FtsZ Polymerization Analyser: enkle protokoller og overvejelser

Abstract

Under bakteriel celledeling den væsentlige protein FtsZ samles i midten af ​​cellen til dannelse af den såkaldte Z-ringen. FtsZ polymeriserer i lange filamenter i nærvær af GTP in vitro, og polymerisation er reguleret af flere accessoriske proteiner. FtsZ polymerisation er blevet grundigt undersøgt in vitro ved hjælp af grundlæggende metoder, herunder lysspredning, sedimentering, GTP hydrolyse-assays og elektronmikroskopi. Buffer forhold påvirker både polymerisationsaddukterne egenskaber FtsZ, og evnen til FtsZ at interagere med regulatoriske proteiner. Her beskriver vi protokoller for FtsZ polymerisationsteknikker studier og validere betingelser og kontrol ved hjælp af Escherichia coli og Bacillus subtilis FtsZ som model proteiner. En lav hastighed sedimentation assay indføres der tillader undersøgelse af interaktionen af ​​FtsZ med proteiner, der sammensætter eller tubulate FtsZ polymerer. En forbedret GTPase assay protokol er beskrevet som tillader testningGTP hydrolyse over tid ved hjælp af forskellige betingelser i en 96-brønds plade opsætning med standardiserede inkubationstider der ophæver farvevariation udvikling i phosphat påvisningsreaktion. Forberedelsen af ​​prøver til lysspredning studier og elektronmikroskopi er beskrevet. Adskillige buffere bruges til at etablere passende pH og saltkoncentration for FtsZ polymerisationsteknikker studier. En høj koncentration af KCl er bedst for de fleste af forsøgene. Vores metoder giver et udgangspunkt for in vitro karakteriseringen af FtsZ, ikke kun fra E. coli og B. subtilis, men fra en anden bakterie. Som sådan kan de metoder, der anvendes til undersøgelser af interaktionen af ​​FtsZ med regulatoriske proteiner eller afprøvning af antibakterielle lægemidler, der kan påvirke FtsZ polymerisation.

Introduction

Den væsentlige bakterielt protein FtsZ er bedst karakteriserede protein bakterielle celledeling maskiner. FtsZ er den prokaryote homolog af tubulin og polymeriserer in vitro i en GTP-afhængig måde. FtsZ er et meget attraktivt mål for nye antibiotika på grund af sin bevarede natur og unikke til bakterier ^1,2. I begyndelsen af ​​celledeling, FtsZ danner en cytokinetic ring på midcell, der tjener som et stillads til samling af andre celledeling proteiner. Dannelse af Z-ringen er af afgørende betydning for korrekt lokalisering af divisionen flyet. Monteringsvejledningen dynamik FtsZ er reguleret af flere accessoriske proteiner, såsom (afhængigt af bakteriearter) Minc, SepF, Zapa, UgtP og Ezra ^2.. FtsZ polymerisering har været intensivt undersøgt in vitro og mange forskellige strukturer, herunder lige protofilamenter, buede protofilamenter, plader af filamenter, bundter af filamenter og rør af filamenter har været destilskrevet efter samling buffer, nukleotid og yderligere proteiner, der indgår i analysen ^3. Arkitekturen i FtsZ protofilamenter in vivo er endnu ikke fuldt forstået, selvom elektron cryotomography eksperimenter i Caulobacter crescentus tyder på, at Z-ringen er samlet fra relativt korte, ikke sammenhængende enkelt protofilamenter uden omfattende bundling ^4.

In vitro polymerisationen egenskaber FtsZ og interaktion FtsZ med regulatoriske proteiner er følsomme over for sammensætningen af reaktionsbuffer. For eksempel har vi for nylig beskrev samspillet site for SepF på FtsZ C-terminalen og viste, at en FtsZ _B Δ16 C-terminal truncate ikke længere binder til SepF ^5.. I en tidligere undersøgelse om SepF-FtsZ _Bs interaktion, trunkere en lignende FtsZ _B Δ16 stadig cosedimented med SepF, som foreslog, at SepF binder sig til et sekundært site på FtsZ et al. bemærkes, at SepF ikke er funktionelt, og præcipiterer ved pH 6,5 ^7, viser, at den observerede cosedimentation ved pH 6,5 forventes at være forårsaget af udfældning af SepF snarere end interaktion med FtsZ _B Δ16 C-terminal truncate. Indflydelsen af ​​pH og KCl-koncentration på polymerisationen af ​​FtsZ er tidligere blevet undersøgt. Polymerer af E. coli FtsZ (FtsZ _Ec) ved pH 6,5 er længere og mere rigelig end dem, der dannes ved neutral pH ^8,9. Tadros et al. har studeret polymerisering af FtsZ _Ec i overværelse af monovalente kationer bemærke, at K ⁺ binding er knyttet til FtsZ _Ec polymerisation og er afgørende for FtsZ aktivitet ^10. PH er mere critical, når interaktionen af FtsZ med andre proteiner er undersøgt, som det fremgår af det foregående eksempel SepF og pH-afhængigheden af den hæmmende virkning af Minc på FtsZ ^11. Da både pH og saltkoncentration kan påvirke samspillet mellem FtsZ med andre proteiner, er det vigtigt at vælge de rigtige betingelser og kontrolforanstaltninger for FtsZ polymerisationsteknikker studier.

Her beskriver vi protokoller til at studere FtsZ polymerisation og GTPase aktivitet ved lysspredning, elektronmikroskopi, sedimentering og GTPase assays. Højre vinkel lysspredning er en standard metode til at studere FtsZ polymerisation i real tid ^12. Vi introducerede et par forbedringer til sedimentering og GTPase assay. Vi præsenterer i detaljer, hvordan at forberede prøver til lysspredning og elektronmikroskopi. Adskillige buffere anvendt i litteraturen til at studere FtsZ polymerisation blev testet, og vi beskriver de bedste betingelser for hvert forsøg. Vi viser også, hvilke kontroller skalindført for at opnå de bedste data.

Disse metoder tillader en hurtig undersøgelse af FtsZ polymerisation, aktivitet og interaktion med andre proteiner ved hjælp af simple metoder og udstyr, som er tilgængelig i de fleste laboratorier. Der findes mere sofistikerede metoder til at studere FtsZ polymerisation, men kræver ofte adgang til mere specialiseret udstyr og / eller ændring af FtsZ med fluorescensmærker ^8,13,14. De enkle metoder, der er beskrevet i dette papir illustreres ved hjælp FtsZ fra B. subtilis og E. coli, den mest almindelige Gram + og Gram-modelorganismer. Protokollerne kan tilpasses til enhver anden FtsZ protein. På grundlag af foreløbige analyser med disse nye FtsZs, små ændringer vedrørende tid, buffer eller inkubationstemperaturen kan være nødvendigt for et optimalt resultat. De her beskrevne eksperimenter skal hjælpe med at finde disse optimale betingelser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GTP	Roche	10106399001	Part 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7
Thickwall Polycarbonate Tubes	Beckman Coulter	343776	Part 2
Optima MAX-XP Ultracentrifuge	Beckman Coulter	393315	Part 2, 3
Polyallomer Tube with Snap-on Cap	Beckman Coulter	357448	Part 3
AIDA Bio-package, 1D, 2D, FL	Raytest Isotopenmessgeräte GmbH	15000001	Part 4
Luminescence Image Analyzer LAS-4000	Fujifilm		Part 4
Thermo Spectronic AMINCO-Bowman Luminescence Spectrometer	Spectronic Instruments		Part 5
Fluorescence Cell	Hellma Analytics	105-250-15-40	Part 5
Square 400 Mesh, Copper, 100/vial	Electron Microscopy Sciences	G400-Cu	Part 6
CM120 Electron Microscope Operating at 120 kV	Philips		Part 6
96 ml x 0.2 ml Plate	BIOplastics	B70501	Part 7
Malachite Green Phosphate Assay Kit	BioAssay System	POMG-25H	Part 7
PowerWave HT Microplate Spectrophotometer	BioTek		Part 7