Abstract
細菌の細胞分裂の間、必須タンパク質のFtsZは、いわゆるZ-環を形成して、セルの中央に組み立てる。 FtsZは、 インビトロで GTPの存在下で長いフィラメントに重合し、重合は、いくつかのアクセサリータンパク質により調節される。 FtsZの重合は、広範囲に光散乱、沈降、GTP加水分解アッセイおよび電子顕微鏡法などの基本的な方法を用いてインビトロで研究されてきた。バッファー条件の影響は、両方のFtsZの重合特性、および調節タンパク質と相互作用するためのFtsZの能力。ここでは、FtsZの重合研究のためのプロトコルを記述し、モデルタンパク質として大腸菌、枯草菌のFtsZを使用して条件とコントロールを検証します。低速沈降アッセイは、バンドルまたはFtsZの重合体をチューブ状のタンパク質とのFtsZの相互作用の研究を可能に導入される。改良されたGTPアーゼアッセイプロトコルは、テストを可能に記載されているリン酸検出反応での発色の変化を廃止し、標準化インキュベーション時間を有する96ウェルプレートセットアップにおいて、種々の条件を用いて経時的にGTP加水分解。光散乱試験および電子顕微鏡観察用試料の調製が記載されている。複数のバッファは、FtsZの重合の研究に適した緩衝液pHおよび塩濃度を確立するために使用される。塩化カリウム高濃度の実験のほとんどのための最善の方法です。我々の方法は、E.からだけでなく、のFtsZ のインビトロ特徴付けのための出発点を提供大腸菌とB枯草菌が、他の細菌から。このように、本方法は、調節タンパク質またはFtsZの重合に影響を与える可能性抗菌薬のテストとのFtsZの相互作用の研究のために使用することができる。
Introduction
必須の細菌タンパク質FtsZは、細菌の細胞分裂機構の最もよく特徴付けられたタンパク質である。 FtsZは、チューブリンの原核生物相同体であるとGTP依存的にin vitroで重合する。 FtsZは、細菌の1,2への保存された自然や独自性のために新しい抗生物質のために非常に魅力的な標的である。細胞分裂の開始時に、FtsZは、他の細胞分裂タンパク質の組み立てのための足場として働くmidcellにおける細胞質分裂の環を形成する。 Z-環の形成は、分割面の正しい位置特定のために重要である。のFtsZの組立ダイナミクスは、MINC、SepF、ZapA、UgtP、エズラ2（細菌種に応じて）など、いくつかのアクセサリータンパク質によって調節されています。 FtsZの重合は、インビトロで集中的に研究されており、直プロトフィラメント、湾曲したプロトフィラメント、フィラメントのシート、フィラメントのフィラメント、チューブの束を含む多くの異なる構造がデスされている組立バッファ、ヌクレオチド、およびアッセイ3に含まれている追加のタンパク質に依存しcribed。 カウロバクターのクレセンタスにおける電子cryotomography実験は、Zリングが豊富な4をバンドルすることなく、比較的短い、非連続シングルプロトフィラメントから組み立てられていることを示唆しているが、生体内でのFtsZのプロトフィラメントのアーキテクチャは、まだ完全には理解されていません。
in vitroでは 、FtsZの重合特性及び調節タンパク質とのFtsZの相互作用は、反応バッファーの組成に敏感である。例えば、我々は最近、FtsZのC末端にSepFための相互作用部位を説明し、FtsZは宿泊 Δ16C末端TRUNCATEはもはやSepF 5に結合することが示されなかった。 SepF-FtsZは宿泊の相互作用に関するこれまでの研究では、同様のFtsZ 宿泊 Δ16はまだSepFがFtsZの上のセカンダリサイトに結合することが示唆されSepFとcosedimentedとtruncate
ここでは、光散乱、電子顕微鏡、沈降、およびGTPアーゼアッセイによりFtsZの重合およびGTPase活性を研究するためのプロトコルを記述します。直角光散乱は、即座に12 FtsZの重合を研究するための標準的な方法である。私たちは、沈降およびGTPアーゼアッセイ、数の改善を導入しました。我々は、光散乱および電子顕微鏡用の試料を調製する方法を詳細に述べる。 FtsZの重合を研究する文献で使用されるいくつかのバッファがテストされ、我々は、各実験のための最高の条件を説明した。我々はまたあるべきかを制御示して最適なデータを得るために導入した。
これらのメソッドは、ほとんどの実験室で提供され、簡単な方法および装置を使用して他のタンパク質とのFtsZの重合活性および相互作用の迅速な研究を可能にする。 FtsZの重合を研究するより洗練された方法が存在するが、多くの場合、蛍光標識8,13,14とのより専門的な機器へのアクセス、および/ またはFtsZのの修正が必要。このホワイトペーパーで説明の簡単な方法は、BからのFtsZを使用して説明している枯草菌および大腸菌大腸菌 、最も一般的なグラム陽性およびグラムモデル生物。プロトコルは、他のFtsZタンパク質に適合させることができる。これらの新規FtsZsによる予備アッセイに基づいて、インキュベーション時間、緩衝液または温度に関するわずかな変化は、最適な結果のために必要であり得る。ここに記載された実験は、これらの最適な条件を見つけるのに役立つはずです。
Protocol
タグなしのFtsZタンパク質は、先に説明したように11,15 20mMトリス/塩酸（pH 7.9）、50mMのKCl、1mMのEGTA、2.5mMのMgAc及び10％グリセロールに対して透析し、精製し、そして-80℃で保存した。これらの条件下でタンパク質活性の有意な損失なしに2年以上保存することができる。タンパク質は解凍し、サンプルの凍結を回避するために、100μlアリコートに格納する必要があります。解凍後、サンプルは最大一週間4℃で保持することができる。 FtsZは、高濃度で可溶性であり、7〜10 mg / mlので保存することができる。これは、後の実験における貯蔵緩衝成分の望ましくない影響を回避するために、高タンパク質濃度を維持することが重要である。そこで、ストレージ濃度は少なくとも10倍、1％以下のグリセロール濃度をもたらすために、反応混合物中の透析緩衝液の他の成分の濃度を最小にするためののFtsZの希釈を可能にするはずである。 FtsZの重合はまた、高ナトリウム9の存在によって影響され得る7記載の-80℃での溶出バッファに格納されているようにSepFを精製したEからのFtsZの精製の ための代替公表された手順大腸菌とB枯草菌ならびに異なる供給源からのFtsZの精製の ための手順への参照は、（代表的な結果のセクションを参照） を表1にまとめる。
1。試料調製
- 重合バッファを準備します。
1 50mMのHepes / NaOHでpHを7.5 2 25 mMのパイプ/ NaOHでpHを6.8 3 50 mMのMES / NaOHでpHを6.5 4 50mMのHepes / NaOHを、pHが7.5、50mMのKCl 5 25 mMのパイプ/ NaOHでpHを6.8、50のKCl 6 50 mMの男ES / NaOHでpHを6.5、50のKCl 7 50mMのHepes / NaOHを、pHが7.5、300 mMのKClを 8 25 mMのパイプ/ NaOHでpHを6.8; 300のKCl 9 50 mMのMES / NaOHでpHを6.5; 300のKCl - フィルター22ミクロンのメンブランフィルターを用いてすべてのバッファを殺菌。
- （1）からの各重合液中100mMのGTP、GDPとのMgCl 2ストック溶液を準備します。
- 全ての実験のために4℃で20分間、100,000×gでスピンによるタンパク質プリ·クリアー。
2。 FtsZは沈降アッセイ
- 高速遠心分離と互換性のあるチューブで（試料調製ポイント1を参照）の重合バッファの1にMgCl 2およびFtsZはを加えることにより反応ミックスを調製する。総体積は50μlの最終容量で、12μMで10 mmとMgCl 2およびFtsZのと、49μLにする必要があります。
- P、関数を振盪インキュベーター中でチューブレース300rpmで30℃で2分間インキュベートする（あるいは試料を穏やかに弾き飛ばされてもよいし、短時間、30℃で予熱に続いて微量遠心）。
- GTPまたは実験（最終濃度2mM）で用いたのと同じ緩衝液中のGDPのストック溶液1μlを添加することにより重合を開始。 300回転（または関数を振とう培養器内）で30℃、（それぞれ、50のKClおよび300mMのKClをバッファーなど）10、または2分間インキュベートします。
- 超遠心ローターにチューブを移し、25℃で35万XG（TLA 120.1ローター用89700 rpm）で10分間スピンダウン
- 紡糸後、慎重にロータからチューブを取り外し、すぐにきれいなチューブに上清を移す。 2Xサンプルバッファー20μlに20μlの上清を添加することにより、SDS-PAGE用サンプルを準備します。 98℃で10分間沸騰させる
- フォートを含むペレット画分に2×試料緩衝液50μlを追加SZポリマー。 2ミリリットルチューブに超遠心管を配置します。 98℃で10分間煮沸してペレットを再懸濁し、サンプル上清サンプルと同じ2倍希釈するために、脱イオンH 2 Oを50μlを加える。
- 2ミリリットルチューブに逆さまに超遠心管を回して、18,000 X gでエッペンドルフ遠心機で5分間スピンダウン。 2ミリリットル管から超遠心管を取り外します。
- 負荷10％SDS-PAGEゲル上で並べて各上清およびペレット試料側を10μl。 150 Vでゲルを実行
- クマシーブリリアントブルーG-250でゲルを染色し、定量化のために保管してください。
3。スロースピンでのFtsZ沈降アッセイ
- ステップ2のように重合溶液を準備し、SepFおよび/またはFtsZは（最終濃度12μM）を追加します。これらの実験は、TLA-55ローターと組み合わせてベックマン使い捨て1.5mlチューブ中で行うことができる。
- FUを振とうしながら培養器にチューブをnctionおよび300rpmで30℃で2分間インキュベートする。
- ストック溶液（最終濃度2 mM）のからのGTPまたはGDPの追加1μLにより重合を開始し、300 rpmで30℃で20分間インキュベートする。
- 25℃で24,600×gで（TLA 55ローター、20,000 rpm）で15分間スピンダウン
- 上清を除去し、清潔なチューブに移す、20μLを取り、2×試料緩衝液20μlに移す。 98℃で10分間沸騰させる
- 脱イオンH 2 O50μlのを追加し、98℃で10分間煮沸することによりポリマーおよび再懸濁を含む画分をペレット化し、2Xサンプルバッファー50μLを追加
- 負荷10％SDS-PAGEゲル上で並べて各上清およびペレット試料側を10μl。 150 Vでゲルを実行
- クマシーブリリアントブルーG-250でゲルを染色し、定量化のために保管してください。
4。 FtsZは沈降アッセイの定量化
- クマシーSTAの写真を撮るゲルドキュメンテーションシステム（ 例えば 、LAS-4000、富士フイルム）を使用して、INEDゲル。
- ゲルのデンシトメトリー分析するのに適したプログラム（ 例えば AIDA画像解析プログラム（Raytest））でゲル画像を開いて、以下のプログラムで分析を説明します。
- ツールバーの「評価」ボタンをクリックしてください。
- リストから「2Dデンシトメトリー」を選択し、[OK]をクリックします。
- メインメニューで、「評価」をクリックして、「領域判定」エントリを選択します。
- ゲル上の領域を作成するには、領域判定ツールボックスの自動輪郭ツールのシンボルをクリックしてください。
- 、ゲル上のタンパク質バンドの左上隅をクリックし、マウスボタンを押したまま、バンドの所望の右下端にドラッグし、マウスボタンを離します。
- マークと同じ方法で、各のFtsZ / SepFバンド。
- 割り当てられた領域の評価に関するすべての情報は、領域レポートに記載されています。レジオを入手するにはNレポートは、領域判定ツールボックスの「表示領域レポート」ボタンをクリックしてください。
- レポートをエクスポートするには、メインメニューの[ファイル]をクリックし、エントリ「2D領域レポートàエクスポート」を選択します。
- 地域レポートでは、すべての作成された領域の強度が見つかるはず。レポートからの強度値を用いて、ペレット中のタンパク質のパーセント（FtsZの、調節タンパク質）を算出する。
5。 90°光散乱
- 蛍光分光計（ 例えば AMINCO-ボーマンシリーズ2）の電源を入れ、ランプは30℃でのキュベット室温度を維持するために熱変動を回避し、循環水浴をオンにするのに数分間ウォームアップすることができます
- 分光器の動作パラメータを定義します。検出器の高電圧300 V、発光および励起波長：350 nmのスリット幅：4 nmの。多くの分光器が自動的にcertAに実験開始時に信号を調整することに注意してください最大の割合（ 例えば 60％）である。これは、すぐに、GTPがFtsZのを重合するために追加されているように範囲外に移動するための散乱信号を発生します。これは、最初の一連の実験を開始する前に、右信号増幅検出器の高電圧に対する最大の重合を確立することが賢明です。
- データ収集プロトコルをプログラムします。 3600秒の持続時間、時間ベースの取得を選択します。
- 5分間、室温の水浴に必要 - 超音波処理した場合、水とエタノールとの蛍光キュベットを丁寧に清掃してください。このプロトコルでは、1cmの経路長及び200μlの容積を有するキュベットが使用され、貯蔵溶液（0.5〜1％のHellmanex）に格納される。代替として、単回使用の適合性プラスチックUVキュベット（UVette、エッペンドルフ）を使用することができる。
- 最終的な300μLに対して計算濃度、およびVORTとして10 MgCl 2および12μMのFtsZはと（サンプル調製ポイント1を参照）の重合バッファのマスターミックスの294μLを準備EX。
- キュベットに重合バッファー196μLを移し、分光器に入れてください。 30℃で2分間インキュベートする。
- データ収集を開始し、信号が安定していることを確認するために90秒間待ちます。
- 100のGTPまたはGDP（最終濃度：2 mm）で4μl加え200μlの最終反応容量を達成するために、買収をミックスして再開するより大きな容量ピペットで上下にピペット。
6。透過型電子顕微鏡
- （ボリュームは、材料を節約するために、10μlの最終容量を削減することができる）のFtsZ沈降アッセイ用としてサンプルを準備します。
- インキュベーション時間の後、グロー放電さ400メッシュの炭素被覆銅グリッド上に試料を2μLを適用し、15秒間インキュベートする。
- 優しくグリッド並列または濾紙に垂直に触れたりドラッグして、グリッド乾燥ブロット。
- 2％の酢酸ウラニル溶液を4μLを使用してグリッドを染色。 BLOステップ6.3で説明したように、グリッドのドライT。
- 39200倍の倍率で120 kVので動作するフィリップスCM120電子顕微鏡グリッドを表示します。
7。 GTP加水分解アッセイ
実験の設定は、FtsZのGTPの加水分解はマラカイトグリーンとの反応物を混合することにより、種々の反応時間後に停止されるように設計されている。このようにして、マラカイトグリーンの発色の時間は、各試料について同じである。
- 重合バッファの1つに1.5ミリリットル2のGTPを準備します（サンプル調製、ポイント1を参照）。
重合液中の0-40μMリン酸標準希釈液を調製し、POMG-25H（バイオアッセイ）キットで説明したようにマラカイトグリーンの作業試薬を調製。あるいは、作業試薬はLanzetta らによって記載されたプロトコルに従って社内で調製することができる。16 - 総量360μlのマスターミックスを準備します。
私 24μMのFtsZ BS、20のMgCl 2、重合液 2 12μMのFtsZ EC、20のMgCl 2、重合液 III（コントロール1） 24μMのFtsZ BS、2mMのEDTA、重合液 IV（コントロール2） 12μMのFtsZ EC、2mMのEDTA、重合液 - ピペットマスターミックス、100μlのリン酸基準や定量PCR 96ウェルプレート中2のGTP180μlを20μlのアリコートを次の順序で。
A B C言語 D E F G H 1 3 3 私 私 4 4 2 2 2 3 3 私 私 4 4 2 2 3 3 3 私 私 4 4 2 2 4 3 3 私 私 4 4 2 2 5 3 3 私 私 4 4 2 2 6 3 3 私 私 4 4 2 2 7 3 3 私 私 4 4 2 2 </ TR>8 3 3 私 私 4 4 2 2 9 PS PS PS PS PS PS PS PS 10 PS PS PS PS PS PS PS PS 11 12 GTP GTP GTP GTP GTP GTP GTP GTP
PS - リン酸標準 - 30℃で40分間周期に設定されたプログラムでPCR機で定量PCRプレートを置き
- malac20μlのアリコートを準備96ウェルプレート中のハイト緑色作業試薬。 1'-8 'レーンの実験から、重合液の60μlを加える。サンプルは、リン酸標準と比較4Xに希釈され、最終的な計算中に、この事実を考慮してください。
A B C言語 D E F G H 1 ' 3 3 私 私 4 4 2 2 2 ' 3 3 私 私 4 4 2 2 3 ' 3 3 私 私 4 4 2 2 4 ' <TD> III3 私 私 4 4 2 2 5 ' 3 3 私 私 4 4 2 2 6 ' 3 3 私 私 4 4 2 2 7 ' 3 3 私 私 4 4 2 2 8 ' 3 3 私 私 4 4 2 2 9 ' PS PS PS PS PS PS PS PS 10 ' PS PS PS PS PS PS PS PS - （これは30分の反応の開始時点で）、1レーンへのGTPの20μl加えピペットを上下に混合する、タイマーを開始します。
- 10分後、30秒、2レーンへのGTPを追加ピペットを上下（20分反応）を混合する。
- 16分後に上下3、ピペット混合する（15分反応）レーンにGTPを追加します。
- 21分後、30秒（10分反応）をミックスするには、上下4、ピペットをレーンにGTPを追加します。
- 25分後（7分反応）混合する、ピペットを上下5レーンへのGTPを追加します。
- 27分後、30秒（5分反応）をミックスするには、上下6、ピペットをレーンにGTPを追加します。
- 29分後（4分の反応）を混合する、ピペットを上下7レーンへのGTPを追加..
- レーン1にレーン1から30分の転送を20μlの後で、上下のピペット混合する（3マラカイトグリーンの発色の出発点0分反応）。
- 30分後、30〜2レーン2から秒の転送20μL '、ピペットを上下（20分の反応のためにマラカイトグリーンの発色の開始点）を混合する。
- レーン3-7ごとに30秒間のステップを繰り返します。
- 33分後、30秒のために（マラカイトグリーンの発色のための0分の反応と開始時点を混合するピペットを上下、8レーンへのGTP20μlのピペットを上に追加して、ミックスダウンすると「8レーンに20μLを転送反応）。
- 34分後、「レーン9〜9を上下にピペット混合する（リン酸標準1用のマラカイトグリーンの発色の開始時点）を80μLを加える。
- 34分30秒の転送80μlの後には、上下車線から10から10 '、ピペット混合する（リン酸標準2用のマラカイトグリーンの発色の開始時点）。
- サンプルから全ての気泡を除去し、さらに25分間室温でプレートをインキュベート30秒。
- 96ウェルプレートリーダーでプレートを置き。
- 60分後（マラカイトグリーンの発色は、最初の反応のために今30分である）、波長630 nmでプレート10倍ごとに30秒を測定します。すべての測定は、ステップ7.6から7.12と7.16からのすべての時点に対応し、データ解析の際に別々に計算しなければなりません。
- リン酸標準較正曲線を用いて各サンプル中の遊離リン酸を計算する。
- 時間をかけてリン酸の放出などのデータをプロットし、曲線の直線範囲からのFtsZのGTP加水分解活性を計算します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GTP | Roche | 10106399001 | Part 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 |
| Thickwall Polycarbonate Tubes | Beckman Coulter | 343776 | Part 2 |
| Optima MAX-XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | Part 2, 3 |
| Polyallomer Tube with Snap-on Cap | Beckman Coulter | 357448 | Part 3 |
| AIDA Bio-package, 1D, 2D, FL | Raytest Isotopenmessgeräte GmbH | 15000001 | Part 4 |
| Luminescence Image Analyzer LAS-4000 | Fujifilm | Part 4 | |
| Thermo Spectronic AMINCO-Bowman Luminescence Spectrometer | Spectronic Instruments | Part 5 | |
| Fluorescence Cell | Hellma Analytics | 105-250-15-40 | Part 5 |
| Square 400 Mesh, Copper, 100/vial | Electron Microscopy Sciences | G400-Cu | Part 6 |
| CM120 Electron Microscope Operating at 120 kV | Philips | Part 6 | |
| 96 ml x 0.2 ml Plate | BIOplastics | B70501 | Part 7 |
| Malachite Green Phosphate Assay Kit | BioAssay System | POMG-25H | Part 7 |
| PowerWave HT Microplate Spectrophotometer | BioTek | Part 7 |
References
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