FtsZ Polimerización Ensayos: Protocolos simples y Consideraciones

Abstract

Durante la división celular bacteriana, la proteína esencial FtsZ ensambla en el medio de la célula para formar el llamado anillo Z. FtsZ polimeriza en largos filamentos en presencia de GTP in vitro, y la polimerización se regula por varias proteínas accesorias. Polimerización de FtsZ ha sido ampliamente estudiado in vitro usando métodos básicos incluyendo dispersión de la luz, sedimentación, ensayos de hidrólisis de GTP y microscopía electrónica. Las condiciones del tampón influir tanto en las propiedades de polimerización de FtsZ, y la capacidad de FtsZ para interactuar con proteínas reguladoras. A continuación, describimos los protocolos para los estudios de polimerización de FtsZ y validar las condiciones y controles utilizando Escherichia coli y Bacillus subtilis FtsZ como proteínas modelo. Un ensayo de sedimentación baja velocidad se introduce que permite el estudio de la interacción de FtsZ con proteínas que agrupan o tubulate polímeros de FtsZ. Un protocolo de ensayo GTPasa mejorado se describe que permite realizar pruebasde la hidrólisis de GTP en el tiempo utilizando diferentes condiciones en una configuración de placa de 96 pocillos, con tiempos de incubación estandarizadas que suprimen la variación en el desarrollo de color en la reacción de detección de fosfato. La preparación de las muestras para los estudios de dispersión de luz y microscopía electrónica se describe. Varios buffers se usan para establecer pH adecuado y la concentración de sal para los estudios de polimerización de FtsZ. Una alta concentración de KCl es la mejor para la mayoría de los experimentos. Nuestros métodos proporcionan un punto de partida para la caracterización in vitro de FtsZ, no sólo a partir de E. coli y B. subtilis pero a partir de cualquier otra bacteria. Como tal, los métodos pueden ser utilizados para estudios de la interacción de FtsZ con proteínas reguladoras o las pruebas de fármacos antibacterianos que puedan afectar a la polimerización de FtsZ.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GTP	Roche	10106399001	Part 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7
Thickwall Polycarbonate Tubes	Beckman Coulter	343776	Part 2
Optima MAX-XP Ultracentrifuge	Beckman Coulter	393315	Part 2, 3
Polyallomer Tube with Snap-on Cap	Beckman Coulter	357448	Part 3
AIDA Bio-package, 1D, 2D, FL	Raytest Isotopenmessgeräte GmbH	15000001	Part 4
Luminescence Image Analyzer LAS-4000	Fujifilm		Part 4
Thermo Spectronic AMINCO-Bowman Luminescence Spectrometer	Spectronic Instruments		Part 5
Fluorescence Cell	Hellma Analytics	105-250-15-40	Part 5
Square 400 Mesh, Copper, 100/vial	Electron Microscopy Sciences	G400-Cu	Part 6
CM120 Electron Microscope Operating at 120 kV	Philips		Part 6
96 ml x 0.2 ml Plate	BIOplastics	B70501	Part 7
Malachite Green Phosphate Assay Kit	BioAssay System	POMG-25H	Part 7
PowerWave HT Microplate Spectrophotometer	BioTek		Part 7