FtsZ Polimerização Ensaios: protocolos simples e Considerações

Abstract

Durante a divisão celular das bactérias, a proteína FtsZ essencial monta no meio da célula de modo a formar o chamado anel Z. FtsZ polimerize em filamentos longos na presença de GTP, in vitro, e a polimerização é regulado por várias proteínas acessórias. Polimerização FtsZ tem sido extensivamente estudada in vitro, utilizando métodos básicos, incluindo espalhamento de luz, sedimentação, GTP ensaios de hidrólise e microscopia eletrônica. A influência das condições de tampão ambas as propriedades de polimerização de FtsZ, e a capacidade de FtsZ para interagir com as proteínas reguladoras. Aqui, descrevemos os protocolos para os estudos de polimerização de FtsZ e validar as condições e controles utilizando Escherichia coli e Bacillus subtilis FtsZ como proteínas modelo. Um ensaio de sedimentação baixa velocidade é introduzido, que permite o estudo da interação de FtsZ com proteínas que empacotam ou tubulate polímeros de FtsZ. Um protocolo de ensaio melhorado GTPase é descrito que permite testarde hidrólise de GTP ao longo do tempo utilizando várias condições de uma instalação de placa de 96 poços, com tempos de incubação normalizadas que eliminam a variação no desenvolvimento da cor na reacção de detecção de fosfato. A preparação de amostras para estudos de espalhamento de luz e microscopia eletrônica é descrito. Vários tampões são utilizados para estabelecer pH adequado e concentração de sal para estudos de polimerização FtsZ. Uma alta concentração de KCI é a melhor para a maioria das experiências. Os nossos métodos de fornecer um ponto de partida para a caracterização em vitro de FtsZ, não só do E. coli e B. subtilis, mas a partir de qualquer outra bactéria. Como tal, os métodos podem ser utilizados para os estudos da interacção de FtsZ com proteínas reguladoras ou o teste de drogas antibacterianas, que podem afectar a polimerização FtsZ.

Introduction

O FtsZ essencial proteína bacteriana é a melhor proteína caracterizado da máquina divisão celular bacteriana. FtsZ é o homólogo procariótico de tubulina polimeriza e in vitro, de um modo dependente de GTP. FtsZ é um alvo muito atraente para novos antibióticos, devido à sua natureza conservada e exclusividade para bactérias ^1,2. No inicio da divisão celular, FtsZ forma um anel em cytokinetic midcell, que serve como suporte para a montagem de outras proteínas de divisão celular. A formação do anel Z é essencial para a correcta localização do plano de divisão. A dinâmica de montagem de FtsZ são regulados por diversas proteínas acessórias, tais como (dependendo das espécies bacterianas) MinC, SepF, ZapA, UgtP, e Esdras ^2. Polimerização FtsZ tem sido intensivamente estudada in vitro e muitas estruturas diferentes, incluindo protofilamentos rectas, curvas protofilamentos, folhas de filamentos, feixes de filamentos e de tubos de filamentos têm sido descrita, dependendo do tampão de montagem, de nucleótidos, e as proteínas adicionais incluídos no ensaio ^3. A arquitetura do protofilamentos FtsZ in vivo ainda não está totalmente compreendido, embora experimentos cryotomography elétron em Caulobacter crescentus sugerem que o anel Z é montado a partir, protofilamentos único descontínuos relativamente curtos sem extensa agregação ^4.

In vitro, as propriedades de polimerização de FtsZ e a interacção de FtsZ com proteínas reguladoras são sensíveis à composição do tampão de reacção. Por exemplo, recentemente descrito para o sítio de interacção SepF na FtsZ C-terminal e que mostrou um truncamento do terminal C Δ16 FtsZ _Bs já não se liga ao SepF ^5. Em um estudo anterior sobre a interação SepF-FtsZ _Bs, um semelhante FtsZ _Bs Δ16 ainda truncamento cosedimented com SepF, que sugeriu que SepF se liga a um site secundário em FtsZ et al. notado que SepF não é funcional e precipita a um pH de 6,5 ^7, que mostra que o cosedimentation observada a pH 6,5, é susceptível de ser causada pela precipitação de SepF vez de interacção com o truncamento do terminal C Δ16 FtsZ _Bs. A influência do pH e da concentração de KCl no polimerização de FtsZ foi anteriormente analisado. Polímeros de E. coli FtsZ (FtsZ _Ec) a pH 6,5 são mais longos e mais abundantes do que os que são formados a ^8,9 pH neutro. Tadros et al. estudaram a polimerização de FtsZ _Ec na presença de cátions monovalentes lembrando que k ⁺ ligação está ligado a polimerização FtsZ _Ec e é crucial para a atividade FtsZ ^10. O pH é mais critical quando a interacção de outras proteínas com FtsZ é estudada, como mostrado pelo exemplo anterior de SepF, e a dependência do efeito inibitório do MinC em FtsZ pH ^11. Como tanto o pH ea concentração de sal pode influenciar a interação entre FtsZ com outras proteínas, é importante escolher as condições adequadas e controles para os estudos de polimerização de FtsZ.

Aqui nós descrevemos os protocolos para estudar polimerização FtsZ e atividade GTPase por espalhamento de luz, microscopia eletrônica, sedimentação, e ensaios GTPase. Direita a dispersão da luz de ângulo é um método padrão para estudar polimerização FtsZ em tempo real ^12. Introduzimos algumas melhorias para o ensaio de sedimentação e GTPase. Apresentamos em detalhes como preparar amostras para espalhamento de luz e microscopia eletrônica. Vários tampões utilizados na literatura para estudar polimerização FtsZ foram testados e descrevem-se as melhores condições para cada experimento. Mostramos também que controla deve serapresentado para a obtenção dos melhores dados.

Estes métodos permitem um estudo rápido de polimerização FtsZ, atividade e interação com outras proteínas, utilizando métodos e equipamentos que está disponível na maioria dos laboratórios simples. Existem métodos mais sofisticados para estudar polimerização FtsZ mas muitas vezes exigem acesso a equipamentos mais especializados, e / ou modificação de FtsZ com etiquetas fluorescentes ^8,13,14. Os métodos simples descritos neste documento são ilustrados usando FtsZ de B. subtilis e E. coli, a organismos gram-modelo mais comum Gram + e. Os protocolos podem ser adaptados a qualquer outra proteína FtsZ. Com base em ensaios preliminares com estes novos FtsZs, pequenas mudanças em relação ao tempo, tampão ou temperatura de incubação pode ser necessário para um ótimo resultado. As experiências descritas aqui devem ajudar a encontrar estas condições ideais.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GTP	Roche	10106399001	Part 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7
Thickwall Polycarbonate Tubes	Beckman Coulter	343776	Part 2
Optima MAX-XP Ultracentrifuge	Beckman Coulter	393315	Part 2, 3
Polyallomer Tube with Snap-on Cap	Beckman Coulter	357448	Part 3
AIDA Bio-package, 1D, 2D, FL	Raytest Isotopenmessgeräte GmbH	15000001	Part 4
Luminescence Image Analyzer LAS-4000	Fujifilm		Part 4
Thermo Spectronic AMINCO-Bowman Luminescence Spectrometer	Spectronic Instruments		Part 5
Fluorescence Cell	Hellma Analytics	105-250-15-40	Part 5
Square 400 Mesh, Copper, 100/vial	Electron Microscopy Sciences	G400-Cu	Part 6
CM120 Electron Microscope Operating at 120 kV	Philips		Part 6
96 ml x 0.2 ml Plate	BIOplastics	B70501	Part 7
Malachite Green Phosphate Assay Kit	BioAssay System	POMG-25H	Part 7
PowerWave HT Microplate Spectrophotometer	BioTek		Part 7