Los métodos para la modulación y Análisis de NF-KB dependiente de la neurogénesis adulta

Summary

Se describen métodos para la manipulación y análisis de NF-kappa B dependiente de neurogénesis en el hipocampo adulto. Un protocolo detallado se presenta para una prueba de comportamiento circunvolución dentada-dependiente (denominado el patrón espacial de separación-Barnes laberinto) para la investigación de resultado cognitivo en ratones. Esta técnica también debería ayudar a permitir investigaciones en otros parámetros experimentales.

Abstract

El hipocampo desempeña un papel fundamental en la formación y consolidación de los recuerdos episódicos, y en la orientación espacial. Históricamente, el hipocampo adulto ha sido vista como una región anatómica muy estática del cerebro de los mamíferos. Sin embargo, hallazgos recientes han demostrado que el giro dentado del hipocampo es un área de enorme plasticidad en los adultos, con la participación no sólo de las modificaciones de los circuitos neuronales existentes, sino también la neurogénesis adulta. Esta plasticidad está regulada por redes de transcripción complejas, en la que el factor de transcripción NF-kB desempeña un papel prominente. Para estudiar y manipular la neurogénesis adulta, un modelo de ratón transgénico para la inhibición neuronal del cerebro anterior-específica de la actividad de NF-kappa B puede ser utilizado.

En este estudio, se describen métodos para el análisis de la neurogénesis NF-KB dependiente, incluyendo sus aspectos estructurales, la apoptosis neuronal y la proliferación de células progenitoras, y la significación cognitiva, which se evaluó específicamente a través de un giro dentado (DG) dependiente de la prueba de comportamiento, el patrón espacial de separación-Barnes laberinto (SPS-BM). El protocolo de MSF-BM podría ser simplemente adaptado para su uso con otros modelos de animales transgénicos diseñados para evaluar la influencia de los genes particulares en la neurogénesis del hipocampo adulto. Además, MSF-BM podría ser utilizado en otros entornos experimentales destinados a investigar y la manipulación de aprendizaje DG-dependiente, por ejemplo, el uso de agentes farmacológicos.

Introduction

Ontológicamente, el hipocampo es una de las estructuras cerebrales anatómicas más antiguos conocidos. Es responsable de diversas tareas complejas, como las funciones clave en la regulación de la memoria a largo plazo, la orientación espacial y la formación y consolidación de la memoria respectiva. Anatómicamente, el hipocampo consiste en capas de células piramidales (estrato piramidal), incluyendo el cuerno de Ammonis (CA1, CA2, CA3, CA4 y) regiones y la circunvolución dentada (dentatus circunvolución), que contiene las células granulares y unos progenitores neuronales dentro de su zona subgranular . Las células granulares proyectan hacia la región CA3 a través de los llamados fibras musgosas (axones de las células granulares).

Hasta finales del siglo pasado, el cerebro de los mamíferos adultos se cree que es un órgano estático que carecen de plasticidad celular y la neurogénesis. Sin embargo, durante las últimas dos décadas, una cantidad creciente de evidencia demuestra claramente la neurogénesis adulta que tiene lugar en al menosdos regiones del cerebro, la zona subventricular (SVZ) y la zona subgranular del hipocampo.

Nuestros estudios previos y los de otros grupos, han demostrado que el factor de transcripción NF-kB es uno de los reguladores moleculares cruciales de la neurogénesis adulta, y que sus resultados de-regulación en los defectos del hipocampo estructurales graves y alteraciones cognitivas ^1-6. NF-kappa B es el nombre genérico de un factor de transcripción inducible por compuesto de diferentes combinaciones diméricas de cinco subunidades de unión al ADN: p50, p52, c-Rel, RelB, y p65 (de RelA), los tres últimos de los cuales tienen dominios de transactivación. Dentro del cerebro, la forma más abundante encontrada en el citoplasma es un heterodímero de p50 y p65, que se mantiene en una forma inactiva por el inhibidor de kappa B (IkB)-proteínas.

Para estudiar y manipular directamente la neurogénesis impulsado por NF-kB, utilizamos modelos de ratones transgénicos para permitir simple inhibición de toda la subun NF-kBsu, específicamente en el cerebro anterior ⁷ (ver Figura 1). Con este fin, hemos mestizos, las siguientes líneas de ratones transgénicos, IkB / - y -/tTA. El transgénico IkB / - line se generó usando un mutante negativo trans-dominante de NF-kB-inhibidor IκBa (super-represor IκBa-AA1) ^8. En contraste con la de tipo salvaje IκBα, IκBα-AA1 tiene dos residuos de serina mutado a alaninas (V32 y V36), que impiden la fosforilación y la degradación proteasómica subsiguiente del inhibidor. Para prosencéfalo neuronal específica la expresión de la IκBa-AA1-transgén, IkB / - ratones fueron cruzadas criados con ratones que albergan una quinasa de calcio-calmodulina dependiente IIα (CAMKIIα)-promotor que puede ser accionado por tetraciclina trans-activador (TTA) ^9.

p65 ratones knock-out tienen un fenotipo letal embrionaria, debido a la apoptosis masiva del hígado ^10, por lo que el enfoque se muestra aquí ofrece un método elegantepara investigar el papel de NF-kappa B en posnatal y la neurogénesis adulta.

La prueba de comportamiento clásico para estudiar el aprendizaje espacial y la memoria se describe en la década de 1980 por Richard Morris, una prueba conocida como el laberinto de agua de Morris (MWM) ^11. En este campo abierto-laberinto de agua, los animales aprenden a escapar del agua opaca a una plataforma de búsqueda basado en la orientación y extra-laberinto señales. Una variante seco de MWM es el denominado laberinto de Barnes (BM) ^12. Esta prueba utiliza una placa circular con 20 orificios circulares dispuestos en el borde de un plato, con un agujero definido como una caja de escape, y visuales señales extra-laberinto de orientación. Ambos paradigmas experimentales se basan en el comportamiento de vuelo inducida por una aversión al roedor `s al agua, o espacios abiertos, bien iluminado. Ambas pruebas permiten una investigación de la orientación espacial, y el rendimiento de la memoria relacionados. Aunque el hipocampo desempeña un papel general y esencial en la formación de la memoria espacial, el hipocampo rEGIONES involucrados difieren dependiendo de la prueba aplicada. La memoria a prueba en BM surge de la actividad neuronal entre la corteza enthorinal (CE) y las neuronas piramidales ubicadas en el CA1-región del hipocampo sin una contribución de la DG ^13-16. En particular, el clásico BM se basa principalmente en la navegación a través de la vía temporo-amónico monosináptico de CE III de la CA1 a CE V. Es importante destacar que, la DG se crucial que participan en la llamada de reconocimiento de patrón espacial ^17, lo que implica no sólo el procesamiento de información visual y espacial, sino también la transformación de las representaciones o recuerdos similares en representaciones diferentes, que no se superponen. Esta tarea requiere un circuito tri-sináptica funcional de la CE a la DG II a CA3 a CA1 y EC VI, que no puede ser probado en el BM ^15.

Para hacer frente a estos desafíos, hemos ideado SPS-BM como una prueba de comportamiento para probar específicamente el rendimiento cognitivo gyrus dentado dependiente en coanimales ntrol, y en el modelo de super-represor IkB / TTA consecuencia de la inhibición de NF-kB. Es importante destacar que, en contraste con el MWM o el BM, la MSF-BM puede revelar anomalías de comportamiento sutiles resultantes de deterioro de la neurogénesis. Desde espacial-pattern-separación es estrictamente dependiente de un circuito funcional entre EC II y la DG y CA3 y CA1 y EC VI, esta prueba es muy sensible a los cambios potenciales en la neurogénesis, modificaciones de la vía de las fibras musgosas o alteraciones de la homeostasis del tejido dentro de la DG.

Técnicamente, la puesta a punto de nuestra prueba se basa en el estudio de Clelland et al., En la que el patrón de separación espacial fue probada usando una madera de 8 brazos brazo radial laberinto (RAM) ^19. En nuestra configuración modificada, los ocho brazos fueron sustituidos por siete casas de comida amarillas idénticas. En resumen, los métodos que se muestran aquí, incluyendo el análisis de las células que expresan doblecortina (DCX +) en el hipocampo, las proyecciones de fibras musgosas, neuronal de células death y particularmente el SPS-BM presenta aquí, se puede aplicar a las investigaciones de otros modelos de ratones que incorporan los transgenes que tienen un impacto en la neurogénesis adulta. Otras aplicaciones pueden incluir el estudio de los agentes farmacológicos y la medición de su impacto en la separación patrón DG y espacial.

Protocol

Declaración de Ética

Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las normas del comité uso cuidado de los animales y gubernamental, LANUV del estado Renania del Norte-Westfalia, (Düsseldorf, Alemania). Todos los experimentos con animales fueron aprobadas por LANUV, Düsseldorf bajo el número de licencia 8.87-51.04.20.09.317 (LANUV, NRW). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar la angustia y el número de animales necesarios para el estudio.

1. Cuidado de Animales y Vivienda

1. Todos los animales utilizados en los protocolos descritos en el presente documento deben mantenerse en condiciones libres de patógenos específicos, según la definición de la Asociación Federación Europea Laboratory Animal Science (FELASA).
2. Los ratones deben mantenerse en jaulas estándar en una habitación con temperatura y humedad controladas (22 ° C) en condiciones diurnas (12 horas de luz / oscuridad ciclo) con filtros HEPA el aire.
3. Alimento normalizado y el agua deben ser proporcionados ad libitum. </ Li>
4. Si / IkB / TTA y IkB - Se utilizan ratones de control, genotipificación basados ​​en PCR debe realizarse para cada animal, como se describe en ^{7, 18.}
5. Los machos con una diferencia de edad de menos de cuatro días deben de ser utilizados para reducir la variabilidad individual.
6. (Opcional): Para los experimentos de reactivación de NF-kB, doxiciclina debe administrarse en el agua potable (2 mg / ml con 2,5% de sacarosa) durante al menos 14 días.

2. Espacial del patrón de separación-Barnes Maze (SPS-BM)

1. Todas las pruebas de comportamiento debe ser llevada a cabo de acuerdo con las directrices internacionales y locales.
2. ¡IMPORTANTE! Utilice sólo los ratones machos con una edad de seis meses o más. La diferencia de edad entre los animales de una serie de pruebas debe ser inferior a cuatro días. La prueba debe ser realizada por el mismo operador para cada serie. Los ratones debe recibir una dieta estándar antes de la prueba para aumentar aún más la motivación parcialmente impulsado por comorecompensa de comida weet.
3. Configurar una placa circular blanco hecho de plástico duro (diámetro 120 cm, ver Figura 5 A) en una y humedad de la sala de temperatura controlada (22 º C), iluminada con un mínimo de 4 x 80 W y 3 x 215 W lámparas fluorescentes de neón . ¡IMPORTANTE! Asegurar que se utilice la iluminación correcta, ya que la motivación de los ratones para entrar en las casas de los alimentos es impulsada en parte por su aversión a, lugares expuestos brillantes.
4. Establezca el sistema de vídeo-seguimiento. La cámara debe ser colocado 115 cm por encima del centro de la placa (véase la Figura 5A).
5. Conecte las señales extra-laberinto multicolor (EMC) en un paño de color blanco en posiciones fácilmente visibles para los animales, unos 100 cm desde el borde de la placa (ver figura 5A).
6. Limpiar cuidadosamente la placa con un desinfectante rápida que puede eliminar cualquier olor del montaje experimental.
7. Coloque siete casas idénticas amarillas de alimentos (12 cm x 7 cm x 8 cm, ver Figura 5A Figura 5 A).
8. Coloque las recompensas de pellets de alimentos dulces (cuarto de una casa Froot Loop / comida `s Kellogs) dentro de todas las casas de comida en posiciones definidas (ver Figura 5 A) con sólo una casa de comida definido siendo de libre acceso para el animal (la ubicación F, véase la Figura 5A ). Cierre las casas de comida no-objetivo con papel transparente.
9. Antes de la prueba, realice la habituación (un día antes de comenzar la tarea). Haga todas las casas de comida de acceso libre y permiten a los ratones para explorar el laberinto libre y para recuperar una recompensa bolita de comida (10 min / animal).
10. Encienda el ordenador y la cámara y ejecutar el software de sistema de vídeo-seguimiento.
11. Inicie la grabación.
12. Colocar el animal en el punto inicial definido en la placa circular (Figura 5 A, S: Posición de inicio) y permiten a los ratones para buscar la casa de comida de destino durante 10 min.
13. Stop el video-seguimiento.
14. ¡IMPORTANTE! Limpie la placa circular y las casas de comida después de cada ensayo con desinfectante rápido.
15. Repita la prueba al día durante siete días consecutivos (por cada animal).
16. Analizar los resultados (latencia, la distancia recorrida y errores) utilizando el software de estadísticas adecuadas. Definir los errores como acercarse a la casa de comida equivocada y / o contacto con la caja apropiada sin entrar y recuperar la recompensa bolita de comida. Para el análisis agrupado utilizar dos vías ANOVA con test post-hoc de Bonferroni.
17. (OPCIONAL) Sacrificar los ratones y analizar los hipocampos como se describe a continuación.

3. Etiquetado BrdU

1. Inyectar por vía intraperitoneal 50 mg / kg de BrdU IP una vez al día durante 3 días (análisis de la diferenciación y la integración) o IP 200 mg / kg para una sola inyección (análisis de la proliferación).
2. Sacrificio de los animales, diseccionar el hipocampo y preparar 40 micras secciones como se describe a continuación.
3. Desnaturalizar lasecciones con 2 M de HCl durante 10 min y se incuba en tampón borato 0,1 M durante 10 min.
4. Etiquetar una serie de uno de cada doce de 40 micras secciones (240 micras de distancia) de cada animal mediante inmunohistoquímica, como se describe a continuación utilizando anticuerpos dirigidos contra BrdU.
5. Cuantificar las células marcadas por análisis de microscopía confocal en toda la extensión rostrocaudal de la capa de células granulares y zona subgranular. Multiplica los números resultantes por 12 para obtener el número total estimado de células BrdU marcado por el hipocampo y se dividen por dos para obtener el número total de células marcadas por la Dirección General.

4. La separación de los cerebros y Preparación de criosecciones de nonperfused Animales

1. Observe los procedimientos aprobados localmente para la eutanasia de animales. Los ratones pueden ser sacrificados directamente por dislocación cervical.
2. (OPCIONAL) Los animales pueden ser anestesiados antes de la eutanasia de acuerdo con las normas locales e internacionales, por ejemplo, por inje intraperitonealcción de 0,8 ml de Avertin para una 33 g de ratón (recién hecha mediante la mezcla de 150 ml de la solución hecha de 2,2 mg de 2,2,2-tribromoetanol en 1 ml de isoamilo etanol con 1,85 ml de solución salina o tampón fisiológico).
3. Esterilizar la cabeza con Betadine (10% de povidona yodada) empapado en gasas y esponja posteriormente con una gasa empapada en alcohol al 70%.
4. Decapitar al animal usando tijeras quirúrgicas adecuadas y tire de la piel a un lado.
5. (Opcional) Fijadores se pueden aplicar para evitar el repliegue de la piel retardado.
6. Haga una incisión en la línea media en el cráneo y tire con cuidado los fragmentos de cráneo de lado.
7. Retire con cuidado todo el cerebro usando un instrumento quirúrgico adecuado (por ejemplo Moria Spoon).
8. PreCool 25 ml de 2-metilbutano en un vaso de precipitados de 50 ml (por ejemplo, Schott Duran) a -30 a -40 º C en hielo seco.
   Nota: Para la tinción de libre flotación de las secciones "densas" que son ideales para la microscopía confocal de barrido láser, eliminar cerebro, lavar 3veces en tampón y se almacenan a 4 ° C en PBS solución de sacarosa al 30% en el tubo de 50 ml hasta el cerebro se ha hundido hasta el fondo (generalmente durante la noche).
9. Con cuidado, coloque el cerebro en un pedazo de Nescofilm (Parafilm) y cubrir con una amplia cantidad de compuesto TissueTek octubre, congelar en Nescofilm en 2-metil-butano, almacenar a -80 ° C hasta su uso.
   Nota: Para el almacenamiento de largo plazo a -20 ° C en la tienda 9% de sacarosa, 7 mM MgCl _2, tampón fosfato 50 mM, 44% de glicerol.
10. Cortar el cerebro en 10-12 micras de espesor secciones sobre criomicrotomo apropiado.
    Nota: Para las secciones gruesas, que flotan libremente, congelar el cerebro en cryotome etapa de cryotome apropiado (por ejemplo Reichert Jung, Frigomobil.) Y cortar 40 micras secciones horizontales a -20 ° a - 25 ° C. Recoger las secciones de cuchillo con pincel fino y recoger en tampón o mantenerse en la solución de almacenamiento (paso 4.9) a -20 º C para el almacenamiento de largo plazo.
11. Monte con cuidado dos rebanadas en portaobjetos individuales. El nose de diapositivas Superfrost UltraPlus es muy recomendable para maximizar la adhesión de las secciones.
12. Secar los portaobjetos durante 5 min a temperatura ambiente. Los portaobjetos se pueden almacenar a -80 ° C hasta su uso.

5. Preparación de las secciones de perfundido Animales

1. Se anestesia a los animales como se describió anteriormente (paso 4.2).
2. Perfundir con cuidado el animal transcardialmente con tampón fosfato salino (PBS) que contenía heparina (0,025 g/100 ml de PBS) y procaína (0,5 g/100 ml de PBS) durante 2-4 min, seguido de paraformaldehído al 4% en PBS durante 10-15 min . La perfusión se lleva a cabo de manera óptima por perfusión a través del ventrículo izquierdo y la apertura de la aurícula derecha usando una presión hidrostática de aproximadamente 1.2 a 1.4 m o utilizando una bomba peristáltica se establece en aproximadamente 15 ml / min. Resultados óptimos en una perfusión cerebral blanco pálido, sin vasos sanguíneos rojos siendo visible.
3. Diseccionar y posteriores a fijar los cerebros en paraformaldehído al 4% a 4 º C durante 24 horas.
4. Cryoproteger los cerebros en 30% de sacarosa en PBS a 4 ° C durante al menos 24 horas.
5. Congele los cerebros en el escenario cryotome.
6. Preparar 40 micras secciones horizontales de prosencéfalos enteras usando un criotomo apropiada.
7. Los portaobjetos se pueden almacenar en la solución crioprotectora (tampón de fosfato 0,1 M, 50% de glicerol, 0,14% de MgCl _2, 8,6% de sacarosa) a -20 ° C hasta su uso.

6. La inmunohistoquímica de secciones de cerebro de nonperfused Animales

1. Post-fijar las secciones criogénicas, preparados como se ha descrito anteriormente, usando -20 ° C metanol frío durante 10 min.
2. Se bloquea con 5% de suero normal que contiene 0,3% de Triton-X (de la especie que se utilizaron para elevar el anticuerpo secundario) durante la noche a 4 ° C.
3. Enjuague 3 veces con 1 × PBS y se incuban con anticuerpos primarios noche a 4 ° C.
4. Enjuagar 3 veces con 1 x PBS y se incuban con anticuerpos secundarios a temperatura ambiente durante una hora.
5. Enjuague 3 veces con PBS 1x
6. Counterstain la sección de ADN utilizando verde SYTOX o DAPI (o un tinte de ADN alternativo).
7. Enjuague 3 veces con PBS 1x
8. Incorporar las secciones en un medio acuoso incrustación.
9. Deje que el medio de inclusión polimeriza durante al menos 48 horas.

7. La inmunohistoquímica de secciones de cerebro de animales perfundidos

1. Bloquear tal como se describe en el paso 6.2 y posteriormente incubar las secciones de cerebro fijadas en solución de anticuerpo primario diluido en PBS que contenía 0,3% de Triton-X (de flotación libre) durante la noche a 4 ° C.
2. Enjuague tres veces con 1x PBS y se incuban en solución de anticuerpo secundario diluido en PBS que contenía 0,3% de Triton-X (de flotación libre) a temperatura ambiente durante 3 h.
3. Enjuague 3 veces con PBS 1x
4. Contrateñir la sección de ADN utilizando SYTOX verde o DAPI (o un tinte de ADN alternativo).
5. Enjuague tres veces con PBS 1x
6. Incorporar las secciones en un medio acuoso incrustación.
7. Deje que el medio de inclusión polimeriza para unt menos 48 horas.

8. Investigación de Proyecciones Mossy Fibra

1. Sacrificio de los animales, se preparan 40 micras secciones coronales como los descritos anteriormente y manchar la sección de hipocampo utilizando anticuerpos para neurofilamentos M.
2. Analiza las secciones en la longitud de onda apropiada usando un microscopio de barrido láser confocal para visualizar las fibras musgosas y núcleos. Inicie el escaneo a bajo aumento.
3. Utilice las imágenes de baja magnificación para la orientación y el objetivo del hipocampo con proyecciones de fibras musgosas.
4. Escanear las secciones (z-seccionamiento) en alta resolución y una gran ampliación.
5. Analizar el aspecto morfológico y la conectividad de las fibras musgosas visualizados mediante tinción de NF-M.
6. (OPCIONAL) analizar el tamaño y el volumen de las cuchillas del hipocampo. Utilice la señal de ADN para las mediciones.

9. Fluoro-Jade C Assay (Neuronal Cell Death)

1. Sacrificio de los animales, diseccionar el hippocampus, y preparar 12 micras secciones como se describe anteriormente.
2. Deje que las secciones se secan durante 30 minutos a temperatura ambiente.
3. Fijar las secciones en PFA al 4% durante 40 min a temperatura ambiente.
4. Lavan brevemente las secciones 3 veces con ddH ₂ O.
5. Incubar las secciones con permanganato de potasio 0,06% _(KMnO4) durante 10 min bajo continua, una agitación suave.
6. Lave las secciones 3 veces con ddH ₂ O.
7. Incubar las secciones con solución de C fluoro-Jade 0,002% durante 20 min a temperatura ambiente.
8. (OPCIONAL) Para tinciones nucleares simultáneas, solución 0,002% fluoro-Jade C se puede complementar con 10 mg / ml DAPI.
9. Lavan brevemente las secciones 3 veces con ddH ₂ O.
10. Deje que las secciones se secan durante 30 minutos a temperatura ambiente.
11. Incubar las secciones con xileno (1 min)
12. Montar las secciones usando un medio de montaje basado en Xileno (DPX).

Representative Results

El cruzamiento de las IkB / - líneas de ratones transgénicos y TTA conduce a la inhibición condicional de la actividad de NF-kappa B en el hipocampo.

Para investigar la expresión de la IκBα-AA1-transgén en el ratón transgénico doble (Figura 1A), se aislaron, cryosectioned y se tiñeron utilizando un anticuerpo frente a GFP (proteína verde fluorescente) cerebros. Microscopía confocal de barrido láser reveló una alta expresión del transgén en las regiones CA1 y CA3, y en la DG (Figura 1B).

El IκBα-AA1-transgén se expresa en progenitores de tipo 2b, y participa activamente en los estados inmaduros intermedios y en las células granulares maduras.
Para determinar el tipo de célula más temprana que expresa la IκBα-AA1-CAMKIIα impulsado en la región neurogénica del hipocampo, criosecciones de hipocampos de los animales IkB / tTA se tiñeron para doublecortin(DCX) y el transgén (GFP). Análisis confocal reveló GFP-señales en jóvenes células granulares DCX-positivos, lo que indica la inducción de la expresión del transgén por CAMKIIα-actividad (Figura 2, flechas).

Inhibición neuronal NF-kB vía IκBα-AA1 reduce proyecciones de fibras musgosas, y el espesor y el volumen de la DG.

Secciones coronales del hipocampo de IkB / TTA y IkB / - ratones fueron teñidas con neurofilamento M (NF-M) para visualizar las proyecciones de fibras musgosas, y revelan organización compleja y fascicular (Figura 3). En ratones IkB / TTA, las proyecciones de fibras musgosas se vieron gravemente perjudicadas. Además, la inhibición de NF-kB llevó a un espesor de la hoja suprapiramidal reducido significativamente y la DG un volumen más pequeño (Figura 3B).

Inhibición neuronal de NF-kB en ratones IkB / TTA conduce a la degeneración neuronal elevadación, el aumento de la neurogénesis, y una migración alterada de progenitores DCX-expresan.

Para estudiar las posibles razones para los defectos estructurales dramáticos, frescas, rebanadas de hipocampo de ratones no fijadas IkB / tTA se tiñeron con fluoro-Jade C, la cual permite la detección específica de la muerte celular neuronal (Figura 4A). En este caso, se observó un aumento de forma espectacular el número de neuritas en degeneración en los animales transgénicos dobles, en comparación con los controles transgénicas individuales. Por otra parte, se detectó un aumento significativo de las células apoptóticas caspasa-3-positivo escindidos en ratones IkB / tTA. Por el contrario, la tinción inmunohistoquímica contra DCX reveló significativamente mayores cantidades de células DCX + en el cerebro de ratones IkB / TTA. Por otra parte, + células DCX en IkB / TTA-hipocampo no fue organizado exclusivamente en la zona subgranular, pero también se encuentran en las regiones más profundas de la DG (Figura 4 B), mientras que los progenitores DCX +-in los animales de control se localizan casi exclusivamente dentro de la zona subgranular. Para probar si el aumento de la cantidad de células DCX-que expresan es un resultado de la maduración de progenitores anteriores o directamente debido a la proliferación de las células DCX +, BrdU se inyecta en los hipocampos de IkB / tTA y de control de los ratones, que luego fueron cryosectioned y se tiñó con DCX y BrdU (Figura 4). Para el análisis de la proliferación, BrdU se inyecta una vez (véase la figura 4B, el esquema), seguido de análisis después de 24 horas. Para el análisis de la diferenciación, tres inyecciones se llevaron a cabo todos los días, seguido por el análisis después de siete días. Después de una sola inyección de BrdU-, no se observaron diferencias significativas en el número total de células BrdU positivas entre IκB/tTA- y los animales de control, mientras que la serie de tres inyecciones-enfoque reveló claramente un aumento en la cantidad de células BrdU / DCX + en la DG de los ratones IkB / tTA. Esto indica que la diferenciación perturbado o integración de DCX-excélulas apremiantes pueden haber causado el aumento del número de células DCX +, y sugiere que el tipo-3 células fueron involucrados.

Inhibición neuronal de los resultados de NF-kB en los defectos de aprendizaje graves, como lo demuestra la prueba de separación-Barnes Laberinto espacial del patrón. Para probar específicamente el comportamiento de los ratones transgénicos doble en una tarea DG-dependiente, se utilizó el SPS-BM, por el cual los animales que diferenciar entre los lugares con diferencias sutiles (Figura 5). En este ensayo de comportamiento, los / IkB - los animales de control exploraron las casas de los alimentos en serie en el primer día del experimento (Figura 5). Después de siete días de entrenamiento, los animales fueron capaces de encontrar la casa de comida abierta directamente. Por el contrario, los animales IkB / TTA continuaron explorando las casas de comida en serie, incluso después de la formación (Figura 5B). La observación de un aumento significativo en las distancias recorridas y mayores latencias y erlas tasas de ROR en los animales IkB / tTA, en comparación con los / IkB - los animales de control, sugiere que estos animales tenían defectos severos de aprendizaje (Figura 5C).

Figura 1. Generación de una inhibición específica del cerebro anterior condicional de la actividad de NF-kB. A. Esquema de dibujo de los modelos transgénicos utilizados para estudiar el papel de NF-kappa B en la neurogénesis del hipocampo adulto. Calcio-calmodulina quinasa dependiente de IIα (CAMKIIα) promotor impulsado por tetraciclina transactivador (tTA) ratones se utilizan para regular la expresión de un mutante negativo dominante trans-IκBa (IκBa-AA1 super-represor en ratones IkB) combinado con una proteína fluorescente verde trazador (GFP). En los ratones IkB / tTA, NF-kB se mantiene en el citoplasma en su estación inactivaTE por no degradable IκBa-AA1, que puede ser detectada a través de GFP-fluorescencia. La inhibición puede ser revertida por la doxiciclina, que inhibe TTA. B. Representante expresión del transgén en diferentes regiones del hipocampo de ratones IkB / tTA (CA1, CA3 y DG). Criosecciones se prepararon a partir de cerebros aislados de IkB / - ratones y IkB / tTA, y se fijaron y tiñeron utilizando un anticuerpo frente a GFP. Tenga en cuenta que el transgén se expresa altamente en la DG. De: dendritas, DG: giro dentado, ML: capa molecular, SL: estrato lúcido. Haz clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 2. , Progenit tipo-2b El transgén IκBa-AA1 se expresa en DCX-positivo ors y participa activamente en otros estados intermedios y en las células granulares maduras. Hipocampos A. cryosectioned de animales IkB / tTA con doblecortina (DCX) la tinción y la expresión de GFP revelan la expresión del transgén en las células granulares jóvenes DCX-positivas (flechas). DG: giro dentado, ML: capa molecular B. Esquema de dibujo de la expresión transgénica en diversas etapas de desarrollo durante el desarrollo de células granulares.. IκBa-AA1-transgén se detectó expresión en los progenitores, de tipo 2b DCX-positivos, todos los estados inmaduros intermedios y en las células granulares maduras. Por contraste, los progenitores de tipo 1 y tipo-2a primeros (que carecen de la expresión de DCX-) no expresaron el transgén, y por lo tanto no se vieron afectados por la inhibición de NF-kB. Modificado después Kempermann et al. ²⁰ Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

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Figura 3. La inhibición de NF-kB lleva a proyecciones de fibras musgosas deteriorados y para un espesor DG reducida y el volumen en ratones IkB / TTA, en comparación con solo control transgénico (IkB / -). A. La inmunotinción de hipocampos cryosectioned para neurofilamentos M (NF-M) para visualizar proyecciones de fibras musgosas. En los ratones de control (IkB / -), una organización compleja y fascicular de fibras musgosas que conectan las células granulares a sus células diana en CA3 es evidente, que fue alterada después de la inhibición neuronal de NF-kB en ratones IkB / TTA. Además, la expresión de la super-represor condujo a un espesor reducido de manera significativa suprapiramidal cuchilla (comparar flecha en el panel izquierdo y derecho) y un volumen disminuida DG. B. La cuantificación y el análisis estadístico de los defectos estructurales que resultan de la inhibición de NF-kB. Prueba t no pareada, de dos colas. Datos tomados de la OA-versión de Imielski et al. ² Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 4. La inhibición de NF-kappa B en ratones IkB / tTA conduce a aumento de la muerte celular neuronal, el aumento de la neurogénesis, y un patrón migratorio perturbada de las células que expresan DCX-. A. tinción de la neurona específica fluoro-Jade C y aumento del número de células de caspasa-3-positivo troceados en secciones de hipocampo revela un nivel más alto de la muerte celular neuronal en ratones IkB / tTA que en las IkB / - controles. Neuritas degeneradas están marcados con flechas, y los núcleos se indican con un asterisco. Sitio de la derecha: la cuantificación de exfoliados caspasa-3-pocélulas sibles dentro de los hipocampos sugiere altamente aumento de la apoptosis en los animales transgénicos dobles. B. La tinción de secciones criogénicas del hipocampo para DCX revela un mayor número de células que expresan DCX-en los animales transgénicos dobles. Tenga en cuenta que + células DCX en IkB / TTA-hipocampos no están dispuestos exclusivamente en la zona subgranular, pero emigraron más profundamente en la Dirección General que en el IkB / -. Control de C. Panel izquierdo: Para probar la influencia de los transgenes sobre la proliferación, se realizó una sola BrdU-inyección, lo que dio lugar a diferencias significativas en el número de células BrdU-positivas entre IkB / TTA y los controles del panel derecho:. Evaluación estadística reveló una significativa aumentar en las células que expresan DCX en animales IkB / TTA después de tres BrdU-inyecciones diarias. El análisis se llevó a cabo siete días después de la última inyección (test de diferenciación e integración). Se detectó un aumento significativo en BrdU / DCX + en la Dirección General de la Iratones kappa B / tTA (n = 3). Los datos toman en parte de la OA-versión de Imielski et al. ² Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 5. Puesta en marcha y los resultados típicos del patrón espacial de separación-Barnes laberinto (SPS-BM). A. Izquierda: Esquema del montaje experimental. Siete casas alimentos idénticos (mismo color, tamaño y forma) fueron colocados simétricamente en puntos definidos de un plato redondo, hecho en casa construida de plástico inerte duro (diámetro de 120 cm), con un lugar libre (punto de partida, S). Multicolores señales extra-laberinto (EMC) se unen en frente de un paño de color blanco en posiciones fácilmente visibles para los animales, aproximadamente 100 cm de la borden de la placa. Para evitar la orientación por el olor, bolitas de comida se depositan en todas las casas, pero sólo una casa de comida es accesible (cierre hecha de lámina transparente). Derecha: La cámara de vídeo se centró en la placa (distancia a la placa: 115 cm), y una fotografía de la puesta a punto incluyendo las señales extra-laberinto B. resultado experimental típica de una prueba de SPS-BM.. El IkB / - animal control explora las casas de comida en serie en el primer día de la serie de pruebas, y la casa de comida abierto se encuentra inmediatamente después de siete días de entrenamiento. En contraste, los ratones IkB / TTA revelan aprendizaje más pobres, como se demuestra por la exploración de serie, incluso después de la fase de entrenamiento C. Comparación de los parámetros medidos en el SPS-BM en IkB / -. Animales y IkB / TTA. Los ratones dobles transgénicos muestran déficits de memoria significativas (n = 9), en comparación con los controles (n = 8) con respecto a la latencia, la distancia recorrida y la tasa de error. Evaluación ANOVA de dos vías; barras de error: SEM. Los datos de la B yC se tomaron de la OA-versión de Imielski et al. ² Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Discussion

Neurogénesis adulta, y la posibilidad de su manipulación a través de la inhibición de NF-kB en las neuronas, y su reactivación posterior a través de la doxiciclina, ofrece un sistema fascinante para la investigación de las neuronas recién nacidas en el cerebro adulto, así como en la neuronal, y de re-generación . La belleza de este sistema es que la inhibición de la vía de señalización NF-kB en las neuronas no sólo se traduce en cambios en la muerte neuronal celular, la proliferación de progenitores y la migración, y severos cambios estructurales y anatómicas, sino también en los defectos de aprendizaje obvias. Es importante destacar que, el fenotipo de los animales IkB / tTA puede ser experimentalmente invierte y rescató después de la administración de doxiciclina. Esta reversión del fenotipo incluye aspectos estructurales, y también puede dar lugar a una mejora significativa en el aprendizaje de la Dirección General dependiente ^2.

Para asegurar un resultado interpretable para los experimentos de comportamiento, es crítico que sólo los animales de sexo masculino con una edad difereutilizar nce de menos de cuatro días. Además, todas las series de ensayo debe ser realizado por el mismo operador. Con respecto a la sala de pruebas, se recomienda realizar la prueba en un ambiente aislado acústicamente para evitar el estrés y la pérdida de atención resultante de fuentes de ruido externas. Para evitar que la orientación basada en la detección de olores en lugar de señales extra-laberinto, las casas de comida cerrados no deben ser accesibles a los animales, y la circulación de aire y olor normales deben ser permitidos. Además, la placa se utiliza para la prueba debe ser construido de material de olor neutro y detergente resistentes, y debe limpiarse cuidadosamente entre experimentos. Una posible fuente adicional de variación experimental es la iluminación ambiente. La fuente de luz deberá ser lo suficientemente brillante como para permitir la adquisición de imágenes, el reconocimiento de las señales extra-laberinto, e inducir el comportamiento de vuelo, pero no debe ser de una intensidad para cegar al animal. Por otra parte, se sugiere la realización de las pruebas para cada animal, al mismo tiempodel día para evitar variaciones circadianas.

Mus musculus tiene una bastante buena habilidad de la visión que, en condiciones naturales, entre otros que se utilizan para detectar los límites territoriales de características de gran impacto visual (pistas visuales como los árboles) (Latham et al., Appl. Animal Behav.. Sci. 86 (3-4 ), 261-289, 2004). En un experimento clásico Balkema et al. (J.. Neurophysiol 48 (4), 968-980, 1982) coloca 6, 0 y -7 dioptrías lentes delante de los ojos de ratones y observaron cambios significativos del tamaño de los campos receptivos en las células ganglionares de la retina. Debido a esta enorme profundidad de estímulos visuales de campo (por ejemplo, tacos de extra-laberinto) se puede colocar sobre una amplia gama de distancias delante de los ratones y permanecer en el foco. En nuestro enfoque, la distancia de señales extra-laberinto desde el punto de partida fue de 30 cm desde el borde de la placa, que está de acuerdo con la literatura (por ejemplo, 140 cm de WOng et al., Genes cerebro Behav. 5 (5), 389-403, 2006)

Los roedores tienen la tendencia a permanecer cerca de las paredes de un campo abierto. Este comportamiento se define como thigmotaxis (Barnett, SH, La rata: un estudio en el comportamiento, la edición Aldline, Chicago, pp 31-32, 1963). Un estudio reciente realizado por O `Leary et al. (Behav. Brain Res.. 216 (2), 531-542, 2011) demostró que los ratones C57BL/6J mostraron un mejor aprendizaje en un Barnes laberinto en comparación con otras 12 cepas de ratones. 28% de los ratones probado utilizaba búsqueda espacial, mientras que el 64% utiliza la estrategia de serie thigmotactic. Estos datos es válido para pequeño laberinto con un diámetro de 69 cm con un 15 cm de la pared circundante. Sin embargo, los ratones probados en un gran laberinto sin paredes o intramaze señales, como nuestra configuración (diámetro de 120 micras) han mostrado evidencia fiable para el uso de principalmente extra-laberinto señales visuales (ver por ejemplo, Bach et al., Cell. 81 físicas, por ejemplo causadas por diferencias de microestructura, la placa se hizo girar después de cada experimento.

La prueba de comportamiento se puede simplemente adaptar para investigar el impacto de otros factores de transcripción en la neurogénesis del hipocampo adulto, utilizando modelos de ratón adecuados. Sin embargo, está diseñado principalmente para probar el aprendizaje de la DG-dependiente (separación patrón espacial), y puede no ser apropiado para la investigación de la neurogénesis o la degeneración neuronal en otras regiones del cerebro. En este sentido, el uso de SPS-BM está limitado además por su DG-especificidad (dependencia estricta de un circuito funcional entre EC II y la DG y CA3 y CA1 y EC VI), y debe, por tanto, no deben aplicarse para la investigación de las tareas que implican la monosináptico CE III - CA1 - CE V - circuito.

Las futuras aplicaciones de los métodos descritos en este documento pueden incluir la investigación de los efectos de los trasplantes de células madre, farmacéuticamentetratamientos ticos sobre la neurogénesis del hipocampo adulto, y la homeostasis del tejido en el hipocampo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Moria MC17 Perforated Spoon	FST	10370-18	removal of the brains
Dissecting microscope	Carl Zeiss	Stemi SV8	removal of the brains
Surgical scissors	FST	14084-08	removal of the brains
Surgical scissors	FST	14381-43	removal of the brains
Dumont #5 forceps	FST	11254-20	removal of the brains
SuperFrost Slides	Carl Roth	1879	slides for immunohistochemistry
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	fixative
TissueTek OCT compound	Sakura Finetek	1004200018	embedding of the brains
Normal Goat Serum	Jackson Immunolabs	005-000-001	blocking in IHC
Normal Rabbit Serum	Jackson Immunolabs	011-000-001	blocking in IHC
Normal Donkey Serum	Jackson Immunolabs	017-000-001	blocking in IHC
anti-Neurofilament-M antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	2H3	IHC, Dilution 1:200
anti-Doublecortin antibody	sc-8066	Santa Cruz	IHC, Dilution 1:800
anti-GFP antibody	Abcam	ab290	IHC, Dilution 1:2,000
anti-BrdU antibody	OBT0030G	Accurate Chemicals	IHC, Dilution 1:2,000
Fluoro-Jade C	FJ-C	HistoChem	Determination of neuronal cell death
Betadine	Mundipharma	D08AG02	disinfectant
Cryomicrotome	Leica	CM1900	preparation of brain slices
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H3393	perfusion
Circular plate made from hard-plastic (diameter 120 cm)	lab made	none	plate for SPS-BM, diameter 120 cm
Buraton rapid disinfectant	Schülke Mayr	113 911	disinfectant
Video-tracking system TSE VideoMot 2 with Software Package VideoMot2	TSE Systems	302050-SW-KIT	tracking and analysis of SPS-BM
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787	permeabilization/IHC
Cryotome	Reichert Jung/Leica	Frigomobil 1206	preparation of 40 µm brain slices
Mowiol 4-88	Carl Roth	Art.-Nr. 0713	embedding of the slides
SYTOX green	Invitrogen	S7020	Nuclear staining
Food pellets (Kellog`s Froot Loops)	Kellog`s		SPS-BM
Prism, Version 3.0	Graph Pad Software, San Diego, USA		Statistical evaluation of SPS-BM
Zen 2008 or Zen 2011 Software	Carl Zeiss		Software (Confocal microscope)
D.P.X	Sigma-Aldrich	317616	mounting medium for Fluoro-Jade C staining