FtsZ polymerisation Analyser: Enkla protokoll och Överväganden

Abstract

Under bakteriell celldelning, monterar den väsentliga protein FtsZ i mitten av cellen för att bilda det så kallade Z-ringen. FtsZ polymeriserar till långa filament, i närvaro av GTP in vitro, och polymerisation regleras av flera accessoriska proteiner. FtsZ polymerisationen har studerats in vitro genom att använda grundläggande metoder inklusive ljusspridning, sedimentering, GTP-hydrolys-analyser och elektronmikroskopi. Buffertbetingelser påverkar både polymerisations egenskaper FtsZ, och förmågan av FtsZ att interagera med regulatoriska proteiner. Här beskriver vi protokoll för FtsZ polymerisationsbetingelser studier och validera villkor och kontroller genom att använda Escherichia coli och Bacillus subtilis FtsZ som modellproteiner. En låg hastighet sedimente assay införes som tillåter studiet av interaktionen av FtsZ med proteiner som bunt eller tubulate FtsZ polymerer. En förbättrad GTPase analysprotokoll beskrivs som tillåter testningav GTP-hydrolys med tiden med användning av olika förhållanden i en 96-brunnars platta konfiguration, med standardiserade inkubationstider som avskaffar variation i färgutveckling i fosfatdetektionsreaktionen. Beredningen av prover för ljusspridande studier och elektronmikroskopi beskrivs. Flera buffertar används för att fastställa lämplig buffert, pH och saltkoncentration för FtsZ polymerisationsbetingelser studier. En hög koncentration av KCl är bäst för de flesta experimenten. Våra metoder ger en utgångspunkt för vitro karakterisering av FtsZ, inte bara från E. coli och B. subtilis utan från någon annan bakterie. Som sådana kan de metoder som skall användas för studier av interaktionen av FtsZ med reglerande proteiner eller utprovning av antibakteriella läkemedel som kan påverka FtsZ polymerisation.

Introduction

Den väsentliga bakterieprotein FtsZ är den bäst karakteriserade proteinet av bakterie celldelning maskiner. FtsZ är den prokaryota homolog av tubulin och polymeriserar in vitro i ett GTP-beroende sätt. FtsZ är ett mycket attraktivt mål för nya antibiotika på grund av dess bevarade naturen och unikhet till bakterier ^1,2. I början av celldelning, bildar FtsZ en cytokinetic ring vid midcell, som fungerar som en byggnadsställning för montering av andra celldelningsproteiner. Bildning av det Z-ringen är av avgörande betydelse för korrekt lokalisering av delningsplanet. Monterings dynamik FtsZ regleras av flera accessoriska proteiner, såsom (beroende på bakteriearten) minc, SepF, Zapa, UgtP och Ezra ^2. FtsZ polymerisation har intensivt studerat in vitro och många olika strukturer inklusive raka protofilament, böjda protofilament, skivor av filament, knippen av trådar och rör av filament har desfaktorer beskrivs beroende på monteringsbuffert, nukleotid, och ytterligare proteiner som ingår i analysen ^3. Arkitekturen i FtsZ protofilament in vivo är ännu inte helt klarlagda, fastän elektron cryotomography experiment i Caulobacter crescentus antyder att Z-ringen är sammansatt av relativt korta, icke-kontinuerliga enkelprotofilament utan omfattande bunt ^4.

In vitro polymerisations-egenskaperna hos FtsZ och interaktionen av FtsZ med regulatoriska proteiner är känsliga för sammansättningen av reaktionsbufferten. Exempelvis beskrev vi nyligen interaktionen ställe för SepF på FtsZ C-terminalen och visade att en FtsZ _B Δ16 C-terminal trunkering inte längre binder till SepF ^5. I en tidigare studie på SepF-FtsZ _B interaktion, trunkera en liknande FtsZ _B Δ16 fortfarande samsedimenterad med SepF, som föreslog att SepF binder till en sekundär plats på FtsZ et al. noteras att SepF är inte funktionell och utfälles vid pH 6,5 ^7, vilket visar att den observerade cosedimentation vid pH 6,5 är sannolikt orsakas genom utfällning av SepF snarare än interaktion med FtsZ _B Δ16 C-terminalt trunkerad. Inverkan av pH och KCl-koncentration på polymerisationen av FtsZ tidigare har undersökts. Polymerer av E. coli FtsZ (FtsZ _Ec) vid pH 6,5 är längre och rikligare än de som bildas vid neutralt pH ^8,9. Tadros et al. har studerat polymerisationen av FtsZ _Ec i närvaro av monovalenta katjoner och noterar att K ^+-bindning är kopplad till FtsZ _Ec polymerisation och är avgörande för FtsZ aktivitet ^10. PH-värdet är mer critical när interaktionen av FtsZ med andra proteiner studeras, vilket framgår av det tidigare exemplet av SepF, och pH-beroendet av den hämmande effekten av MINC på FtsZ ^11. Eftersom både pH och saltkoncentration kan påverka interaktionen av FtsZ med andra proteiner, är det viktigt att välja rätt villkor och kontroller för FtsZ polymerisation studierna.

Här beskriver vi protokoll för att studera FtsZ polymerisation och GTPase aktivitet genom ljusspridning, elektronmikroskopi, sedimentering, och GTPase analyser. Rätvinklig ljusspridning är en standardmetod för att studera FtsZ polymerisation i realtid ^12. Vi införde några förbättringar av sedimentering och GTPase analys. Vi presenterar i detalj hur man förbereder prover för ljusspridning och elektronmikroskopi. Flera buffertar har använts i litteraturen för att studera FtsZ polymerisation testades och vi beskriver de bästa förutsättningarna för varje experiment. Vi visar också vilken kontrollerna börinfördes för att få bästa data.

Dessa metoder tillåter en snabb undersökning av FtsZ polymerisation, aktivitet och interaktion med andra proteiner med hjälp av enkla metoder och utrustning som finns i de flesta laboratorier. Mer sofistikerade metoder för att studera FtsZ polymerisation finns men ofta behöver tillgång till mer specialiserad utrustning, och / eller modifiering av FtsZ med fluorescerande etiketter ^8,13,14. De enkla metoder som beskrivs i detta dokument illustreras med hjälp FtsZ från B. subtilis och E. coli, den vanligaste Gram + och Gram-modellorganismer. De protokoll som kan anpassas till varje annan FtsZ protein. Baserat på preliminära analyser med dessa nya FtsZs, små förändringar avseende tid, buffert eller inkubationstemperaturen kan vara nödvändig för ett optimalt resultat. De experiment som beskrivs här bör hjälpa till att hitta dessa optimala förhållanden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GTP	Roche	10106399001	Part 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7
Thickwall Polycarbonate Tubes	Beckman Coulter	343776	Part 2
Optima MAX-XP Ultracentrifuge	Beckman Coulter	393315	Part 2, 3
Polyallomer Tube with Snap-on Cap	Beckman Coulter	357448	Part 3
AIDA Bio-package, 1D, 2D, FL	Raytest Isotopenmessgeräte GmbH	15000001	Part 4
Luminescence Image Analyzer LAS-4000	Fujifilm		Part 4
Thermo Spectronic AMINCO-Bowman Luminescence Spectrometer	Spectronic Instruments		Part 5
Fluorescence Cell	Hellma Analytics	105-250-15-40	Part 5
Square 400 Mesh, Copper, 100/vial	Electron Microscopy Sciences	G400-Cu	Part 6
CM120 Electron Microscope Operating at 120 kV	Philips		Part 6
96 ml x 0.2 ml Plate	BIOplastics	B70501	Part 7
Malachite Green Phosphate Assay Kit	BioAssay System	POMG-25H	Part 7
PowerWave HT Microplate Spectrophotometer	BioTek		Part 7