Abstract
在细菌细胞分裂中，必需的蛋白质的FtsZ组装在单元的中间，以形成所谓的Z型环。 FtsZ的聚合成长的细丝在GTP的体外存在下，与聚合反应是由几个辅助蛋白调节。使用基本的方法，包括光散射，沉降，GTP水解测定法和电子显微镜的FtsZ聚合已被广泛研究的体外 。的FtsZ的缓冲液条件的影响都在聚合属性和FtsZ的，以与调节蛋白相互作用的能力。在这里，我们描述了协议的FtsZ的聚合研究，并利用大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的FtsZ作为模型蛋白的验证条件和控制。低速沉淀实验引入，允许FtsZ的相互作用的研究与捆绑或tubulate FtsZ的聚合物的蛋白质。一种改进的GTP酶的测定方案进行说明，它允许测试的GTP水解一段时间使用，在96孔板中设置，具有标准化的温育时间是取消变化的发色中的磷酸盐检测反应的各种条件。样品的光散射研究和电子显微镜的制备进行说明。几个缓冲区用于建立合适的缓冲液的pH值和盐浓度对FtsZ的聚合研究。高浓度氯化钾的是最适合大多数的实验。我们的方法提供了一个起点， 在体外表征FtsZ的，不仅从大肠杆菌大肠杆菌和B。枯草而是从任何其他细菌。因此，该方法可用于FtsZ的与调节蛋白或抗菌药物可能影响FtsZ的聚合试验的相互作用的研究。
Introduction
必要的菌体蛋白FtsZ的是细菌细胞分裂机制的最佳表征蛋白质。 FtsZ的是微管蛋白的原核同源物和聚合体外在GTP依赖性。 FtsZ的是由于它的保守性质和独特性细菌1,2新的抗生素非常有吸引力的目标。在细胞分裂的开始，FtsZ的形成cytokinetic环在midcell，作为支架的其他细胞分裂的蛋白质的装配。在Z环的形成是为师平面正确的定位至关重要。的FtsZ的组装动力学是由几个辅助蛋白，如（取决于细菌物种）明克，SepF，ZAPA，UGTP和EZRA 2调节。 FtsZ的聚合已被广泛研究的体外和许多不同的结构，包括直的原丝，弯曲的原丝，长丝片材，长纤维束和长丝的管子一直德cribed取决于装配缓冲液，核苷酸，及包含在所述测定3个额外的蛋白质。 FtsZ的原丝在体内的体系结构还没有完全理解，虽然在柄杆菌新月柄电子cryotomography的实验表明，在Z环是由相当短的，不连续的单一的原丝组装无需大量集束4。
在体外 ，FtsZ的和聚合性能的FtsZ与调节蛋白的相互作用是在反应缓冲液的组成敏感。例如，我们最近描述的互动网站SepF对FtsZ的C-末端，并表明，FtsZ的旅馆 Δ16C-末端截断不再绑定到SepF 5。在对SepF-FtsZ的旅馆互动先前的研究中，一个类似的FtsZ的旅馆 Δ16截断仍cosedimented与SepF，这表明，SepF绑定到辅助站点上的FtsZ
这里我们描述的协议，通过光散射，电子显微镜，沉降，和GTP酶测定法研究FtsZ的聚合和GTP酶活性。直角光散射是研究的FtsZ聚合实时12的标准方法。我们引进了一些改进的沉淀和GTP酶检测。我们将详细介绍如何准备样品的光散射和电子显微镜。使用在文献中研究的FtsZ聚合几个缓冲区进行了测试，我们描述了每个实验的最佳条件。我们还将显示控制应引入，以获得最佳的数据。
这些方法允许FtsZ的聚合活性，使用简单的方法和设备，可在大多数实验室其他蛋白质相互作用的快速学习。更复杂的方法来研究的FtsZ聚合存在，但常常需要访问更专门的设备，和/或用荧光标记8,13,14 FtsZ的修改。在本文中描述的简单方法是使用FtsZ的从二所示枯草芽孢杆菌和大肠杆菌大肠杆菌 ，最常见的革兰氏阳性和革兰氏模式生物。该协议可以适于任何其它的FtsZ蛋白。基于与这些新颖FtsZs，关于时间的微小变化，缓冲液或培养温度初步分析可能是必要的以便获得最佳结果。这里所描述的实验应该有助于找到这些最佳条件。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GTP | Roche | 10106399001 | Part 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 |
| Thickwall Polycarbonate Tubes | Beckman Coulter | 343776 | Part 2 |
| Optima MAX-XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | Part 2, 3 |
| Polyallomer Tube with Snap-on Cap | Beckman Coulter | 357448 | Part 3 |
| AIDA Bio-package, 1D, 2D, FL | Raytest Isotopenmessgeräte GmbH | 15000001 | Part 4 |
| Luminescence Image Analyzer LAS-4000 | Fujifilm | Part 4 | |
| Thermo Spectronic AMINCO-Bowman Luminescence Spectrometer | Spectronic Instruments | Part 5 | |
| Fluorescence Cell | Hellma Analytics | 105-250-15-40 | Part 5 |
| Square 400 Mesh, Copper, 100/vial | Electron Microscopy Sciences | G400-Cu | Part 6 |
| CM120 Electron Microscope Operating at 120 kV | Philips | Part 6 | |
| 96 ml x 0.2 ml Plate | BIOplastics | B70501 | Part 7 |
| Malachite Green Phosphate Assay Kit | BioAssay System | POMG-25H | Part 7 |
| PowerWave HT Microplate Spectrophotometer | BioTek | Part 7 |
References
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