Abstract
خلال انقسام الخلية البكتيرية، والبروتين ضروري FtsZ تجمع في وسط الخلية لتشكيل ما يسمى Z-الحلبة. FtsZ يبلمر في خيوط طويلة في وجود GTP في المختبر، ويتم تنظيم البلمرة من قبل العديد من البروتينات التبعي. وقد درس على نطاق واسع FtsZ البلمرة في المختبر باستخدام الأساليب الأساسية بما في ذلك تشتت الضوء، الترسيب، GTP المقايسات التحلل والمجهر الإلكتروني. شروط العازلة تأثير كل من خصائص بلمرة FtsZ، وقدرة FtsZ للتفاعل مع البروتينات التنظيمية. هنا، نحن تصف بروتوكولات للدراسات البلمرة FtsZ والتحقق من صحة شروط وضوابط استخدام كولاي العصوية الرقيقة وFtsZ كما البروتينات الطراز. هو عرض والترسيب فحص سرعة منخفضة تسمح دراسة تفاعل مع البروتينات التي FtsZ حزمة أو tubulate البوليمرات FtsZ. يوصف لتحسين بروتوكول مقايسة GTPase أن يسمح الاختبارمن GTP التحلل بمرور الوقت باستخدام مختلف الظروف في الإعداد لوحة 96 جيدا، مع أوقات الحضانة موحدة بأن تلغي التباين في التنمية اللون في رد فعل الكشف عن الفوسفات. يوصف إعداد العينات للدراسات تشتت الضوء والمجهر الإلكتروني. وتستخدم العديد من المخازن المؤقتة إلى إقامة مناسبة ودرجة الحموضة عازلة وتركيز الملح للدراسات البلمرة FtsZ. تركيزات عالية من بوكل هو أفضل بالنسبة لمعظم التجارب. توفير وسائل لدينا نقطة انطلاق لفي المختبر توصيف FtsZ، ليس فقط من E. القولونية وباء. الرقيقة ولكن من أي بكتيريا أخرى. على هذا النحو، وأساليب يمكن استخدامها لدراسات تفاعل FtsZ مع البروتينات التنظيمية أو اختبار الأدوية المضادة للبكتيريا التي قد تؤثر على بلمرة FtsZ.
Introduction
البكتيرية البروتين FtsZ الأساسية هو أفضل بروتين تتميز آلية انقسام الخلايا البكتيرية. FtsZ هو homolog بدائية النواة من تويولين ويبلمر في المختبر بطريقة تعتمد GTP. FtsZ هو هدف جذاب للغاية لمضادات حيوية جديدة، نظرا لطبيعة الحفظ وتفرد للبكتيريا 1،2. في بداية انقسام الخلية، FtsZ يشكل حلقة cytokinetic في midcell، والتي هي بمثابة سقالة لتجميع البروتينات انقسام الخلايا الأخرى. تشكيل Z الدائري هو أمر حاسم لتوطين الصحيح للطائرة الانقسام. وينظم ديناميكية تجميع FtsZ من قبل العديد من البروتينات الإكسسوارات، مثل (اعتمادا على الأنواع البكتيرية) مينك، SepF، ZAPA، UgtP، وعزرا 2. وقد FtsZ البلمرة درس مكثف في المختبر، والعديد من الهياكل المختلفة بما في ذلك protofilaments على التوالي، protofilaments منحنية، ورقة من خيوط، خيوط وحزم من أنابيب من خيوط كان قصرcribed اعتمادا على المخزن المؤقت التجمع، النوكليوتيدات، والبروتينات إضافية تدرج في مقايسة 3. لا يزال الغموض بنية protofilaments FtsZ في الجسم الحي بالكامل، على الرغم من أن التجارب cryotomography الإلكترون في العنيقاء crescentus تشير إلى أن Z-حلقة يتم تجميعها من، protofilaments احد noncontinuous قصيرة نسبيا دون واسعة تجميع 4.
في المختبر، والخصائص بلمرة FtsZ وتفاعل FtsZ مع البروتينات التنظيمية حساسة لتكوين رد فعل العازلة. على سبيل المثال، وصفنا مؤخرا موقع التفاعل لSepF على FtsZ C-محطة وأظهرت أن FtsZ الإفطار اقتطاع Δ16 C-محطة لم يعد يربط SepF 5. في دراسة سابقة على التفاعل SepF-FtsZ الإفطار، وهو مماثل FtsZ الإفطار Δ16 اقتطاع يزال cosedimented مع SepF، الذي اقترح أن SepF بربط موقع ثانوي على FtsZ
نحن هنا تصف بروتوكولات لدراسة البلمرة FtsZ والنشاط GTPase كتبها تشتت الضوء، المجهر الإلكتروني، والترسيب، والمقايسات GTPase. الحق ضوء زاوية التشتت هو الأسلوب القياسي لدراسة FtsZ البلمرة في الوقت الحقيقي 12. قدمنا بعض التحسينات إلى الترسيب وGTPase الفحص. نقدم بالتفصيل كيفية تحضير العينات لتشتت الضوء والمجهر الإلكتروني. تم اختبار العديد من مخازن تستخدم في الأدب لدراسة FtsZ البلمرة وصفنا أفضل الظروف لكل تجربة. وتبين لنا أيضا التي تسيطر ينبغي أن يكونقدم للحصول على أفضل البيانات.
هذه الأساليب تسمح دراسة سريعة من FtsZ البلمرة، والنشاط والتفاعل مع بروتينات أخرى باستخدام أساليب ومعدات والذي يتوفر في معظم المختبرات بسيطة. أساليب أكثر تطورا لدراسة FtsZ البلمرة موجودة ولكن غالبا ما تتطلب الحصول على معدات أكثر تخصصا، و / أو تعديل FtsZ مع تسميات الفلورسنت 8،13،14. ويوضح أساليب بسيطة وصفها في هذه الورقة باستخدام FtsZ من B. الرقيقة وE. القولونية، وأكثرها شيوعا غرام + والكائنات الحية الغرام الطراز. البروتوكولات يمكن أن تتكيف مع أي بروتين FtsZ الأخرى. استنادا إلى فحوصات أولية مع هذه FtsZs الرواية، تغييرات طفيفة بشأن الوقت، العازلة أو درجة حرارة الحضانة قد تكون ضرورية لتحقيق نتيجة أفضل. يجب التجارب وصفها هنا تساعد في إيجاد هذه الظروف المثلى.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GTP | Roche | 10106399001 | Part 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 |
| Thickwall Polycarbonate Tubes | Beckman Coulter | 343776 | Part 2 |
| Optima MAX-XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | Part 2, 3 |
| Polyallomer Tube with Snap-on Cap | Beckman Coulter | 357448 | Part 3 |
| AIDA Bio-package, 1D, 2D, FL | Raytest Isotopenmessgeräte GmbH | 15000001 | Part 4 |
| Luminescence Image Analyzer LAS-4000 | Fujifilm | Part 4 | |
| Thermo Spectronic AMINCO-Bowman Luminescence Spectrometer | Spectronic Instruments | Part 5 | |
| Fluorescence Cell | Hellma Analytics | 105-250-15-40 | Part 5 |
| Square 400 Mesh, Copper, 100/vial | Electron Microscopy Sciences | G400-Cu | Part 6 |
| CM120 Electron Microscope Operating at 120 kV | Philips | Part 6 | |
| 96 ml x 0.2 ml Plate | BIOplastics | B70501 | Part 7 |
| Malachite Green Phosphate Assay Kit | BioAssay System | POMG-25H | Part 7 |
| PowerWave HT Microplate Spectrophotometer | BioTek | Part 7 |
References
- Haydon, D. J., Stokes, N. R., et al. An inhibitor of FtsZ with potent and selective anti-staphylococcal activity. Science. 321 (5896), 1673-1675 (2008).
- Adams, D. W., Errington, J. Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring. Nat. Rev. Microbiol. 7 (9), 642-653 (2009).
- Erickson, H. P., Anderson, D. E., Osawa, M. FtsZ in bacterial cytokinesis: cytoskeleton and force generator all in one. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (4), 504-528 (2010).
- Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division. EMBO J. 26 (22), 4694-4708 (2007).
- Król, E., van Kessel, S. P., van Bezouwen, L. S., Kumar, N., Boekema, E. J., Scheffers, D. J. Bacillus subtilis SepF binds to the C-terminus of FtsZ. PLoS One. 7 (8), e43293 (2012).
- Singh, J. K., Makde, R. D., Kumar, V., Panda, D. SepF increases the assembly and bundling of FtsZ polymers and stabilizes FtsZ protofilaments by binding along its length. J. Biol. Chem. 283 (45), 31116-31124 (2008).
- Gündoğdu, M. E., Kawai, Y., et al. Large ring polymers align FtsZ polymers for normal septum formation. EMBO J. 30 (3), 617-626 (2011).
- Pacheco-Gomez, R., Roper, D. I., Dafforn, T. R., Rodger, A. The pH dependence of polymerization and bundling by the essential bacterial cytoskeletal protein FtsZ. PLoS One. 6 (6), e19369 (2011).
- Mendieta, J., Rico, A. I., Lopez-Vinas, E., Vicente, M., Mingorance, J., Gomez-Puertas, P. Structural and functional model for ionic (K(+)/Na(+)) and pH dependence of GTPase activity and polymerization of FtsZ, the prokaryotic ortholog of tubulin. J. Mol. Biol. 390 (1), 17-25 (2009).
- Tadros, M., Gonzalez, J. M., Rivas, G., Vicente, M., Mingorance, J. Activation of the Escherichia coli cell division protein FtsZ by a low-affinity interaction with monovalent cations. FEBS Lett. 580 (20), 4941-4946 (2006).
- Scheffers, D. J. The effect of MinC on FtsZ polymerization is pH dependent and can be counteracted by ZapA. FEBS Lett. 582 (17), 2601-2608 (2008).
- Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. Analysis of FtsZ assembly by light scattering and determination of the role of divalent metal cations. J. Bacteriol. 181 (3), 823-832 (1999).
- Chen, Y., Erickson, H. P. Rapid in vitro assembly dynamics and subunit turnover of FtsZ demonstrated by fluorescence resonance energy transfer. J. Biol. Chem. 280 (23), 22549-22554 (2005).
- Hou, S., Wieczorek, S. A., et al. Characterization of Caulobacter crescentus FtsZ protein using dynamic light scattering. J. Biol. Chem. 287 (28), 23878-23886 (2012).
- Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. Dynamic assembly of FtsZ regulated by GTP hydrolysis. EMBO J. 17 (2), 462-469 (1998).
- Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate. Anal. Biochem. 100 (1), 95-97 (1979).
- Ray, S., Kumar, A., Panda, D. GTP regulates the interaction between MciZ and FtsZ: a possible role of MciZ in bacterial cell division. Biochemistry. 52 (2), 392-401 (2013).
- Rivas, G., Lopez, A., et al. Magnesium-induced linear self-association of the FtsZ bacterial cell division protein monomer. The primary steps for FtsZ assembly. J. Biol. Chem. 275 (16), 11740-11749 (2000).
- Oliva, M. A., Cordell, S. C., Lowe, J. Structural insights into FtsZ protofilament formation. Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (12), 1243-1250 (2004).
- Lowe, J., Amos, L. A. Crystal structure of the bacterial cell-division protein FtsZ. Nature. 391 (6663), 203-206 (1998).
- Cordell, S. C., Robinson, E. J., Lowe, J. Crystal structure of the SOS cell division inhibitor SulA and in complex with FtsZ. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (13), 7889-7894 (2003).
- Chen, Y., Anderson, D. E., Rajagopalan, M., Erickson, H. P. Assembly dynamics of Mycobacterium tuberculosis FtsZ. J. Biol. Chem. 282 (38), 27736-27743 (2007).
- White, E. L., Ross, L. J., Reynolds, R. C., Seitz, L. E., Moore, G. D., Borhani, D. W. Slow polymerization of Mycobacterium tuberculosis FtsZ. J. Bacteriol. 182 (14), 4028-4034 (2000).
- Oliva, M. A., Trambaiolo, D., Lowe, J. Structural insights into the conformational variability of FtsZ. J. Mol. Biol. 373 (5), 1229-1242 (2007).
- Thanbichler, M., Shapiro, L. M. ipZ. a spatial regulator coordinating chromosome segregation with cell division in Caulobacter. Cell. 126 (1), 147-162 (2006).
- Buske, P. J., Levin, P. A. Extreme C terminus of bacterial cytoskeletal protein FtsZ plays fundamental role in assembly independent of modulatory proteins. J. Biol. Chem. 287 (14), 10945-10957 (2012).
- Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. Analysis of FtsZ assembly by light scattering and determination of the role of divalent metal cations. J. Bacteriol. 181 (3), 823-832 (1999).
