FtsZ Polymerisering Analyser: Enkle protokoller og betraktninger

Abstract

I løpet av bakteriell celledeling, samler det vesentlige protein FtsZ i midten av cellen for å danne den såkalte Z-ring. FtsZ polymeriserer i lange filamenter i nærvær av GTP in vitro, og polymeriseringen reguleres av flere aksessoriske proteiner. FtsZ polymerisasjon har blitt grundig studert in vitro ved hjelp av grunnleggende metoder inkludert lysspredning, sedimentering, GTP hydrolyse analyser og elektronmikroskopi. Buffer forholdene påvirker både polymerisasjonsproduktene egenskaper FtsZ, og evnen til FtsZ å samhandle med regulatoriske proteiner. Her beskriver vi protokoller for FtsZ polymeriseringsbetingelser studier og validere forhold og kontroller ved hjelp av Escherichia coli og Bacillus subtilis FtsZ som modell proteiner. En lav hastighet sedimente analysen er innført som gjør studiet av samspillet FtsZ med proteiner som bunter eller tubulate FtsZ polymerer. En forbedret GTPase analyseprotokollen er beskrevet som tillater testingGTP hydrolyse over tid ved bruk av ulike forhold i en 96-brønn plate-oppsett, med standardiserte inkubasjonstider som avskaffe variasjon i fargeutvikling i fosfat deteksjon reaksjonen. Fremstilling av prøver for lysspredning studier og elektronmikroskopi, er beskrevet. Flere buffere blir benyttet for å etablere passende buffer pH og saltkonsentrasjon for FtsZ polymeri-studier. En høy konsentrasjon av KCl er de beste for de fleste eksperimenter. Våre metoder gir et utgangspunkt for den in vitro karakterisering av FtsZ, ikke bare fra E. coli-og B. subtilis, men fra en annen bakterie. Dermed kan fremgangsmåtene anvendes for studier av interaksjonen mellom FtsZ med regulatoriske proteiner eller testing av antibakterielle midler som kan påvirke FtsZ polymerisasjon.

Introduction

Den essensielle bakterielle protein FtsZ er best karakterisert proteinet av den bakterielle celledelingen maskineri. FtsZ er den prokaryote homolog av tubulin og polymeriserer in vitro i en GTP avhengig måte. FtsZ er et svært attraktivt mål for nye antibiotika på grunn av sin bevart natur og egenart til bakterier ^1,2. Ved begynnelsen av celledeling, danner FtsZ en cytokinetic ring ved midcell, som tjener som et stillas for montering av andre celledeling proteiner. Dannelse av den Z-ringen er viktig for korrekt lokalisering av divisjonen planet. Monterings dynamikken i FtsZ er regulert av flere tilbehørs proteiner, slik som (avhengig av bakteriearter) Minc, SepF, Zapa, UgtP, og Ezra ^to. FtsZ polymerisasjon har blitt nøye studert in vitro og mange forskjellige strukturer, inkludert rette protofilaments, buede protofilaments, ark med filamenter, bunter av filamenter og rør av filamenter har vært desbert avhengig av sammenstillingen buffer, nukleotid, og ytterligere proteiner som er inkludert i analysen, ^3.. Arkitekturen i FtsZ protofilaments in vivo er ennå ikke fullt ut forstått, selv om elektron cryotomography eksperimenter i Caulobacter crescentus tyder på at Z-ring er satt sammen av relativt korte, ikke-kontinuerlig enkelt protofilaments uten omfattende bunting ^fire.

In vitro, de polymeri-egenskaper FtsZ og interaksjonen mellom FtsZ med regulatoriske proteiner er følsomme for sammensetningen av reaksjonsbufferen. For eksempel, vi nylig beskrevet samspillet stedet for SepF på FtsZ C-terminalen og viste at en FtsZ _B Δ16 C-terminal avkorte ikke lenger binder seg til SepF ^fem. I en tidligere studie på SepF-FtsZ _Bs interaksjon, avkorte en lignende FtsZ _B Δ16 fortsatt cosedimented med SepF, som antydet at SepF binder seg til et sekundært område på FtsZ et al. bemerkes at SepF ikke er funksjonell og utfelles ved pH 6,5 ^7, som viser at den observerte cosedimentation ved pH 6,5 er sannsynligvis å være forårsaket av utfelling av SepF fremfor interaksjon med FtsZ _B Δ16 C-terminale truncate. Innflytelsen av pH-og KCl-konsentrasjon på polymerisasjonen av FtsZ tidligere har vært undersøkt. Polymerer av E. coli FtsZ (FtsZ _EF) ved pH 6,5 er lengre og rikere enn de som dannes ved nøytral pH ^8,9. Tadros et al. har studert polymerisasjon av FtsZ _Ec i nærvær av monovalente kationer merke seg at K ⁺ binding er knyttet til FtsZ _Ec polymerisasjon og er avgjørende for FtsZ aktivitet ^10. PH-verdien er mer critical ved interaksjonen av FtsZ med andre proteiner er studert, som vist ved den foregående eksempel på SepF, og pH-avhengighet av den hemmende effekten av MiNC on FtsZ ^11.. Som både pH og saltkonsentrasjon kan påvirke samspillet av FtsZ med andre proteiner, er det viktig å velge de rette forholdene og kontroller for de FtsZ polymerisasjonsforsøk studier.

Her beskriver vi protokoller for å studere FtsZ polymerisasjon og GTPase aktivitet ved lysspredning, elektronmikroskopi, sedimentering, og GTPase analyser. Rettvinklet lysspredning er en standardmetode for å studere FtsZ polymerisasjon i sanntid ^12.. Vi har innført en del forbedringer i sedimentering og GTPase assay. Vi presenterer i detalj hvordan å forberede prøvene for lysspredning, og elektronmikroskopi. Mange buffere som brukes i litteraturen for å studere FtsZ polymerisasjonen ble testet, og vi beskriver de beste betingelser for hvert forsøk. Vi viser også som styrer bør væreintrodusert for å oppnå de beste dataene.

Disse fremgangsmåter tillater en rask undersøkelse av FtsZ polymerisasjon, aktivitet og interaksjon med andre proteiner ved hjelp av enkle metoder og utstyr som er tilgjengelig i de fleste laboratorier. Mer sofistikerte metoder for å studere FtsZ polymerisasjon eksisterer, men krever ofte tilgang til mer spesialisert utstyr, og / eller modifisering av FtsZ med fluorescerende etiketter ^8,13,14. De enkle metodene som beskrives i denne artikkelen er illustrert ved hjelp FtsZ fra B. subtilis og E. coli, den mest vanlige Gram + og Gram-modellorganismer. Protokollene kan tilpasses til en hvilken som helst annen FtsZ protein. Basert på foreløpige analyser med disse romanen FtsZs, små endringer vedrørende tid, buffer eller Inkubasjonstemperaturen kan være nødvendig for et optimalt resultat. Forsøkene som er beskrevet her bør hjelpe til å finne disse optimale betingelser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GTP	Roche	10106399001	Part 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7
Thickwall Polycarbonate Tubes	Beckman Coulter	343776	Part 2
Optima MAX-XP Ultracentrifuge	Beckman Coulter	393315	Part 2, 3
Polyallomer Tube with Snap-on Cap	Beckman Coulter	357448	Part 3
AIDA Bio-package, 1D, 2D, FL	Raytest Isotopenmessgeräte GmbH	15000001	Part 4
Luminescence Image Analyzer LAS-4000	Fujifilm		Part 4
Thermo Spectronic AMINCO-Bowman Luminescence Spectrometer	Spectronic Instruments		Part 5
Fluorescence Cell	Hellma Analytics	105-250-15-40	Part 5
Square 400 Mesh, Copper, 100/vial	Electron Microscopy Sciences	G400-Cu	Part 6
CM120 Electron Microscope Operating at 120 kV	Philips		Part 6
96 ml x 0.2 ml Plate	BIOplastics	B70501	Part 7
Malachite Green Phosphate Assay Kit	BioAssay System	POMG-25H	Part 7
PowerWave HT Microplate Spectrophotometer	BioTek		Part 7