Summary
Aqui detalhamos um método para germes dentários cultura em fatias mandíbula usando um cortador de tecidos. Este método permite acesso exclusivo ao dente durante o desenvolvimento, proporcionando uma excelente oportunidade para a manipulação e linhagem de rastreamento, não está disponível através de métodos de cultura mais tradicionais.
Abstract
Cultura explante permite a manipulação de órgãos em desenvolvimento em pontos de tempo específicos e é, portanto, um método importante para a biologia do desenvolvimento. Para muitos órgãos é de difícil acesso tecido em desenvolvimento para permitir o monitoramento durante ex vivo da cultura. O método de cultura fatia permite o acesso ao tecido para que os movimentos morfogenéticos podem ser seguidas e populações de células específicas podem ser direcionados para a manipulação ou o rastreamento de linhagem.
Neste artigo descrevemos um método de cultura fatia que tem sido muito bem sucedido para a cultura de germes dentários em uma variedade de espécies. O método proporciona um acesso excelente para os germes de dentes, que se desenvolvem a uma taxa semelhante à observada in vivo, rodeado por outros tecidos maxila. Isto permite que as interacções de tecido entre o dente e tecido circundante a ser monitorizado. Embora este documento concentra-se germes de dente, o mesmo protocolo pode ser aplicado para seguir o desenvolvimento de uma sériede outros órgãos, tais como as glândulas salivares, cartilagem de Meckel, glândulas nasais, língua e orelha.
Introduction
Para um número de experiências é importante ser capaz de cultura de tecidos ex vivo para seguir o desenvolvimento. Cultura de desenvolvimento do tecido proporciona acesso em períodos definidos de desenvolvimento e permite a manipulação de genes através da adição de factores para o meio de cultura, ou em pérolas carregadas, e pela utilização de transfecção e electroporação 1. Para muitos ensaios, é importante ser capaz de visualizar o tecido à medida que cresce, por exemplo, para seguir o destino de células de linhagem rotulado como o tecido é submetido a morfogénese. Isto pode ser particularmente problemática nos tecidos que se desenvolvem de profundidade dentro do embrião, que não são óbvias, quando um bloco de tecido a partir do embrião é cultivado. Os dentes são bons exemplos disso, como elas se desenvolvem dentro do processo nasal mandíbula, maxilar e frontal. Quando toda a mandíbula é cultivaram as estruturas superficiais do dente podem ser vistos, mas as alterações na morfologia só pode ser analisado depois de seccionamento do tecido fixado
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Protocol
1. Estabelecer
- Afiar instrumentos de dissecção (utilizando uma pedra de afiar lubrificado com óleo mineral) e esterilizar antes da sua utilização para a cultura de órgãos, utilizando um pulverizador de etanol a 70% e a esterilização por calor seco. Afie as agulhas de dissecação através da eletrólise em hidróxido de sódio 2 M usando uma alimentação de 12 V.
- Preparar o meio de cultura utilizado para a dissecção e a cultura de órgãos embrionários, que consiste de Meio de Eagle Modificado F12 da Dulbecco avançada (DMEM F12) suplementado com 1% GlutaMAX e 1% de penicilina-estreptomicina.
2. Embrião Dissection
- Cull uma fêmea grávida acoplado cronometrado usando uma programação um método aprovado pelo Ministério do Interior ou outro órgão de governo. Dissecar longe a pele ao redor do abdômen inferior, e abriu o abdome com uma tesoura. Localize os dois cornos uterinos, que ligam juntos na linha média inferior.
- Dissecar o útero e coloque em um tubo cheio de médio no gelo. When em gelo, o tecido pode ser deixada durante várias horas.
- Remover o útero e lugar em uma placa de Petri em meio sob o microscópio. Sempre que possível, dissecações embriões devem ser realizados numa hote de fluxo laminar para minimizar a contaminação.
- Dissecar os embriões do útero e libertá-los de seus tecidos extra-embrionário.
- Decapitar os embriões utilizando uma agulha de tungstênio e transferir as cabeças em um novo prato de meio.
- Isolar as mandíbulas de cabeças, colocando uma agulha para dentro da cavidade oral e cortar para a parte de trás da cabeça (Figuras 1A e 1B). Isolados mandíbulas podem ser temporariamente armazenados em meio no gelo enquanto espera para cortar.
- Para fatias inteiras mandíbula encena E11.5-E15.5 são ideais para a cultura do germe do dente. Após E15.5 o osso da mandíbula em desenvolvimento é muito difícil para cortar. Fatias de dentes ainda podem ser feitas, mas o osso (osso alveolar dentário e formação) devem ser previamente removidos pordissecção antes de cortar 9. Remover osso cuidadosamente o uso de agulhas de tungstênio e fórceps.
3. Embrião Fatias
- Preparar as fatias de tecido de mandíbula usando um cortador de tecido tabela padrão (Figura 1C). Use uma lâmina nova após cerca de 200 mandíbulas, e certifique-se que se encontra alinhado com o disco de montagem quando cai.
- Limpar o disco de montagem e lâmina com etanol 70% antes da utilização. Cuidados devem ser tomados ao utilizar a máquina, como a lâmina é muito afiada.
- Definir o helicóptero, a uma distância de corte de entre 200-400 mm de acordo com a idade do espécime, e dependendo se todo o germe do dente é necessária. Defina a força da lâmina no máximo.
- Transferir uma mandíbula para o disco de montagem de plástico com uma pipeta ou uma pinça. Organizar a mandíbula sobre a produção do disco se de que a orientação ainda é clara. A língua em desenvolvimento pode ser usada como um ponto de referência útil para determinar a orientação. Para molares uso afRontal / orientação transversal (ver plano de corte na Figura 1B), enquanto que para os incisivos usar um corte sagital através da mandíbula para refletir a diferente orientação desses dentes à medida que crescem (ver plano de corte na Figura 2A).
- Remover o excesso de meio de todo o tecido, utilizando papel de filtro, a fim de secar ligeiramente a mandíbula no disco de montagem.
- Imediatamente após a secagem, coloque o disco na mesa de aço inoxidável circular de helicóptero. Ligue a máquina e começar a pressionar. A mesa desloca automaticamente a partir da esquerda para a direita e, ao mesmo tempo, o braço de desbastamento levando a lâmina é levantado e deixado cair em até 200 batimentos / min.
- Desligue a máquina uma vez que o tecido foi completamente cortado. Certifique-se o braço da pá está na posição levantada e remover o disco. Não coloque os dedos debaixo do braço lâmina ou deixar a máquina sem vigilância quando cortar.
- Pegue o disco de montagem e adicionar imediatamente médio to as fatias no disco, a fim de evitar o ressecamento excessivo. Cuidadosamente desalojar o tecido cortado a partir da parte inferior do disco, utilizando uma agulha de tungsténio e, em seguida, pipeta numa pequena placa de Petri com meio (Figura 2A).
- Separe as fatias usando uma agulha e, em seguida, selecione as fatias de tecido contendo o tecido de interesse sob um microscópio estereoscópico (Figuras 1D, 1E, e 2B). Coloque fatias selecionadas em placas de cultura com meio fresco.
4. Fatia Cultura
- Preparar pratos de órgãos centrais poços de cultura, prontos para a cultura através da adição de cerca de 2 ml de água esterilizada para o poço externo para impedir a desidratação, e pelo posicionamento de uma grade de metal através do centro do prato (Figuras 3A e 3B).
- Prepare grades metálicas cortando tiras aproximadamente 4 cm x 1,5 cm, a partir de folhas de malha de aço inoxidável. Use um furador para fazer um buraco no centro e dobreos lados para criar um final escalonada. A grelha deve ficar plano através do poço central, encontra-se em paralelo ao fundo do prato (Figuras 3A e 3B). Autoclave as grades para esterilizar antes da utilização.
- Cortar um pedaço de tereftalato de polietileno transparente (PET) de membrana (dimensão de poro 0,4 um) suficientemente grande para cobrir o furo na grade. Coloque a membrana corte no prato com a fatia selecionada.
- Coloque a fatia sobre a membrana e, em seguida, levante cuidadosamente a membrana fora do meio, com fatia achatada no centro.
- Colocar o filtro da grelha sobre o orifício circular no centro, e adicionar cerca de 1 ml de meio de cultura para o poço, até ao nível da membrana.
- Para manipulações adicionar proteínas ou inibidores de moléculas pequenas para o meio (por exemplo 8).
- Fotografar a fatia para um registro de morfologia no dia 0 de cultura.
- Colocar as cápsulas numa atmosfera húmida de 5% de CO
- Fotografar as culturas em intervalos regulares para, em média, 7 dias. Altere o meio de cultura a cada 48-72 horas. Para a fotografia visualizar as fatias com uma fonte de luz por baixo (Figuras 2C-E).
5. Lineage Tracing
Se o rastreamento de linhagem é necessária, corantes lipofílicos, como DII ou DiO pode ser injetado no germe do dente antes do passo 4, a cultura fatia.
- Puxe agulhas capilares de vidro usando um extrator de agulha.
- Quebrar a ponta da agulha com a pinça e colocar ponta para baixo para dentro da solução corante. Deixe por alguns minutos, enquanto o corante enche a ponta por ação capilar.
- Coloque a agulha colocada em um suporte e anexar via tubulação para um injetor ou a boca do aspirador.
- Posicionar a ponta da agulha no meio de cultura que toca a área da fatia devido a ser rotulada. Aplicar pressão de ar para deslocar uma quantidade pequena de corante para fora da agulhad para o tecido.
- Remova a agulha e verificar se a rotulagem sob fluorescência.
- Fatias marcadas com sucesso pode ser transferido para filtros e cultivados como descrito no passo 4.
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Representative Results
De modo a seguir o movimento do primeiro folículo molar, 250 mM fatias frontais foram tomadas através de uma mandíbula, utilizando o método descrito acima. O folículo é a camada de mesênquima que rodeia o esmalte epitélio exterior (OEE) do dente em desenvolvimento, e tem sido mostrado previamente para participar na formação de tecido do periodonto 6. Mandíbulas foram dissecadas na E14.5, o estágio tampa do desenvolvimento dentário. No corte do contorno do epitélio dental foi claro, e o mesênquima dentário de condensação pode ser identificado como um anel em torno de mais escuro do epitélio do dente (Figura 4A). DII foi injectado no mesênquima ao lado do epitélio do esmalte exterior do corte de dente no lado lingual (Figura 4A). Após a marcação das fatias foram cultivadas durante 4 dias e fotografada em intervalos (Figuras 4B e 4C). In vivo os germes dente teria atingidoa fase de sino por E18.5, e uma forma de sino fase distinta foi observada nas fatias, indicando uma progressão semelhante ao longo deste período de tempo. O ponto de DII foi visto para se estender para uma banda de células que se prolongam em torno do epitélio dental exterior como o dente cresceu (Figuras 4B e 4C).
Figura 1. Formação de fatias ao vivo. (A) embrião E14.5. As linhas tracejadas indicam os planos cortados com uma agulha de dissecação, começando com o corte inferior por decapitação. (B) dissecado maxilar inferior. A língua é virada para baixo. O plano de secção para o helicóptero tecido é mostrado usando linhas tracejadas. (C) Tecido triturador mostrando lâmina braço (BA) e disco de montagem branco (MD) com a amostra preparada (seta). (D) fatia Representante através do molarregião. As setas indicam a germes dentários molares. (E) de alta potência vista de uma fatia do molar. O epitélio germe dentário é descrito com manchas pretas. Imagens afiada usando o Photoshop. T = Língua, DB = dentário osso, cartilagem MC = de Meckel. Barra de escala em A = 3 mm. Barra de escala em B & D = 1 mm. Barra de escala em E = 500 mm. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 2. Incisivo e cultura glândula. (A) E12.5 Mandíbula que foi picado sagital. Desenvolvendo incisivos (manchas brancas delineadas com asterisco) e submandibular (esboçado com manchas pretas e com setas) pode ser feito apenas para fora. (B) O mesmo mandíbula mostrando centrais 4 fatias separadas. O desenvolvimento da glândula submandibular cum ser visto como um broto cercado por mesênquima condensado (setas) nas duas seções mais laterais (parte superior da imagem). A condensação mesênquima em torno da glândula é esboçado no vermelho. Os incisivos estão em fase epitelial espessamento (asterisco) nas duas fatias centrais (parte inferior da imagem). (C) corte sagital através de um incisivo em E14.0 no Dia 0. (D) A mesma fatia um dia mais tarde. (E) da mesma fatia após 3 dias em cultura. (EC) seta aponta para incisivo e formando alça cervical labial. Arrowhead aponta para o desenvolvimento da glândula submandibular. Na cultura do germe do dente se estende para trás como os lacetes cervicais crescer, enquanto a glândula salivar continua a passar por ramificação morfogénese e formação de lúmen. Imagens afiada usando o Photoshop. T = Língua, cartilagem MC = de Meckel. Barra de escala em A & B = 1 mm. Barra de escala em C, D, E = 500 mm. Clique aquipara ampliar figura.
Figura 3. Método Cultura. (A) fatia Cultivadas. A cultura fica em um filtro transparente suspensa sobre meio através de uma grade de metal. Um furo na grade permite que a fatia a ser visualizada com luz abaixo. (B) Esquema do método de cultura.
Figura 4. Rotulagem DII do folículo dental. (AC) Incorporada de luz e de campo escuro imagens que mostram o desenvolvimento do germe do dente molar e localização do rótulo linhagem DII. (A) Dia 0. O germe do dente (ponta de seta) está em fase de boné. DII rótulos células do folículo dental do lado lingual do dente. (B (C) Dia 4. O germe do dente alcançou o estágio de sino e as células DII rotulados são vistos a espalhar-se em um arco em torno do desenvolvimento de epitélio do esmalte exterior. Imagens foram afiada no Photoshop depois de mesclar camadas usando o modo de ecrã. Epitélio de dente delineado com manchas pretas. DP = papila dentária situada no epitélio interno do esmalte. DF = folículo dental, que corre ao redor do epitélio do esmalte exterior. MC = cartilagem de Meckel. Barra de escala em A, B, C = 500 mm. Clique aqui para ver maior figura .
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Discussion
Este método de cultura de dentes tem a vantagem de que o acesso ao germe do dente é excelente, permitindo linhagem precisas rastreio e colocação de grânulos no interior do epitélio ou mesênquima. Regiões definidas do germe do dente em desenvolvimento pode, por conseguinte, ser dirigida especificamente. Durante a cultura a morfologia mudança do germe do dente podem ser seguidos, e o efeito de manipulações rapidamente avaliada.
O método, no entanto, é apenas apropriado para germes dentários jovens antes da formação substancial de tecidos duros, como o esmalte e dentina, uma vez que estas não podem ser cortados com precisão. Para mandíbulas após E15.5 é necessário remover o osso antes de cortar. Isto tem a desvantagem de potencialmente prejudicar o germe do dente, que está intimamente associada com o osso do E16.5. Temos cortado com sucesso germes dentários dissecados até dia pós-natal 4, após o qual o dente torna-se muito difícil para o helicóptero para cortar devido à deposição de esmalte. A fatia método funciona bem em germes dentários de E13.5, ou seja, a fase de botão 1,6. Antes deste ponto de tempo, quando o dente está em fase de espessamento epitelial, os germes de dentes se desenvolvem, mas a taxa de sucesso é reduzida e a morfologia pode ser afectada a longo prazo.
Uma grande desvantagem com o método é que o corte ocorre ao acaso através do dente. Em algumas fatias de um germe de dente inteiro será encontrada dentro de uma fatia, enquanto em outros o helicóptero pode cortar o germe do dente no meio. Isto significa que pode ser difícil obter um grande número de cortes idênticos. Para combater este problema, é possível dividir uma fatia ao meio e usar os lados direito e esquerdo como experimental e de controlo. Para isso, no entanto, a mandíbula têm de ser cuidadosamente colocado sobre o disco de corte para assegurar a fatia é cortada de forma simétrica. Para algumas experiências, é uma vantagem ter fatias que disseca o dente, de modo que as estruturas internas, tais como o esmaltenó, pode ser acessado por linhagem rotulagem 4. O germe do dente parece muito robusto e esses germes meio dente são capazes de desenvolver bem em cultura, como anteriormente mostrado na germes dentários molares pela metade 12,13.
Como uma alternativa para cortar cultura, os germes de dentes podem ser dissecados para fora da mandíbula e cultivadas em isolamento 14. Isso elimina o problema da má nutrição e oxigenação associada à cultura de grandes blocos de tecido e leva ao bom desenvolvimento dos dentes, mas como conseqüência o dente se desenvolve sem interação com o tecido circundante. Quando grandes quantidades de mesênquima circundantes são removidos o número de germes dentários que se formam podem ser alteradas, destacando a importância do mesênquima circundante para o desenvolvimento normal do dente 15. Fatia de cultura é, por conseguinte, um bom método para estudar as interacções de tecidos, por exemplo, como o osso e dente de interagir na formação do osso alveolar, ou como o salivariar glândulas interagir com a lingueta e do epitélio bucal, algo que é perdida quando esses tecidos são cultivadas isoladamente.
Este documento realça a utilização deste método para a cultura das bactérias dos dentes, mas o mesmo método também é excelente para a cultura em desenvolvimento a glândula submandibular e sublingual e acompanhando o desenvolvimento de estrutura, tais como a cartilagem de Meckel (Figura 2).
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Sarah A. Alfaqeeh é financiado pelo tipo Saud University College of Dentistry, Ministério do Ensino Superior, Reino da Arábia Saudita.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR | 101077Y | 100% ethanol was diluted in distilled H2O to 70%. |
| DMEM F12 | Gibco | 12634-010 | Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P0781 | |
| DiI (Molecular probes) | Vybrant | V-22885 | Cell-labeling solution |
| Invitrogen | Cell tracker CM-DiI, C-7000 | ||
| DiO (Molecular probes) | Vybrant | V22886 | |
| Geminator 500 | Thomas | Thomas No. 3885A20 | Dry-heat sterilization |
| McIlwain tissue chopper | Ted Pella, Inc. | 10180 | Standard table |
| Organ culture dish (Center-Well Organ Culture Dish) | Falcon | 353037 | |
| Membranes (Cell Culture Inserts, 0.4 μm pore size) | BD Falcon | 353090 | PET track-etched membrane, 6-well format |
| Metal grids (Stainless Steel - AISI 304 - Mesh) | Goodfellow | FE228710 | (Fe/Cr18/Ni10) |
| AutoFlow Direct Heat CO2 Incubator | Nuaire | NU-5500 | |
| Picospritzer III | Intracel Ltd | 051-0500-900 0-100 psi | Single channel picospritzer III |
| Glass capillary with filament 1 mm | WPI | TW100F-4 | |
| Tungsten wire 0.1 mm | Goodfellow | W005138 | |
| Tungsten wire 0.38 mm | Goodfellow | W005155 | |
| Aspirator tubes | Sigma | A5177 | Used for mouth aspiration lineage tracers |
References
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