम करता है. दांत उपकला उमड़ना चरण में है जब इस समय बिंदु से पहले, दांत कीटाणुओं को विकसित करते हैं, लेकिन सफलता की दर कम है और आकारिकी लंबे समय से अधिक प्रभावित किया जा सकता है.

विधि के साथ एक बड़ा नुकसान काट दांत के माध्यम से यादृच्छिक पर होता है. दूसरों में हेलिकॉप्टर बीच के माध्यम से दांत रोगाणु कटौती हो सकती है, जबकि कुछ स्लाइस में एक पूरे दांत रोगाणु, एक टुकड़ा के भीतर मिल जाएगा. यह बात समान स्लाइस की बड़ी संख्या को प्राप्त करना कठिन हो सकता है कि इसका मतलब है. इस समस्या से निपटने के लिए, यह मध्यम नीचे एक टुकड़ा विभाजित और प्रयोगात्मक और नियंत्रण के रूप में सही है और छोड़ दिया पक्षों का उपयोग करना संभव है. इस के लिए, हालांकि, जबड़ा ध्यान से टुकड़ा संतुलित रूप से कट जाता है यह सुनिश्चित करने के लिए काट डिस्क पर रखा जाना चाहिए. कुछ प्रयोगों के लिए यह दांत काटना कि स्लाइस है करने के लिए एक लाभ यह है कि इसलिए इस तरह के तामचीनी के रूप में आंतरिक संरचना,गाँठ, वंश लेबलिंग 4 के लिए पहुँचा जा सकता है. दांत रोगाणु बहुत मजबूत दिखाई देता है और पहले से आधी दाढ़ दांत रोगाणु 12,13 में दिखाया गया है जैसे आधा दांत रोगाणु, संस्कृति में अच्छी तरह से विकसित करने में सक्षम हैं.

संस्कृति टुकड़ा करने के लिए एक विकल्प के रूप में, दांत कीटाणुओं जबड़ा और अलगाव 14 में सुसंस्कृत से बाहर विच्छेदित किया जा सकता है. इस ऊतक के बड़े ब्लॉकों संवर्धन के साथ जुड़े गरीब पोषण और ऑक्सीजन की समस्या दूर करता है और अच्छा दांत विकास की ओर जाता है, लेकिन एक परिणाम के रूप में दांत के आसपास के ऊतकों के साथ बातचीत के बिना विकसित करता है. आसपास के mesenchyme की बड़ी मात्रा को हटा रहे हैं कि फार्म दांत कीटाणुओं की संख्या सामान्य दांत विकास 15 के लिए आसपास के mesenchyme के महत्व पर प्रकाश डाला, बदला जा सकता है. स्लाइस संस्कृति इसलिए हड्डी और दांत वायुकोशीय हड्डी के गठन में बातचीत कैसे उदाहरण के लिए, ऊतकों का अध्ययन बातचीत, या कैसे साली के लिए एक अच्छा तरीका हैग्रंथियों जीभ और मौखिक उपकला, इन ऊतकों अलगाव में सुसंस्कृत हैं जब खो जाता है कि कुछ के साथ बातचीत बदलती हैं.

इस पत्र दांत कीटाणुओं संवर्धन के लिए इस विधि का उपयोग पर प्रकाश डाला गया है, लेकिन एक ही विधि भी विकासशील अवअधोहनुज और मांसल ग्रंथियां संवर्धन और ऐसे मेकेल उपास्थि (चित्रा 2) के रूप में ढांचे के विकास के बाद के लिए उत्कृष्ट है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

सारा ए Alfaqeeh दंत चिकित्सा, उच्च शिक्षा मंत्रालय, सऊदी अरब के राज्य की तरह सऊद यूनिवर्सिटी कॉलेज द्वारा वित्त पोषित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethanol VWR 101077Y 100% ethanol was diluted in distilled H2O to 70%.
DMEM F12 Gibco 12634-010 Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12
GlutaMAX Gibco 35050-061
Penicillin-streptomycin Sigma P0781
DiI (Molecular probes) Vybrant V-22885 Cell-labeling solution
Invitrogen Cell tracker CM-DiI, C-7000
DiO (Molecular probes) Vybrant V22886
Geminator 500 Thomas Thomas No. 3885A20 Dry-heat sterilization
McIlwain tissue chopper Ted Pella, Inc. 10180 Standard table
Organ culture dish (Center-Well Organ Culture Dish) Falcon 353037
Membranes (Cell Culture Inserts, 0.4 μm pore size) BD Falcon 353090 PET track-etched membrane, 6-well format
Metal grids (Stainless Steel - AISI 304 - Mesh) Goodfellow FE228710 (Fe/Cr18/Ni10)
AutoFlow Direct Heat CO2 Incubator Nuaire NU-5500
Picospritzer III Intracel Ltd 051-0500-900 0-100 psi Single channel picospritzer III
Glass capillary with filament 1 mm WPI TW100F-4
Tungsten wire 0.1 mm Goodfellow W005138
Tungsten wire 0.38 mm Goodfellow W005155
Aspirator tubes Sigma A5177 Used for mouth aspiration lineage tracers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rothova, M., Peterkova, R., Tucker, A. S. Fate map of the dental mesenchyme: dynamic development of the dental papilla and follicle. Developmental biology. 366, 244-254 (2012).
  2. Ferguson, C. A., et al. Activin is an essential early mesenchymal signal in tooth development that is required for patterning of the murine dentition. Genes & development. 12, 2636-2649 (1998).
  3. Trowell, O. A. The culture of mature organs in a synthetic medium. Experimental cell research. 16, 118-147 (1959).
  4. Matalova, E., Antonarakis, G. S., Sharpe, P. T., Tucker, A. S. Cell lineage of primary and secondary enamel knots. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 233, 754-759 (2005).
  5. Mitsiadis, T. A., Tucker, A. S., De Bari, C., Cobourne, M. T., Rice, D. P. A regulatory relationship between Tbx1 and FGF signaling during tooth morphogenesis and ameloblast lineage determination. Developmental biology. 320, 39-48 (2008).
  6. Diep, L., Matalova, E., Mitsiadis, T. A., Tucker, A. S. Contribution of the tooth bud mesenchyme to alveolar bone. Journal of experimental zoology. Part B, Molecular. 312B, 510-517 (2009).
  7. Rothova, M., Feng, J., Sharpe, P. T., Peterkova, R., Tucker, A. S. Contribution of mesoderm to the developing dental papilla. The International journal of developmental biology. 55, 59-64 (2011).
  8. Buchtova, M., et al. Initiation and patterning of the snake dentition are dependent on Sonic hedgehog signaling. Developmental biology. 319, 132-145 (2008).
  9. Buchtova, M., Stembirek, J., Glocova, K., Matalova, E., Tucker, A. S. Early regression of the dental lamina underlies the development of diphyodont dentitions. Journal of dental research. 91, 491-498 (2012).
  10. Cho, S. W., et al. The primary enamel knot determines the position of the first buccal cusp in developing mice molars. Differentiation; research in biological diversity. 75, 441-451 (2007).
  11. Sakano, M., et al. Cell dynamics in cervical loop epithelium during transition from crown to root: implications for Hertwig's epithelial root sheath formation. Journal of periodontal research. (2012).
  12. Fisher, A. R. Morphological development in vitro of the whole and halved lower molar tooth germ of the mouse. Archives of oral biology. 16, 1481-1496 (1971).
  13. Coin, R., Schmitt, R., Lesot, H., Vonesch, J. L., Ruch, J. V. Regeneration of halved embryonic lower first mouse molars: correlation with the distribution pattern of non dividing IDE cells, the putative organizers of morphogenetic units, the cusps. The International journal of developmental biology. 44, 289-295 (2000).
  14. Kavanagh, K. D., Evans, A. R., Jernvall, J. Predicting evolutionary patterns of mammalian teeth from development. Nature. 449, 427-432 (2007).
  15. Munne, P. M., Tummers, M., Jarvinen, E., Thesleff, I., Jernvall, J. Tinkering with the inductive mesenchyme: Sostdc1 uncovers the role of dental mesenchyme in limiting tooth induction. Development. 136, 393-402 (2009).
Explant संस्कृति में दांत कीटाणुओं के विकास के बाद के लिए टुकड़ा संस्कृति विधि
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Alfaqeeh, S. A., Tucker, A. S. The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture. J. Vis. Exp. (81), e50824, doi:10.3791/50824 (2013).More

Alfaqeeh, S. A., Tucker, A. S. The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture. J. Vis. Exp. (81), e50824, doi:10.3791/50824 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter