Summary
שיטות למניפולציה והניתוח של neurogenesis בהיפוקמפוס המבוגר NF-κB תלוי מתוארות. פרוטוקול מפורט מוצג לבדיקה משוננת gyrus תלוי התנהגותי (שמכונה במבוך ההפרדה בארנס דפוס המרחבי) לחקירת תוצאה קוגניטיבית בעכברים. טכניקה זו צריכה גם לעזור לאפשר חקירות בהגדרות ניסיוניות אחרות.
Abstract
ההיפוקמפוס ממלא תפקיד מרכזי בהיווצרות והגיבוש של זכרונות אפיזודי, ובהתמצאות במרחב. מבחינה היסטורית, ההיפוקמפוס המבוגר נצפה כאזור אנטומי מאוד סטטי של המוח היונקים. עם זאת, הממצאים אחרונים הראו כי הרכס משוננת של ההיפוקמפוס הוא אזור של פלסטיות עצומה במבוגרים, הכולל לא רק שינויים של מעגלים עצביים קיימים, אלא גם neurogenesis למבוגרים. פלסטיות זה מוסדרת על ידי רשתות תעתיק מורכבות, שבו גורם שעתוק NF-κB משחק תפקיד בולט. ללמוד ולטפל neurogenesis למבוגרים, מודל עכבר מהונדס לעיכוב עצבי מוח קדמי ספציפי של פעילות NF-κB ניתן להשתמש.
במחקר זה, שיטות מתוארות לניתוח נוירוגנזה NF-κB תלויה, לרבות היבטיה המבניים, אפופטוזיס העצבי ושגשוגם מולידם, ומשמעות קוגניטיבית, אשרשעות היו דווקא העריכה באמצעות gyrus משוננת (DG) תלוי מבחן התנהגות, מבוך ההפרדה בארנס דפוס המרחבי (SPS-BM). פרוטוקול SPS-BM יכול להיות פשוט מותאם לשימוש עם מודלים של בעלי חיים מהונדסים אחרים שנועדו להעריך את השפעתם של גנים מסוימים בneurogenesis בהיפוקמפוס המבוגר. יתר על כן, SPS-BM יכול לשמש בהגדרות ניסיוניות אחרות שמטרתם לחקור ומניפולצית למידת DG תלויה, למשל, באמצעות סוכנים תרופתיים.
Introduction
אונטולוגית, ההיפוקמפוס הוא אחד המבנים העתיקים ביותר במוח אנטומיים הידועים. הוא אחראי על משימות מורכבות מגוונות, כגון פונקציות מרכזיות בוויסות של זיכרון לטווח ארוך, התמצאות במרחב, ועל היווצרות וגיבוש של הזיכרון, בהתאמה. מבחינה אנטומית, ההיפוקמפוס מורכב משכבות פירמידה תא (pyramidale שכבה) כוללים cornu Ammonis (CA1, CA2, CA3, וCA4) האזורים וgyrus משוננת (dentatus gyrus), המכיל תאי גרגיר וכמה אבות עצביים באזור subgranular . תאי גרגיר להקרין לכיוון אזור CA3 באמצעות הסיבים שנקרא אזובי (האקסונים של תאי גרגיר).
עד סוף המאה שעברה, היה האמין המוח של היונקים הבוגרים להיות איבר סטטי חסר פלסטיות ונוירוגנזה סלולריות. עם זאת, בשני העשורים האחרונים, כמות הולכת וגדלה של עדויות מראה בבירור neurogenesis למבוגרים המתרחשים בלפחותשני אזורים במוח, אזור subventricular (SVZ) ואזור subgranular של ההיפוקמפוס.
המחקרים הקודמים שלנו, ואלה של קבוצות אחרות, הראו כי גורם שעתוק NF-κB הוא אחד הרגולטורים המולקולריים החיוניים של neurogenesis למבוגרים, ושתוצאות דה הרגולציה שלה בפגמים חמורים מבניים בהיפוקמפוס וליקויים קוגניטיביים 1-6. NF-κB הוא השם הגנרי של גורם שעתוק מושרה מורכב משילובים שונים dimeric של חמש יחידות משנה-DNA מחייבת: p50, P52, c-Rel, RelB, וp65 (רלה), יש להם את שלוש האחרונים שבם תחומים transactivation. בתוך המוח, הצורה נפוצה ביותר נמצאת בציטופלסמה היא heterodimer של p50 וp65, אשר נשמר בצורה פעילה על ידי מעכב של kappa B (IκB), חלבונים.
ללמוד ולתפעל ישירות נוירוגנזה מונעת-NF-κB, אנו משתמשים במודלי עכבר מהונדסים כדי לאפשר עיכוב פשוט של כל subun NF-κBשלה, במיוחד במוח הקדמי 7 (ראה איור 1). לצורך כך, אנו חוצים גידלו-השורות הבאות מהונדסים עכבר, IκB / - ו-/tTA. IκB / המהונדס - הקו נוצר באמצעות מוטציה שלילית טרנס דומיננטי של NF-κB-המעכב IκBa (סופר מדכא IκBa-Aa1) 8. בניגוד לIκBα wild-type, יש IκBα--1AA שתי שאריות סרין מוטציה לalanines (V32 וV36), אשר מעכב את זירחון והשפלה proteasomal הבא של המעכב. לביטוי נוירון הספציפי מוח קדמי של IκBa--1AA-transgene, IκB / - עכברים הכליאו עם עכברי מחסה קינאז בסידן calmodulin תלוי IIα (CAMKIIα), אמרגן שיכול להיות מונע על ידי טרנס activator טטרציקלין (TTA) 9.
יש עכברים עקום החוצה p65 פנוטיפ הקטלני עוברי, בשל אפופטוזיס כבד המסיבי 10, ולכן הגישה המוצגת כאן מספקת שיטה אלגנטיתלחוקר את התפקיד של NF-κB בלידה וneurogenesis למבוגרים.
מבחן ההתנהגות הקלאסי ללמוד למידה וזיכרון המרחביים שתואר ב1980s על ידי ריצ'רד מוריס, מבחן המכונה המים מבוך מוריס (MWM) 11. במי מבוך פתוח בתחום זה, בעלי חיים ילמדו לברוח ממים אטומים על גבי פלטפורמה מוסתרת מבוססת על רמזי התמצאות ובמיוחד מבוך. גרסה יבשה של MWM היא המבוך שנקרא ברנס (BM) 12. בדיקה זו עושה שימוש בצלחת עגולה עם 20 חורים עגולים מסודרים בגבול של צלחת, עם חור אחד מוגדר כתיבת בריחה, ורמזים נוסף מבוך חזותיים לאורינטציה. שני פרדיגמות הניסוי מסתמכות על הטיסה הנגרמת על ידי מכרסמים `s סלידה למים, או שטחים פתוחים, מוארים ההתנהגות. בשני המבחנים יאפשר חקירה של התמצאות במרחב, וביצועי זיכרון הקשורים. למרות ההיפוקמפוס ממלא תפקיד בכלל וחיוני להיווצרות הזיכרון המרחבי, r בהיפוקמפוסegions המעורב להשתנות בהתאם למבחן המוחל. הזיכרון נבדק בBM נובע מפעילות עצבית בין קליפת מוח enthorinal (EC) ונוירונים פירמידליים ממוקמים באזור CA1-של ההיפוקמפוס בלי תרומה של 13-16 DG. בפרט, BM הקלאסי נשען בעיקר על ניווט באמצעות מסלול monosynaptic temporo-ammonic מEC III לCA1 לEC V. חשוב לציין, DG הוא מעורב באופן מכריע בהכרה שנקרא מרחבית דפוס 17, מה שמרמז לא רק העיבוד של מידע חזותי ומרחבית, אלא גם את הפיכתו של ייצוג או זכרונות דומים לייצוגים שונים, nonoverlapping. משימה זו דורשת מעגל פונקציונלי תלת סינפטי מEC השני לDG לCA3 לCA1 ו-EC השישי, שלא ניתן לבדוק ב15 BM.
כדי לטפל באתגרים אלה, יש לנו המציאו SPS-BM כמבחן התנהגותי כדי לבדוק את הביצועים קוגניטיביים משוננת gyrus תלוי בשיתוף במיוחדבעלי החיים ntrol, ובמודל סופר המדכא IκB / TTA הבא עיכוב NF-κB. חשוב לציין, בניגוד לMWM או BM, SPS-BM יכול לחשוף גירעונות התנהגותיים עדינים הנובעים מירידת הערך של נוירוגנזה. מאז מרחבית דפוס ההפרדה היא תלויה אך ורק על מעגל פונקציונלי בין EC השני וDG וCA3 וCA1 ו-EC VI, המבחן הזה הוא רגיש מאוד לשינויים אפשריים בנוירוגנזה, שינויים של מסלול אזובי סיבים או שינויים של הומאוסטזיס רקמה בתוך DG.
מבחינה טכנית, ההגדרה של הבדיקה שלנו מבוססת על המחקר של Clelland et al., שבו דפוס ההפרדה המרחבית נבדק באמצעות מבוך 8 זרוע עץ זרוע הרדיאלית (RAM) 19. בהגדרה שונה שלנו, הוחלפו שמונה זרועות על ידי שבעה בתי אוכל צהובים זהים. לסיכום, השיטות שמוצגים כאן, ובכלל זה ניתוח (DCX +)-להביע תאי doublecortin בתוך ההיפוקמפוס, תחזיות אזובי סיבים, דה תאים עצביתATH ובמיוחד SPS-BM שהוצג כאן, יכול להיות מיושם על חקירות של דגמי עכבר אחרים המשלבים transgenes שיש להם השפעה על neurogenesis למבוגרים. יישומים נוספים עשויים לכלול את המחקר של סוכנים תרופתיים ומדידת ההשפעה שלהם על הפרדת דפוס DG ומרחבים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
שמירה על האתיקה
מחקר זה בוצע בהתאם קפדן עם התקנות של ועדת בעלי החיים ושימוש בטיפול הממשלתית, LANUV של המדינה נורדריין וסטפליה, (דיסלדורף, גרמניה). כל הניסויים בבעלי החיים אושרו על ידי LANUV, דיסלדורף תחת מספר הרישיון 8.87-51.04.20.09.317 (LANUV, NRW). כל המאמצים נעשו כדי למזער את המצוקה ואת מספר בעלי החיים הדרושים למחקר.
1. טיפול בבעלי חיים ושיכון
- כל בעלי החיים המשמשים בפרוטוקולים שתוארו במסמך זה צריכים להיות כל הזמן תחת תנאי הפתוגן ללא ספציפיים, כפי שהוגדרו על ידי הפדרציה האירופית מעבדת מדעי בעלי החיים האגודה (FELASA).
- צריכים להיות כל הזמן עכברים בכלובים סטנדרטיים בטמפרטורת חדר ולחות מבוקרת (22 ° C) בתנאים היומיים (שעות אור 12 / מחזור כהה) עם HEPA מסונן מיזוג.
- מזון ומים תקניים צריכים להיות כרצונך בתנאי. </ Li>
- אם IκB / TTA וIκB / - עכברי בקרה משמשים, גנוטיפ מבוסס PCR יש לבצע עבור כל חיה, כפי שתואר ב7, 18.
- צריכים להיות בשימוש בעלי חיים ממין זכר עם הפרש גילים של פחות מארבעה ימים כדי להפחית את השונות אישיות.
- (לא חובה): לניסויים מחדש NF-κB, דוקסיציקלין חייב להינתן במי שתייה (2 מ"ג / מיליליטר עם סוכרוז 2.5%) לפחות 14 ימים.
2. תבנית מרחבית הפרדה-בארנס מבוך (SPS-BM)
- כל הבדיקות התנהגותיות צריכה להתבצע על פי הנחיות בינלאומיות ומקומיות.
- חשוב! השתמש רק בעכברי זכרים עם גיל שישה חודשים ומעלה. הפרש הגילים בין החיות סדרת מבחן אחד צריך להיות פחות מארבעה ימים. הבדיקה חייבת להתבצע על ידי אותו מפעיל לכל סדרה. העכברים צריכים לקבל תזונה רגילה לפני הבדיקה כדי להגביר את המוטיבציה מונעת באופן חלקי על ידי כנוסףגמול מזון weet.
- הגדר את צלחת עגולה לבנה עשויה מפלסטיק קשיח (120 סנטימטר הקוטר, ראה איור 5 א) ובלחות בחדר בטמפרטורה מבוקרת (22 מעלות צלזיוס), מוארת עם לפחות 4 x 80 W ו 3 x 215 מנורות ניאון ניאון W . חשוב! להבטיח את התאורה הנכונה משמשת, כפי שהמוטיבציה של העכברים להיכנס לבתי האוכל הוא מונעת באופן חלקי על ידי שנאה שלהם למקומות בהירים, חשופים.
- הגדר את מערכת וידאו למעקב. המצלמה צריכה להיות ממוקמת 115 ס"מ מעל מרכז הצלחת (ראה איור 5 א).
- צרף רמזים ססגוניים במיוחד מבוך (EMC) לבד לבן בצבע בעמדות לעין בקלות לבעלי החיים, כ 100 סנטימטר מהגבול של הצלחת (ראו איור 5 א).
- לנקות בזהירות את הצלחת עם חומר חיטוי מהיר שיכול להסיר כל ריח מניסיוני ההגדרה.
- הנח שבעה בתים זהים צהובים מזון (12 ס"מ X 7 ס"מ X 8 סנטימטר, ראו איור 5A איור 5 א).
- הנח תגמולים מתוקים גלולה מזון (רבע מבית יותר הרציני Loop / מזון `s Kellogs) בתוך כל בתי האוכל בעמדות מוגדרות (ראה איור 5 א) רק עם ביתה אוכל הגדיר את אחד להיות נגיש באופן חופשי לבעלי החיים (מיקום F, ראו איור 5A ). לסגור את בתי האוכל nontarget בנייר שקוף.
- לפני הבדיקה, לבצע הרגלה (יום אחד לפני שמתחיל את המשימה). הפוך את כל בתי המזון נגישים באופן חופשי ולאפשר לעכברים כדי לחקור את המבוך באופן חופשי וכדי לאחזר גמול גלולה מזון (10 דקות / בעלי חיים).
- כבה את המחשב ואת המצלמה ולהפעיל את תוכנת מערכת וידאו למעקב.
- להתחיל את ההקלטה.
- מניחים את החיה בנקודת ההתחלה המוגדרת על הצלחת העגולה (איור 5A, S: להתחיל עמדה) ולאפשר לעכברים כדי לחפש את בית האוכל היעד ל10 דקות.
- סטוp וידאו המעקב.
- חשוב! נקה את הצלחת העגולה ובתי מזון לאחר כל ניסוי עם חומר חיטוי מהיר.
- חזור על הבדיקה ביום למשך שבעה ימים רצופים (עבור כל חיה).
- לנתח את התוצאות (חביון, מרחק מכוסה ושגיאות) באמצעות תוכנה הסטטיסטית מתאים. הגדרת טעויות כמתקרבים לבית האוכל הלא נכון ו / או מגע עם התיבה הנכונה בלי להיכנס ואחזור הפרס גלולה מזון. לצורך הניתוח קובצו להשתמש דו סטרי ANOVA עם פוסט הוק מבחן Bonferroni.
- (אופציונלי) להקריב את העכברים ולנתח hippocampi כמתואר להלן.
3. תיוג BrdU
- הזרק intraperitoneally 50 מ"ג / קילוגרם ip BrdU פעם ביום למשך 3 ימים (ניתוח של גזירה ואינטגרציה) או ה-IP 200 מ"ג / קילוגרם לזריקה אחת (ניתוח של התפשטות).
- להקריב בעלי החיים, לנתח את ההיפוקמפוס ולהכין 40 מיקרומטר סעיפים כפי שיתואר להלן.
- Denaturateחלקים עם 2 M HCl עבור 10 דקות ו דגירה ב0.1 חיץ borate M עבור 10 דקות.
- תווית סדרה אחת ב-עשר 40 מיקרומטר סעיפים (מלבד 240 מיקרומטר) מכל חיה immunohistochemically, כפי שיתואר להלן באמצעות נוגדנים המכוונים נגד BrdU.
- לכמת את התאים שכותרתו על ידי ניתוח מיקרוסקופיה confocal ברחבי מידת rostrocaudal של שכבת תאי גרגר ואזור subgranular. הכפל את המספרים וכתוצאה מכך על ידי 12 להשיג את המספר הכולל המשוער של תאים שכותרתו BrdU להיפוקמפוס ומתחלקים על ידי שתי כדי לקבל את המספר הכולל של תאים שכותרתו לDG.
4. ההסרה של המוח והכנת cryosections מבעלי חיים Nonperfused
- שים לב לנהלים שאושרו באופן מקומי להרדמת חסד בעלי חיים. עכברים יכולים להיות מורדמים באופן ישיר על ידי נקע בצוואר הרחם.
- יכולים להיות מורדמים בעלי חיים (אופציונליים) לפני euthanization על פי הנחיות בינלאומיות ומקומיות, למשל על ידי inje intraperitonealction של 0.8 מיליליטר Avertin לעכבר 33 g (טרי שנעשה על ידי ערבוב 150 מיליליטר פתרון מניות עשויים 2.2 מ"ג 2,2,2-tribromoethanol ב 1 מיליליטר isoamyl אתנול עם 1.85 מיליליטר של תמיסת מלח או חיץ פיסיולוגי).
- לעקר את הראש עם פולידין (10% povidone-יוד) ספוג גזה ולאחר מכן עם ספוגית גזה הספוגה ב70% אתנול.
- לערוף את בעלי החיים באמצעות מספריים כירורגיות מתאימים ולמשוך את העור בצד.
- ניתן ליישם תופסנים (אופציונליים) כדי להימנע מהקיפול אחורי של העור המפגר.
- ביצוע חתך קו האמצע בגולגולת ומושך בזהירות את השברים בגולגולת בצד.
- מוציא בזהירות את המוח כולו באמצעות מכשיר מתאים כירורגית (למשל מוריה כפית).
- Precool 25 מיליליטר של 2 מתילבוטאן בכוס מיליליטר 50 (למשל שוט דוראן) ל-30 עד C ° -40 על קרח יבש.
הערה: עבור מכתים הריחוף ללא סעיפים "עבים", אשר מתאימים באופן אידיאלי למיקרוסקופ לייזר confocal סריקה, להסיר מוח, לשטוף 3פעמים בחיץ ולאחסן ב 4 ° C בפוספט שנאגרו 30% תמיסת סוכרוז ב50 צינור מיליליטר עד המוח שקע עד לתחתית (בדרך כלל בלילה). - בזהירות במקום מוח על פיסת Nescofilm (Parafilm) ומכסים בכמות גדולה של מתחם TissueTek אוקטובר, להקפיא בNescofilm ב2 מתילבוטאן, חנות ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
הערה: עבור אחסון לטווח זמן בחנות -20 מעלות צלזיוס בסוכרוז 9%, 7 מ"מ MgCl 2, חיץ פוספט 50 מ"מ, גליצרול 44%. - חותכים את המוח ל10-12 מיקרומטר חלקים עבים על cryomicrotome המתאים.
הערה: חלקים עבים, חופשיים צף, להקפיא מוח על cryotome שלב של cryotome המתאים (למשל רייכרט יונג, Frigomobil.) ולחתוך 40 מיקרומטר סעיפים אופקיים ב -20 ° ל-- 25 ° C. לאסוף חלקים מסכין עם מכחול דק ולאסוף במאגר או לשמור בפתרון אחסון (שלב 4.9) ב -20 ° C עבור אחסון לטווח זמן. - הר שתי פרוסות בזהירות על שקופיות מיקרוסקופ אחת. שלנודואר של שקופיות Superfrost UltraPlus מומלץ מאוד למקסם את ההדבקה של החלקים.
- ייבש את השקופיות עבור 5 דקות בטמפרטורת חדר. שקופיות ניתן לאחסן ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
5. הכנת סעיפים מבעלי חיים perfused
- להרדים את החיות כפי שתואר לעיל (שלב 4.2).
- תנקב את החיה בזהירות transcardially עם פוספט שנאגרו מלוח (PBS) המכיל הפרין (0.025 g/100 מיליליטר PBS) ופרוקאין (0.5 g/100 מיליליטר PBS) במשך 2-4 דקות, ואחריו paraformaldehyde 4% ב-PBS עבור 10-15 דקות . זלוף מבוצע בצורה אופטימלית על ידי מרוסס דרך החדר והפתיחה של אטריום ימין השמאל באמצעות לחץ ההידרוסטטי של כ 1.2-1.4 מ 'או ניצול משאבת peristaltic מוגדרת כ 15 מיליליטר / דקה. תוצאות זלוף אופטימליות במוח לבן חיוור בלי כלי דם אדומים להיות גלויים.
- לנתח ולאחר לתקן את מוחם בparaformaldehyde 4% ב-C ° 4 ל24 שעות.
- Cryoלהגן על המוח בסוכרוז 30% PBS ב 4 מעלות צלזיוס למשך לפחות 24 שעות.
- להקפיא את המוח על הבמה cryotome.
- הכן 40 מיקרומטר סעיפים אופקיים מכל forebrains באמצעות cryotome מתאים.
- ניתן לאחסן את השקופיות בפתרון cryoprotectant (M 0.1 חיץ פוספט, גליצרול 50%, 0.14% MgCl 2, סוכרוז 8.6%) ב -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
6. אימונוהיסטוכימיה של חלקים במוח של בעלי חיים Nonperfused
- פוסט לתקן את cryosections, שהוכן כפי שתואר לעיל, תוך שימוש במתנול קר -20 ° C עבור 10 דקות.
- לחסום עם 5% בסרום נורמלי המכיל 0.3% Triton-X (מהמינים ששימשו לגיוס הנוגדנים משני) לילה בשעה 4 ° C.
- יש לשטוף 3x עם 1x PBS ו דגירה עם נוגדנים ראשוניים הלילה בשעה 4 ° C.
- יש לשטוף 3x עם 1x PBS ו דגירה עם נוגדנים משני בטמפרטורת חדר במשך שעה אחת.
- יש לשטוף 3x עם 1x PBS
- Counterstain הקטע עבור ה-DNA באמצעות ירוק Sytox, או DAPI (או לצבוע DNA אלטרנטיבי).
- יש לשטוף 3x עם 1x PBS
- להטביע את החלקים במדיום מימיים הטבעה.
- בואו מדיום הטבעת פלמר לפחות 48 שעות.
7. אימונוהיסטוכימיה של חלקים במוח של בעלי חיים perfused
- בלוק כמתואר בשלב 6.2 ולאחר מכן דגירה הסעיפים הקבועים במוח בפתרון נוגדן ראשוני המדוללים PBS המכילים 0.3% Triton-X (חופשי צף) הלילה ב 4 ° C.
- יש לשטוף שלוש פעמים עם 1x PBS ו דגירה בפתרון נוגדנים משני המדולל PBS המכיל 0.3% Triton-X (חופשי משתנה) בטמפרטורת חדר למשך 3 שעות.
- יש לשטוף 3x עם 1x PBS
- Counterstain הקטע עבור ה-DNA באמצעות Sytox ירוק או DAPI (או לצבוע DNA אלטרנטיבי).
- יש לשטוף שלוש פעמים עם 1x PBS
- להטביע את החלקים במדיום מימיים הטבעה.
- בואו מדיום הטבעת פלמר עבור48 שעות לא המעט.
8. חקירה של תחזיות טחבי סיבים
- להקריב בעלי החיים, להכין 40 מיקרומטר סעיפי העטרה כפי שתואר לעיל ולהכתים את הסעיף בהיפוקמפוס באמצעות נוגדן לneurofilament מ '
- סרוק את הקטעים באורך הגל המתאים באמצעות מיקרוסקופ לייזר confocal סריקה לדמיין סיבי אזובי וגרעינים. התחל את הסריקה בהגדלה נמוכה.
- השתמש בתמונות בהגדלה הנמוכה להתמצאות ולמקד את ההיפוקמפוס עם תחזיות אזובי סיבים.
- סרוק את הסעיפים (Z-חתך) ברזולוציה גבוהה והגדלה גבוהה.
- נתח את המראה ואת קישוריות מורפולוגיות של סיבי אזובי דמיינו באמצעות צביעה לNF-M.
- (אופציונלי) נתח את הגודל ונפח של להבים בהיפוקמפוס. השתמש באות ה-DNA למדידות.
9. Fluoro-Jade C Assay (מות תאים עצבי)
- להקריב בעלי החיים, לנתח את hippocampus, ולהכין 12 מיקרומטר סעיפים כפי שתואר לעיל.
- בואו הסעיפים להתייבש במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר.
- לתקן את הסעיפים בPFA 4% ל40 דקות בטמפרטורת חדר.
- בקצרה לשטוף את החלקים 3X עם DDH 2 O.
- דגירה החלקים עם 0.06% permanganate אשלגן (4 KMnO) עבור 10 דקות תחת טלטול מתמשך, עדין.
- שטפו את החלקים 3x עם DDH 2 O.
- דגירה החלקים עם 0.002% פתרון C Fluoro-Jade עבור 20 דקות בטמפרטורת חדר.
- לstainings הגרעיני בו זמנית, פתרון 0.002% Fluoro-Jade C יכול להיות בתוספת (אופציונלי) עם 10 DAPI מיקרוגרם / מיליליטר.
- בקצרה לשטוף את החלקים 3X עם DDH 2 O.
- בואו הסעיפים להתייבש במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר.
- דגירה החלקים עם קסילן (1 דקות)
- הר את החלקים באמצעות מדיום המבוסס על קסילן הרכבה (DPX).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הכלאות של IκB / - קווי העכבר מהונדסים וTTA מובילה לעיכוב מותנה של פעילות NF-κB בהיפוקמפוס.
כדי לחקור את הביטוי של IκBα--1AA-transgene בעכבר (איור 1 א) המהונדס הכפול, המוח היו מבודד, cryosectioned ומוכתם באמצעות נוגדן כנגד GFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק). מיקרוסקופ לייזר confocal הסריקה התגלה ביטוי גבוה של transgene באזורי CA1 וCA3, ובDG (איור 1).
IκBα--1AA-transgene בא לידי ביטוי באבות הטיפוס-2b, והיא פעילה במדינות לא מפותחות ביניים ובתאי גרגיר בוגרים.
כדי לקבוע את סוג התא המוקדם ביותר המבטא את IκBα--1AA מונע CAMKIIα באזור העצבי בהיפוקמפוס, cryosections של hippocampi מבעלי החיים IκB / TTA הוכתמו לdoublecortin(DCX) וtransgene (GFP). ניתוח confocal חשף ה-GFP-אותות בתאי גרגיר DCX החיוביים צעירים, המצביע על אינדוקציה של הביטוי של transgene ידי CAMKIIα פעילות (איור 2, חיצים).
עיכוב העצבי NF-κB באמצעות IκBα--1AA מפחית תחזיות אזובי סיבים, ואת העובי ונפח של DG.
סעיפי העטרה של ההיפוקמפוס של IκB / TTA וIκB / - עכברים היו מוכתמים עבור neurofilament M (NF-M) כדי לחזות תחזיות סיבי אזובי, ולחשוף את הארגון מורכב וfascicular (איור 3). בעכברי IκB / TTA, תחזיות אזובי סיבים שנפגעו באופן קשה. בנוסף, עיכוב NF-κB הוביל לעובי מופחת באופן משמעותי suprapyramidal להב וקטן DG נפח (איור 3 ב).
עיכוב עצבי של NF-κB בעכברי IκB / TTA מוביל לdegen העצבי גבוהeration, גדל נוירוגנזה, ונדידה מופרעת של אבות DCX-להביע.
כדי לחקור את הסיבות האפשריות לפגמים המבניים הדרמטיים, טריים, פרוסות בהיפוקמפוס מבולבל מעכברי IκB / TTA הוכתמו Fluoro-Jade C, המאפשר זיהוי הספציפי של מוות של תאים עצביים (איור 4 א). כאן, מספר עלה באופן דרמטי של neurites המתנוונת נצפו בבעלי חיים מהונדסים כפולים, בהשוואה לבקרה מהונדס אחת. יתר על כן, עלייה משמעותית של תאים אפופטוטיים caspase-3-חיובי ביקע זוהתה בעכברי IκB / TTA. לעומת זאת, מכתים immunohistochemical נגד DCX חשף באופן משמעותי כמויות גדולות יותר של DCX + תאים במוחם של עכברי IκB / TTA. יתר על כן, DCX תאים + בIκB / TTA-hippocampi לא היו מסודרים באופן בלעדי באזור subgranular, אך נמצאו גם באזורים העמוקים יותר של DG (איור 4), ואילו DCX + אבותייn חיות הבקרה היו נקודתיים כמעט אך ורק בתוך אזור subgranular. כדי לבדוק אם הכמות המוגברת של תאי DCX-להביע היא תוצאה של התבגרות של אבות מוקדם יותר, או באופן ישיר בשל התפשטות של DCX + תאים, BrdU הוזרק להיפוקמפוס של עכברי IκB / TTA ובקרה, אשר לאחר מכן היו cryosectioned ומוכתם בDCX וBrdU (איור 4). לניתוח של התפשטות, BrdU הוזרק פעם אחת (ראה איור 4 ב ', תכנית), ואחריו ניתוח לאחר 24 שעות. לניתוח של בידול, שלוש זריקות בוצעו יומי, ואחריו ניתוח לאחר שבעה ימים. לאחר BrdU-זריקה אחת, לא נמצא הבדלים משמעותיים במספר הכולל של תאי BrdU חיוביים בין IκB/tTA- ובעלי החיים שליטה נצפו, ואילו שלוש סידורי זריקות-הגישה חשפה כמות מוגברת באופן ברור של BrdU / DCX + תאים בDG של עכברי IκB / TTA. זה מצביע על כך בידול או שילוב של DCX לשעבר מופרעיםתאי לחיצה גרמו אולי מספרים מוגברים של DCX + תאים, ומצביעים על כך שסוג 3 תאים היו מעורבים.
עיכוב עצבי של תוצאות NF-κB בליקויי למידה חמורים, כפי שעולה מבדיקת הפרדה-בארנס מבוך התבנית מרחבית. במיוחד כדי לבחון את התנהגותם של העכברים הטרנסגניים כפולים במשימת DG תלויה, השתמשנו בSPS-BM, לפיה בעלי חיים צריך לבדל את מקומות עם הבדלים דקים (איור 5) שביניהם. במבחן התנהגות זו, / IκB - חיות הבקרה בחנו את בתי האוכל באופן סדרתי ביום הראשון של הניסוי (איור 5). לאחר שבעה ימים של אימונים, החיות הצליחו למצוא בית האוכל הפתוח באופן ישיר. לעומת זאת, בעלי החיים IκB / TTA המשיכו לחקור את בתי האוכל סדרתי, גם לאחר האימון (איור 5). התצפית של עליות משמעותיות במרחקים המכוסים, ושיהוי ואה גבוהים יותרשיעורי ROR בבעלי החיים IκB / TTA, לעומת / IκB - החיות השליטה, מצביעים על כך שהיו לי בעלי החיים אלה פגמים חמורים למידה (איור 5 ג).
איור 1. דור של עיכוב מוח קדמי ספציפי מותנה של פעילות NF-κB. ציור א סכמטי של המודלים מהונדסים המשמשים ללימוד התפקיד של NF-κB בneurogenesis בהיפוקמפוס המבוגר. סידן calmodulin תלוי קינאז IIα (CAMKIIα) transactivator טטרציקלין מונע אמרגן עכברים (TTA) שימשו כדי לווסת את הביטוי של מוטציה שלילית טרנס דומיננטי IκBa (סופר מדכא IκBa--1AA בעכברי IκB) בשילוב עם חלבון פלואורסצנטי ירוק נותב (GFP). בעכברי IκB / TTA, NF-κB נשמר בציטופלסמה בSTA פעיל שלהte ידי IκBa--1AA nondegradable, שניתן לאתר באמצעות ה-GFP-פלואורסצנטי. העיכוב יכול להיות הפוך על ידי דוקסיציקלין, אשר מעכב TTA. ביטוי transgene ב נציג באזורים בהיפוקמפוס שונה של עכברי IκB / TTA (CA1, CA3 וDG). Cryosections הוכן ממוח המבודד של IκB / - עכברים וIκB / TTA, וקובע ונצבע באמצעות נוגדן נגד ה-GFP. שים לב שtransgene מתבטא מאוד בתוך DG. De: דנדריטים, DG: המשונן gyrus, ML: שכבה מולקולרית; SL: מחזירת אור שכבה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. progenit transgene IκBa--1AA בא לידי הביטוי בDCX חיובי, הסוג-2b ORS ופעיל במדינות ביניים נוספות ובתאי גרגיר בוגרים. hippocampi א Cryosectioned של בעלי חיים IκB / TTA עם doublecortin (DCX) מכתים וביטוי של GFP לחשוף ביטוי של transgene בתאים צעירים DCX חיובי גרגיר (חיצים). DG: המשונן gyrus, ML: שכבה מולקולרית ציור ב סכמטי של ביטוי transgene בשלבי התפתחות שונים במהלך פיתוח גרעין תא.. IκBa--1AA-transgene ביטוי זוהה ב, אבות הטיפוס-2b DCX החיוביים, כל המדינות בשלה ביניים ובתאי גרגיר בוגרים. לעומת זאת, אבות מסוג 1 וסוג 2 א המוקדמים (חסרי DCX-ביטוי) לא הביעו את transgene, ולכן לא הושפעו מעיכוב NF-κB. השתנה לאחר Kempermann et al. 20 לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. עיכוב NF-κB מוביל לתחזיות אזובי סיבים פגומות ולעובי DG מופחת ונפח בעכברי IκB / TTA, לעומת שליטה מהונדס יחידה (IκB / -). א Immunostaining של hippocampi cryosectioned עבור M neurofilament (NF-M) כדי לחזות תחזיות סיבי אזובי. בעכברי ביקורת (IκB / -), ארגון מורכב וfascicular של סיבי אזובי חיבור תאי גרגיר לתאי המטרה שלהם בCA3 הוא מאליו, שנפגע לאחר עיכוב עצבי של NF-κB בעכברי IκB / TTA. יתר על כן, ביטוי של הסופר המדכא הוביל לעובי מופחת באופן משמעותי suprapyramidal להב (השווה חץ בפנל ימני ושמאלי) ופחת DG נפח. ב כימות וניתוח סטטיסטי של פגמים מבניים הנובעים מעיכוב NF-κB. מבחן t מזווג, שני זנב. הנתונים נלקחו מOA-הגרסה של Imielski et al. 2 לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 4. עיכוב של NF-κB בעכברי IκB / TTA מוביל למוות עצבי מוגבר תא, נוירוגנזה משופרת, ודפוס נדידה מופרע של תאי DCX-להביע. מכתים Fluoro-Jade C א Neuron ספציפי ומספרים מוגברים של תאי caspase-3-חיובי ביקע בסעיפים בהיפוקמפוס מגלה רמה גבוהה יותר של מוות של תאים עצביים בעכברי IκB / TTA מאשר בIκB / - הפקדים. neurites מתנוונת מסומנות על ידי חצים, וגרעינים מסומנים בכוכביות. אתר ימני: כימות של caspase-3-PO ביקעתאי sitive בתוך hippocampi מציע גדלו מאוד אפופטוזיס בבעלי חיים מהונדסים כפולים. ב 'הכתמה של cryosections היפוקמפוס לDCX מגלה מספר גדל של תאי DCX-לבטא בבעלי החיים מהונדסים כפולים. שים לב שDCX תאים + בIκB / TTA-hippocampi אינם מסודרים באופן בלעדי באזור subgranular, אבל הגרו עמוק יותר לתוך DG מאשר בIκB / -. שליטת ג עזבתי את הפנל: כדי לבדוק את ההשפעה של transgene על התפשטות, BrdU-זריקה אחת בוצעה, אשר הביאה לא נמצאה הבדלים משמעותיים במספר תאי BrdU החיוביים בין IκB / TTA ובקרות פנל ימני:. הערכה סטטיסטי חשפה משמעותית להגדיל בתאי DCX-לבטא בחיות IκB / TTA לאחר שלוש BrdU-זריקות יומיות. הניתוח בוצע שבעה ימים לאחר ההזרקה האחרונה (מבחן של גזירה ואינטגרציה). גידול משמעותי בBrdU / DCX + זוהה ב DG שליעכברי κB / TTA (n = 3). נתונים שנלקחו באופן חלקי מOA-הגרסה של Imielski et al. 2 לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 5. ההגדרה ותוצאות אופייניות למבוך דפוס המרחבי הפרדת בארנס (SPS-BM). א 'משמאל: ציור סכמטי של הגדרת הניסוי. שבעה בתי אוכל זהים (אותו צבע, גודל וצורה) הונחו באופן סימטרי בנקודות מוגדרות של צלחת הבנויה מפלסטיק אינרטי הקשיח (קוטר של 120 סנטימטר) עגולה, תוצרת בית, עם נקודה אחת חינם (נקודת פתיחה, S). רמזים נוסף, מבוך צבעוני (EMC) מצורפים מול בד לבן בצבע בעמדות לעין בקלות לבעלי החיים, כ 100 סנטימטר מבסדר הצלחת. כדי להימנע מנטייה ידי ריח, כדורי מזון מופקדים בכל בית, אבל רק בית אחד מזון נגיש (סגירה מנייר שקוף). מימין: מצלמת וידאו התמקדה בצלחת (מרחק לצלחת: 115 סנטימטר), ותצלום של ההגדרה כוללים רמזים נוסף מבוך התוצאה ניסיונית אופיינית ב 'של מבחן SPS-BM.. IκB / - בעלי החיים השליטה בוחן את בתי האוכל באופן סדרתי ביום הראשון של סדרת הבדיקה, ובית האוכל הפתוח נמצא מייד לאחר שבעה ימים של אימונים. לעומת זאת, עכברי IκB / TTA לחשוף למידה עניות יותר, כפי שהודגם על ידי חקר סידורי גם לאחר שלב הכשרת ג השוואה של פרמטרים שנמדדו בSPS-BM בIκB / -. בעלי החיים וIκB / TTA. עכברים הטרנסגניים זוגי להראות גירעונות משמעותיים זיכרון (n = 9), בהשוואה לקבוצת ביקורת (n = 8) ביחס להשהיה, כיסה את המרחק ואת קצב שגיאה. הערכת אנובה דו כיוונית; ברים שגיאה: SEM. הנתונים בB וC נלקחו מOA-הגרסה של Imielski et al. 2 לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
neurogenesis למבוגרים, ואת האפשרות של המניפולציה שלה באמצעות עיכוב של NF-κB בתאי עצב, ומאוחר יותר מחדש שלה באמצעות דוקסיציקלין, מציע מערכת מרתקת לחקירות לנוירונים יילוד במוח הבוגר, כמו גם לדה ודור מחדש עצבי . היופי של השיטה הזו הוא שעיכוב מסלול איתות NF-κB בנוירונים תוצאות לא רק בשינויים במוות עצבי תא, התפשטות אב והגירה, ושינויים מבניים ואנטומיים חמורים, אלא גם בליקויי למידה ברורים. חשוב לציין, את הפנוטיפ של בעלי החיים IκB / TTA יכול להיות הפוך באופן ניסיוני והציל לאחר מתן doxycyclin. חזרה זו של הפנוטיפ כולל היבטים מבניים, והוא יכול גם להוביל לשיפור משמעותי בDG תלוי למידת 2.
כדי להבטיח תוצאה לפרש לניסויים התנהגותיים, זה קריטי, כי רק בעלי חיים ממין זכר עם differe גיללשמש NCE של פחות מארבעה ימים. יתר על כן, כל סדרת הבדיקה צריכה להתבצע על ידי אותו מפעיל. בכל קשור לחדר הבדיקות, אנו ממליצים בחום לבצע את הבדיקה בסביבת אקוסטית מבודדת, כדי למנוע לחץ ואובדן של תשומת לב וכתוצאה ממקורות רעש חיצוניים. כדי למנוע נטייה המבוססת על זיהוי ריח במקום רמזים נוסף, מבוך, בתי האוכל הסגורים לא צריכים להיות נגישים לבעלי החיים, וזרימת אוויר והריח נורמלית צריכה להיות מותרת. בנוסף, הצלחת המשמשת לבדיקה צריכה להיות בנויה מחומר ריח ניטראלי וחומרי ניקוי עמיד, ויש לנקות בזהירות בין ניסויים. מקור פוטנציאלי נוסף של וריאציה ניסיונית הוא תאורת חדר. מקור האור צריך להיות בהיר מספיק כדי לאפשר רכישת תמונה, הכרה ברמזים נוסף, המבוך, וכדי לגרום לטיסת התנהגות, אבל לא צריך להיות בעצמה כדי לסנוור בעלי החיים. יתר על כן, אנו ממליצים לבצע את הבדיקות לכל חיה באותו הזמןשל יום, כדי למנוע וריאציות היממה.
יש מאסכאלאס יכולת ראייה טובה למדי שהוא, בתנאים טבעיים, בין השאר משמש לאיתור גבולות טריטוריאליים בתכונות מרשימות מבחינה ויזואלית (רמזים חזותיים כמו עצים) (Latham et al., Appl. בעלי החיים התנהגויות. Sci. 86 (3-4 ), 261-289 2004). בניסוי קלאסי Balkema et al. (J. Neurophysiol. 48 (4), 968-980 1982) ממוקם +6, 0, ו-7 עדשות diopter מול עיניים של עכבר ולא הבחינו בשינויים משמעותיים בגדלים שדה פתוחים בתא הגנגליון ברשתית. בשל העומק העצום הזה של גירויי שדה ראייה (למשל רמזים במיוחד מבוך) יכול להיות ממוקם על פני טווח גדול של מרחקים מול עכברים ולהישאר בפוקוס. בגישה שלנו, המרחק של רמזים נוסף מבוך מנקודת ההתחלה היה 30 סנטימטר מהגבול של הצלחת, שהוא על פי הספרות (למשל 140 סנטימטר ברוחבאונג et al., גני מוח התנהגויות. 5 (5), 389-403 2006)
יש לי מכרסמים הנטייה להישאר קרוב לקירות שדה פתוח. התנהגות זו מוגדרת כthigmotaxis (ברנט, SH, החולדה: מחקר בהתנהגות, הוצאה לאור Aldline, שיקגו, עמ '31-32, 1963). מחקר שנערך לאחרונה על ידי O `Leary et al. (Behav. המוח Res. 216 (2), 531-542 2011) הראה כי עכברי C57BL/6J הראו למידה טובה יותר במבוך בארנס לעומת 12 זני עכברים אחרים. 28% מהעכברים שנבדקו בשימוש חיפוש מרחבית, ואילו 64% השתמשו באסטרטגיה סידורי-thigmotactic. הנתונים אלה נכונים גם לגבי מבוך קטן בקוטר של סנטימטר 69 עם 15 סנטימטר מקיר שמסביב. עם זאת, עכברים שנבדקו במבוך גדול ללא קירות או intramaze רמזים, כמו ההתקנה שלנו (בקוטר של 120 מיקרומטר) יש באופן מהימן הראתה ראיות לשימוש ברמזים חזותיים בעיקר מחוץ למבוך (ראה לדוגמא באך et al., תא. 81 כגון: שנגרמו על ידי הבדלי מיקרו, הצלחת הייתה מסובבת אחרי כל ניסוי.
מבחן התנהגותי ניתן להתאים פשוט לחקירת ההשפעה של גורמי שעתוק אחרים בneurogenesis בהיפוקמפוס המבוגר, באמצעות מודלים עכבר מתאימים. עם זאת, הוא נועד בעיקר כדי לבחון את מידת DG תלויה (הפרדת דפוס מרחבית), ולא יכול להיות מתאים לחקירת נוירוגנזה או ניוון עצבי באזורי מוח אחרים. מבחינה זו, השימוש בSPS-BM הוא מוגבל עוד יותר על ידי DG-ספציפי שלו (תלות קפדנית על מעגל פונקציונלי בין EC השני וDG וCA3 וCA1 ו-EC VI), ולכן עליו לא תחול על חקירת משימות שכוללות EC III monosynaptic - CA1 - EC V - במעגל.
יישומים עתידיים של השיטות שתוארו במסמך זה עשויים לכלול חוקרים את ההשפעות של השתלות תאי גזע, pharmaceuטיפולי tical על neurogenesis למבוגרים בהיפוקמפוס, והומאוסטזיס רקמה בתוך ההיפוקמפוס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם ניגוד אינטרסים.
Acknowledgments
אנו מודים לאנג'לה Kralemann-קוהלר לתמיכה טכנית מצוינת. עבודה ניסויית שתוארה במסמך זה בוצעה במעבדה שלנו ונתמך על ידי מענקים של מועצת המחקר הגרמנית (DFG) לCK וBK ומענק של המשרד הגרמני למחקר וחינוך (BMBF) לBK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Moria MC17 Perforated Spoon | FST | 10370-18 | removal of the brains |
| Dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi SV8 | removal of the brains |
| Surgical scissors | FST | 14084-08 | removal of the brains |
| Surgical scissors | FST | 14381-43 | removal of the brains |
| Dumont #5 forceps | FST | 11254-20 | removal of the brains |
| SuperFrost Slides | Carl Roth | 1879 | slides for immunohistochemistry |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | fixative |
| TissueTek OCT compound | Sakura Finetek | 1004200018 | embedding of the brains |
| Normal Goat Serum | Jackson Immunolabs | 005-000-001 | blocking in IHC |
| Normal Rabbit Serum | Jackson Immunolabs | 011-000-001 | blocking in IHC |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immunolabs | 017-000-001 | blocking in IHC |
| anti-Neurofilament-M antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 2H3 | IHC, Dilution 1:200 |
| anti-Doublecortin antibody | sc-8066 | Santa Cruz | IHC, Dilution 1:800 |
| anti-GFP antibody | Abcam | ab290 | IHC, Dilution 1:2,000 |
| anti-BrdU antibody | OBT0030G | Accurate Chemicals | IHC, Dilution 1:2,000 |
| Fluoro-Jade C | FJ-C | HistoChem | Determination of neuronal cell death |
| Betadine | Mundipharma | D08AG02 | disinfectant |
| Cryomicrotome | Leica | CM1900 | preparation of brain slices |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393 | perfusion |
| Circular plate made from hard-plastic (diameter 120 cm) | lab made | none | plate for SPS-BM, diameter 120 cm |
| Buraton rapid disinfectant | Schülke Mayr | 113 911 | disinfectant |
| Video-tracking system TSE VideoMot 2 with Software Package VideoMot2 | TSE Systems | 302050-SW-KIT | tracking and analysis of SPS-BM |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | permeabilization/IHC |
| Cryotome | Reichert Jung/Leica | Frigomobil 1206 | preparation of 40 µm brain slices |
| Mowiol 4-88 | Carl Roth | Art.-Nr. 0713 | embedding of the slides |
| SYTOX green | Invitrogen | S7020 | Nuclear staining |
| Food pellets (Kellog`s Froot Loops) | Kellog`s | SPS-BM | |
| Prism, Version 3.0 | Graph Pad Software, San Diego, USA | Statistical evaluation of SPS-BM | |
| Zen 2008 or Zen 2011 Software | Carl Zeiss | Software (Confocal microscope) | |
| D.P.X | Sigma-Aldrich | 317616 | mounting medium for Fluoro-Jade C staining |
References
- Gutierrez, H., Davies, A. M. Regulation of neural process growth, elaboration and structural plasticity by NF-kappaB. Trends Neurosci. 34, 316-325 (2011).
- Imielski, Y., et al. Regrowing the adult brain: NF-kappaB controls functional circuit formation and tissue homeostasis in the dentate gyrus. PLoS One. 7, (2012).
- Zheng, M., et al. Intrahippocampal injection of A beta(1-42) inhibits neurogenesis and down-regulates IFN-gamma and NF-kappaB expression in hippocampus of adult mouse brain. Amyloid. 20 (1-42), 13-20 (2013).
- Denis-Donini, S., et al. Impaired adult neurogenesis associated with short-term memory defects in NF-kappaB p50-deficient mice. J. Neurosci. 28, 3911-3919 (2008).
- Bracchi-Ricard, V., et al. Astroglial nuclear factor-kappaB regulates learning and memory and synaptic plasticity in female mice. J, Neurochem. 104, 611-623 (2008).
- Koo, J. W., Russo, S. J., Ferguson, D., Nestler, E. J., Duman, R. S. Nuclear factor-kappaB is a critical mediator of stress-impaired neurogenesis and depressive behavior. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 2669-2674 (2010).
- Fridmacher, V., et al. Forebrain-specific neuronal inhibition of nuclear factor-kappaB activity leads to loss of neuroprotection. J. Neurosci. 23, 9403-9408 (2003).
- Whiteside, S. T., et al. C-terminal sequences control degradation of MAD3/I kappa B alpha in response to inducers of NF-kappa. B activity. Mol. Cell. Biol. 15, 5339-5345 (1995).
- Mayford, M., et al. Control of memory formation through regulated expression of a CaMKII transgene. Science. 274, 1678-1683 (1996).
- Rosenfeld, M. E., Prichard, L., Shiojiri, N., Fausto, N. Prevention of hepatic apoptosis and embryonic lethality in RelA/TNFR-1 double knockout mice. Am. J. Pathol. 156, 997-1007 (2000).
- Morris, R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J Neurosci. Methods. 11, 47-60 (1984).
- Barnes, C. A. Memory deficits associated with senescence: a neurophysiological and behavioral study in the rat. J. Compar. Physiol. Psychol. 93, 74-104 (1979).
- Brun, V. H., et al. Place cells and place recognition maintained by direct entorhinal-hippocampal circuitry. Science. 296, 2243-2246 (2002).
- Meshi, D., et al. Hippocampal neurogenesis is not required for behavioral effects of environmental enrichment. Nat. Neurosci. 9, 729-731 (2006).
- Bakker, A., Kirwan, C. B., Miller, M., Stark, C. E. Pattern separation in the human hippocampal CA3 and dentate gyrus. Science. 319, 1640-1642 (2008).
- Dupret, D., et al. Spatial relational memory requires hippocampal adult neurogenesis. PLoS One. 3, (2008).
- Leutgeb, J. K., Leutgeb, S., Moser, M. B., Moser, E. I. Pattern separation in the dentate gyrus and CA3 of the hippocampus. Science. 315. , 961-966 (2007).
- Kaltschmidt, B., et al. NF-kappaB regulates spatial memory formation and synaptic plasticity through protein kinase A/CREB signaling. Mol. Cell. Biol. 26, 2936-2946 (2006).
- Clelland, C. D., et al. A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation. Science. 325, 210-213 (2009).
- Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).
