Summary
Tilnærminger for å teste effekten av antipsykotiske medikamenter (APDS) i Caenorhabditis elegans blir demonstrert. Analysene er beskrevet for å teste narkotika effekter på utvikling og levedyktighet og på pharyngeal pumping rate. Disse metodene er også aktuelt for farmakogenetiske eksperimenter med narkotika andre enn APDS klasser.
Abstract
Caenorhabditis elegans er en enkel genetisk organisme mottagelig for storskala forover og bakover genetiske skjermer og kjemiske genetiske skjermer. The C. elegans genomet inneholder potensiell antipsykotisk medikament (APD) mål bevares hos mennesker, inkludert gener som koder for proteiner som er nødvendige for nevrotransmitter-syntese og for synaptisk struktur og funksjon. APD eksponering gir forsinket utvikling og / eller letalitet i nematoder på en konsentrasjonsavhengig måte. Disse fenotypene er forårsaket delvis av APD-indusert hemming av svelg-pumping 1,2. Dermed har utviklings fenotype en nevromuskulær basis, noe som gjør det nyttig for farmakogenetiske studier av nevroleptika. Her viser vi detaljerte prosedyrer for testing APD effekter på nematode utvikling og svelg-pumping. For utviklings analysen, er synkronisert embryoer plassert på nematode vekstmedium (NGM) plater som inneholder APDS, og stadier av utviklingen av animals blir deretter scoret daglig. For svelg pumpehastigheten analysen, iscenesatt unge voksne dyr er testet på NGM plater som inneholder APDS. Antallet svelg pumper per tidsenhet er spilt inn, og pumpehastighet beregnes. Disse analyser kan anvendes for å studere mange andre typer av små molekyler eller til og med store molekyler.
Introduction
Caenorhabditis elegans er en enkel genetisk organisme mottagelig for store forover og bakover genetiske skjermer og kjemiske genetiske skjermer. C. elegans er følsom for et bredt spekter av biologisk aktive forbindelser, og har derfor vært brukt med hell for å definere de virkningsmekanismer av en rekke slike forbindelser. For eksempel, bioaktive forbindelser studert ved hjelp av ormen Farmakogenetikk inkluderer acetylkolin reseptor agonister (f.eks levamisole, nikotin, morantel, og pyrantel), anestetika (f.eks halotan), koffein, kolinesterasehemmere (f.eks aldicarb, lannate, og triklorfon), fluor, GABA-relaterte forbindelser (f.eks GABA og muscimol), Ivermectin, paraquat, forbolestere, og serotonin-relaterte medikamenter (f.eks serotonin og imiprimine) tre. Videre C. elegans har vært brukt i stor skala lite molekyl skjermer, slik at oppdagelsen av nye bioaktive stoffets og identifisering av nye genetiske mål 4.
The C. elegans genomet inneholder potensiell antipsykotisk medikament (APD) mål bevares hos mennesker, inkludert gener som koder for proteiner som er nødvendige for nevrotransmitter-syntese og for synaptisk struktur og funksjon 5. Således C. elegans nevrogenetikk og nevrobiologi tilbyr metoder for å oppdage nye molekylære virkningsmekanismer av APDS. I nematoder, APD eksponering tidlig i utviklingen gir forsinket utvikling, og ved høyere konsentrasjoner, letalitet 2,6. APD eksponering i voksen alder produserer atferds fenotyper. For eksempel, hemmer klozapin eksponering locomotion og svelg-pumping og forbedrer egglegging 1,2,7.
APD-indusert forsinket utvikling og dødelighet er kraftige fenotyper for store kjemiske genetiske skjermer. Disse fenotyper er komplekse i så langt som de sannsynligvis har mer enn ett mobilnettet og genetiske basis. Derfor, er slike genetiske skjermer forventes å gi en rekke indirekte stoffet mål. Imidlertid har vårt laboratorium gjennomført kandidat genet skjermer og et genom-wide RNAi skjermen for undertrykkere av APD-indusert forsinket utvikling og dødelighet og har med hell gjenopprettet gener som trolig koder direkte mål, inkludert dopamin, insulin, og nikotin-acetylcholin reseptorene 2,8. Genetiske skjermer basert på APD-indusert atferd i den voksne har også ført til identifisering av nye APD mål, og vi er nå validere mål fra både utviklings-og atferds skjermer i pattedyr 7. Dermed ser en invertebrate kjemisk genetisk tilnærming til å oppdage nye molekylære virkningsmekanismer av APDS å være mulig 5,8.
The C. elegans Svelget er et organ som inkluderer 20 nevroner, 20 muskelceller, og 20 tilbehørs celler, innpakket av en basalmembran. På samme måte som pattedyr hjerte, svelget autonom ennd stadig pumper mat inn fra det ytre miljø 9.. Hemming av svelg pumpehastighet kompromisser fødeopptak, og dermed mutasjoner eller medikamenter som hemmer pharyngeal pumping årsaken forsinket utvikling eller arrestere ni. APDS hemme svelg pumpehastigheten, sto delvis for deres effekter på utvikling og levedyktighet 1,2. Her bruker vi den atypisk APD klozapin som et eksempel for å demonstrere narkotika analyser for nematode utvikling og svelg-pumping.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Developmental Delay / letalitetsprøven: The Wild-Type (N2) og To Mutant (Mut1 og Mut2) stammer er testet i tre Clozapine Konsentrasjoner i en 12-brønns plate
- På dag 1, helle 2 ml NGM medium 10 inn i hver brønn av en 12-brønns plate (hver brønn med et 2 cm diameter) og la det stivne i benken ved romtemperatur (RT) over natten. Den samme dag, velge en koloni av Escherichia coli OP50 bakterier, infisere en flaske med 50 ml LB-løsning, og kulturen det i en 37 ° C risteapparat ved 220 rpm rotasjon over natten.
- På dag 2, overfør 20 pl OP50 bakteriekultur på midten av hver NGM godt. Inkuber platene i en 37 ° C inkubator eller la dem stå ved RT over natten for å tillate bakteriematten til å vokse tykkere.
- Gjør en 80 mM klozapin stamløsning ved oppløsning av klozapin i DMSO (dimetylsulfoksid) løsemiddel. Deretter lage en 80 mL arbeidsløsning med stamløsning fortynnes i 1,7 mM eddiksyre based på Tabell 1.
Merk: Den arbeidsoppløsning for et bestemt stoff av interesse må bestemmes ved å gjøre en serie innledende konsentrasjon tester for å finne den mest passende konsentrasjon for å skille den fra villtype-mutantene. - Overføring 80 mL klozapin arbeidsoppløsning på seeded NGM plate godt og virvle plate for å tillate løsningen til å fordele jevnt på overflaten. Vent på platen for å tørke. Bruk platen for analyse på samme dag eller plassere den i en 20 ° C inkubator som skal brukes til neste dag.
Merk: Den arbeidsoppløsning er et stoff suspensjon på grunn av den lave løseligheten av klozapin, spesielt ved høyere konsentrasjon. Derfor vortex tube før overføring av løsningen til stoffet platen for å sikre at medikamentkonsentrasjonen er korrekt. - Vask ormer av en 3,5 cm plate som inneholder mange av gravid voksne med M9 buffer og deretter spinne dem ned i en 15 ml tubeved 2000 opm i 1 min.
- Aspirer supernatanten. Tilsett 5 ml blekemiddel (NaOH: hypokloritt: DDH 2 O på 4:01:05) og forstyrre de nematoder ved forsiktig å snu rørene.
- Observer dyrene inntil halvparten av dem er oppløst på rundt 5 min. Spinn ned eggene ved 2000 opm i 1 min.
- Aspirer supernatanten og tilsett 14 ml M9 buffer raskt.
- Spinn ned eggene ved 2000 opm i 1 min og suge supernatant, slik at omtrent 100 pl oppløsning. Vortex å suspendere eggene.
- Overfør 2 mL egg suspendert i M9 på en vanlig NGM plate for å teste hvor mange egg er overført. Juster volumet av de suspenderte egg for å sikre at det er ca 30-35 egg i hver overføring. Overfør 30-35 egg til hver brønn av analyseplaten, og inkuberes i et 20 ° C inkubator i 24 timer.
- På den første dagen av analysen, score mange egg klekket. Juster det totale antall klekket dyr å 25/well etter picking av ekstra ormer om nødvendig.
- På de neste dagene, observere dyrene og scorer dem hver 24 time. Utviklingsmessig stadium er scoret basert på størrelsen av dyret og formen av vulva 11.. Forsøket varer i 5-6 dager med det mest robuste effekten vanligvis sett på den tredje eller fjerde dag.
- Skrive data inn i en Excel-fil, og beregne hvor stor andel av dyr på hvert utviklingsstadiet for hver dag av forsøket. Generere grafer med funksjonen '100% stablet stolpe "i '2-D kolonnen"-menyen.
2. Faryngal Pumping analysen: Unge voksne dyr for villtype og mutant stammer er scoret på Clozapine analyse Plates
- Analyseplaten er laget ved å følge samme protokoll som brukes for forsinket utvikling / letalitetsprøven.
- Plukk 50 L4 dyr for hver stamme til seeded NGM plater 24 timer før analysen og ruge ormer ved 20 ° C.
- Plukk 10 dyr til en assay plate også. Deretter plukke 10 dyr til neste brønn hver 15-20 min.
- Etter dyrene i den første brønnen har blitt eksponert for stoffet for 30 min, starter analysen ved å observere pharyngeal pumping under en disseksjon mikroskop og scorer pumpene for 20 sek 9. Når pharyngeal pumping er scoret, plukke ormen av platen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En. Forsinket utvikling / letalitetsprøven resultat
Et typisk resultat for forsinket utvikling / letalitetsprøven er vist i figurene 1a og 1b. Når villtype dyr i kontrollgruppen har vokst til gravid voksne stadiet (Figur 1a), vill type dyr eksponert for klozapin er fortsatt i de unge larvestadier eller er døde (Figur 1b). Figur 1c viser et representativt resultat sammenlikne en suppressor mutant (Mut1) og en forsterker mutant (Mut2) med villtypen på tre forskjellige klozapin konsentrasjoner. Ved alle tre klozapin konsentrasjoner, dødeligheten av Mut1 er lavere enn villtype og dødeligheten av Mut2 er høyere. Overlevende Mut1 dyr videre til mer avanserte larvestadier enn villtype, mens overlevende Mut2 dyr viser forsinket utvikling sammenlignet med villtype. </ P>
2. Faryngal pumping rente analyseresultat
Figur 2 viser et representativt svelg-pumping assay-resultatet sammenligner et suppressor mutant (Mut1), og en enhancer mutant (Mut2), med vill-type på to klozapin konsentrasjoner. Klozapin eksponering reduserer svelget pumping priser av de villtype og mutant stammer i en konsentrasjonsavhengig måte. Imidlertid er redusert faryngeale pumperate på Mut1 mindre enn for villtype, mens den reduserte faryngeale pumperate på Mut2 er større enn den til villtype.
Figur 1. Demonstrasjon av klozapin-indusert forsinket utvikling og letalitet. Wild-type dyr (N2) dyrket på et styre NGM platen (a), og på en NGM plate supplert med 200 ug / ml (612 pM) klozapin (b). (C) Et representativt resultat av forsinket utvikling / letalitetsprøven viser klozapin effekt på villtype (N2), en suppressor mutant (Mut1), og en enhancer mutant (Mut2). Bildene i (a) og (b) er gjengitt < http://www.nature.com/npp/journal/v34/n8/full/npp200935a.html > fra Neuropsychopharmacology. 34 (8), 1968-1978 (juli , 2009). Klikk her for å se større bilde .
ig1.jpg "width =" 600px "/>
Figur 2. Demonstrasjon av klozapin-indusert hemming av svelg-pumping. Et typisk resultat for svelg pumping analysen viser klozapin effekt på villtype (N2), en suppressor mutant (Mut1), og en enhancer mutant (Mut2). Dataene ble analysert med to-veis ANOVA hjelp av statistisk program R. Klikk her for å se større bilde .
Tabell 1. Utarbeidelse av arbeidsløsning av klozapin. Mengden er for fire brønner ved hver konsentrasjon.
| Klozapin konsentrasjon | 0 mikrometer | 300 mikrometer | 400 uM | 500 uM |
|---|---|---|---|---|
| HAC løsning | 270 mL | 270 mL | 270 mL | 270 mL |
| Klozapin stamløsning | - | 30 ul | 40 mL | 50 mL |
| DMSO | 50 mL | 20 mL | 10 ul | 0 mL |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi Metodene for å undersøke effekten av APDS på utviklingen og virkemåten til C. elegans. DMSO eller etanol benyttes for å oppløse klozapin, ettersom medikamentet er relativt uoppløselig i vann. Fordi oppløsningsmidler har vært rapportert å påvirke C. elegans biology 12, DMSO-alene eller etanol stående kontrollgrupper er avgjørende. Den høyeste konsentrasjon av DMSO som brukes i våre analyser er opp til 3%, noe som ikke har en klar betydning for C. elegans utvikling. DMSO kan brukes til mange små molekyler, eller til og med noen store molekyler, for eksempel lipid-syrer.
APD-konsentrasjoner anvendt i disse analysene er høyere enn de som ble gitt til mennesker. Dette er vanlig for de fleste små molekyl studier i C. elegans, siden høye konsentrasjoner er nødvendig for gjennomtrengning av C. elegans cuticle. HPLC-studier indikerer at nivåene av klozapin i C. elegans vev i utviklings assay er nær de forventet i menneskelige hjerner to.
Penetrasjon av skjellaget er en spesiell bekymring for studier av store molekyler. Mutanter med defekter i skjellaget barriere, for eksempel ACS-20 mutanter og buss (B acterially U n-S wollen) mutanter, tilbyr en tilnærming for å omgå dette problemet 13. Buss mutanter har vært isolert på grunnlag av deres motstand mot infeksjon av patogenet Microbacterium nematophilum. For eksempel svake alleler av bus-8 viser at dette genet spiller en rolle i produksjonen av hårstråene overflate. Disse mutanter er resistente mot infeksjon, fordi bakterien ikke kan binde seg til verts overflate. Viktigere, forstyrrelse av skjellaget dannelse også fører til økt følsomhet for legemidler i denne genetiske bakgrunn 14.
Den utviklingsmessige analysen beskrevet her kan skaleres opp for store genetiske skjermer ved å utføre analysen i flytende Culture. For genom-wide RNA interferens (RNAi) skjermer, for eksempel, er den protokoll som ligner den som er beskrevet ovenfor, men mater RNAi bakterier blir substituert for OP50 bakterier 15. Den flytende kultur assay krever en lavere medikamentkonsentrasjon enn plate-analyse (upublisert observasjon). Vårt laboratorium utført slikt genom-wide RNAi skjermen for undertrykkere av klozapin-indusert forsinket utvikling og fått 40 dempere fra en skjerm på ~ 17 000 C. elegans gener åtte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at det ikke er interesse konflikt involvert.
Acknowledgments
Arbeidet ble støttet av en NIH Klinisk Scientist Development award K08NS002083, en Shervert Frazier Research Institute Grant, og en NARSAD Young Investigator Award til Edgar A. Büttner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clozapine | Sigma | C6305 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Acetic acid (HAC) | Fisher | BP2401 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | EMD | SX0590-13 | |
| Hypochlorite | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810 000.017 | |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | M1246-0006 | |
| Low temperature incubator 815 | Precision Scientific | J1790-1B | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX12 | |
| Petri dish 35 x 10 mm | Fisher Scientific | NC9434271 | |
| 12-well Tissue culture plate | BD Falcon | REF 353043 |
References
- Donohoe, D. R., Jarvis, R. A., Weeks, K., Aamodt, E. J., Dwyer, D. S. Behavioral adaptation in C. elegans produced by antipsychotic drugs requires serotonin and is associated with calcium signaling and calcineurin inhibition. Neurosci. Res. 64, 280-289 (2009).
- Karmacharya, R., et al. Clozapine interaction with phosphatidyl inositol 3-kinase (PI3K)/insulin-signaling pathway in Caenorhabditis elegans. Neuropsychopharmacology. 34, 1968-1978 (2009).
- Rand, J. B., Johnson, C. D. Carnorhabditis elegans Modern Biological Analysis of an Organism. Estein, H. F., Shakes, D. C. 48, Academic Press, Inc.. 187-204 (1995).
- Kwok, T. C., et al. A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist. Nature. 441, 91-95 (2006).
- Wang, X., Sliwoski, G. R., Buttner, E. A. The relevance of Caenorhabditis elegans genetics for understanding human psychiatric disease. Harv. Rev. Psychiatry. 19, 210-218 (2011).
- Donohoe, D. R., Aamodt, E. J., Osborn, E., Dwyer, D. S. Antipsychotic drugs disrupt normal development in Caenorhabditis elegans via additional mechanisms besides dopamine and serotonin receptors. Pharmacol. Res. 54, 361-372 (2006).
- Karmacharya, R., et al. Behavioral effects of clozapine: involvement of trace amine pathways in C. elegans and M. musculus. Brain Res. 1393, 91-99 (2011).
- Saur, T., et al. A Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans Identifies the Nicotinic Acetylcholine Receptor Subunit ACR-7 as an Antipsychotic Drug Target. PLoS Genet. 9, (2013).
- Avery, L., You, Y. J. C. elegans feeding. WormBook, ed. The C. elegans Research Community, doi:10.1895/wormbook.1.150.1. , Available from: http://www.wormbook.org (2012).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. 47, (2011).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T. Carnorhabditis elegans Modern Biological Analysis of an Organism. Estein, H. F., Shakes, D. C. 48, Academic Press, Inc.. 3-29 (1995).
- Davis, J. R., Li, Y., Rankin, C. H. Effects of developmental exposure to ethanol on Caenorhabditis elegans. Alcohol Clin. Exp. Res. 32, 853-867 (2008).
- Kage-Nakadai, E., et al. Two very long chain fatty acid acyl-CoA synthetase genes, acs-20 and acs-22, have roles in the cuticle surface barrier in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 5, (2010).
- Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis. Dev. Biol. 317, 549-559 (2008).
- Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. J. Vis. Exp. (51), (2011).
