Methoden voor de modulatie en analyse van NF-kB-afhankelijke Adult Neurogenese

Summary

Werkwijzen voor de manipulatie en analyse van NF-kB-afhankelijke volwassen hippocampus neurogenese beschreven. Een gedetailleerd protocol wordt gepresenteerd voor een dentate gyrus-afhankelijke gedragstest (genoemd het ruimtelijk patroon scheiding-Barnes doolhof) voor het onderzoek naar cognitieve uitkomst bij muizen. Deze techniek moet ook helpen onderzoek mogelijk te maken in andere experimentele instellingen.

Abstract

De hippocampus speelt een centrale rol in de vorming en consolidatie van episodische herinneringen, en in ruimtelijke oriëntatie. Historisch gezien is de volwassen hippocampus gezien als een statisch anatomisch gebied van de hersenen van zoogdieren. Echter, recente bevindingen aangetoond dat de dentate gyrus van de hippocampus is een gebied van enorme plasticiteit bij volwassenen, waarbij niet alleen wijzigingen van bestaande neuronale circuits, maar ook volwassen neurogenese. Deze plasticiteit wordt gereguleerd door complexe transcriptienetwerken, waarin de transcriptiefactor NF-kB speelt een belangrijke rol. Het bestuderen en manipuleren volwassen neurogenese, een transgeen muismodel voor voorhersenen specifieke neuronale inhibitie van NF-KB-activiteit kunnen worden gebruikt.

In deze studie, worden werkwijzen beschreven voor het analyseren van NF-kB-afhankelijke neurogenese, inclusief de structurele aspecten, neuronale apoptose en proliferatie van voorlopercellen en cognitieve betekenis which werd speciaal via een dentate gyrus (DG)-afhankelijke gedragstest, het ruimtelijk patroon scheiding-Barnes maze (SPS-BM) beoordeeld. Het SPS-BM protocol kan eenvoudig worden aangepast voor gebruik met andere transgene diermodellen ontworpen om de invloed van bepaalde genen op volwassen hippocampus neurogenese beoordelen. Bovendien kan SPS-BM worden gebruikt in andere experimentele instellingen wil nagaan en manipuleren DG-afhankelijk leren, bijvoorbeeld met farmacologische middelen.

Introduction

Ontologisch, de hippocampus is een van de oudste anatomische hersenstructuren bekend. Het is verantwoordelijk voor diverse complexe taken, zoals het centrale functie in de regulatie van de lange-termijn geheugen, ruimtelijke oriëntatie, en de vorming en consolidatie van het betreffende geheugen. Anatomisch, de hippocampus bestaat uit piramidale cellagen (stratum pyramidale) met inbegrip van de cornu Ammonis (CA1, CA2, CA3 en CA4) regio's en de dentate gyrus (gyrus dentatus), die granule cellen en enkele neuronale voorlopercellen binnen haar subgranulaire zone bevat . De granule cellen projecteren naar het gebied CA3 via de zogenaamde bemoste vezels (axons van granule cellen).

Tot het einde van de vorige eeuw, werd de volwassen hersenen van zoogdieren verondersteld om een ​​statisch orgaan ontbreekt cellulaire plasticiteit en neurogenese zijn. Echter, tijdens de laatste twee decennia een groeiende hoeveelheid bewijs toont volwassen neurogenese plaats in duidelijk minstenstwee hersengebieden, de subventriculaire zone (SVZ) en de subgranulaire zone van de hippocampus.

Onze eerdere studies, en die van andere groepen hebben aangetoond dat de transcriptiefactor NF-KB is een van de cruciale moleculaire regulatoren van volwassen neurogenese, en dat de deregulering leidt tot ernstige structurele hippocampale afwijkingen en cognitieve stoornissen ^1-6. NF-KB is de generieke naam van een induceerbare transcriptiefactor uit verschillende dimere combinaties van vijf DNA-bindende subeenheden: p50, P52, c-Rel, RelB en p65 (RelA), de laatste drie daarvan met transactiveringsdomeinen. In de hersenen, de meest voorkomende vorm in het cytoplasma is een heterodimeer van p50 en p65, die in een inactieve vorm wordt gehouden door inhibitor van kappa B (IKB)-eiwitten.

Te bestuderen en rechtstreeks manipuleren NF-kB-driven neurogenese, maken we gebruik van transgene muismodellen voor de eenvoudige remming van alle van de NF-kB subun staatzijn, met name in de voorhersenen ⁷ (zie figuur 1). Voor dit doel hebben we gekruist de volgende transgene muis lijnen, IKB / - en -/tTA. De transgene IKB / - lijn werd gegenereerd met behulp van een trans-dominant negatieve mutant van NF-kB-remmer IκBa (super-repressor IκBa-AA1) ^8. In tegenstelling tot het wildtype IKBa, IKBa-AA1 twee serine residuen gemuteerd naar alanines (V32 en V36), die de fosforylering en daaropvolgende proteasomale degradatie van de remmer belemmeren. Voor voorhersenen neuron-specifieke expressie van de IκBa-AA1-transgen, IKB / - muizen werden gekruist met muizen die een calcium-calmodulin-afhankelijke kinase IIα (CAMKIIα)-promotor die kan worden aangedreven door tetracycline trans-activator (TTA) ^9.

p65 knock-out muizen een embryonaal lethaal fenotype wegens massieve apoptose lever ^10, zodat de hier getoonde aanpak biedt een elegante methodehet onderzoek naar de rol van NF-KB in postnatale en volwassen neurogenese.

De klassieke gedragstest ruimtelijke leren en geheugen te bestuderen werd in de jaren 1980 beschreven door Richard Morris, een test bekend als de Morris water-maze (MWM) ^11. In deze open-veld water-doolhof, dieren leren om te ontsnappen aan ondoorzichtige water op een verborgen platform op basis van oriëntatie en extra-doolhof cues. Een droge variant van MWM is de zogenaamde Barnes doolhof (BM) ^12. Deze test maakt gebruik van een ronde plaat met 20 ronde gaten aangebracht aan de rand van een plaat, met een gedefinieerd gat als een ontsnapping doos, en visuele extra-doolhof signalen voor oriëntatie. Zowel experimentele paradigma's vertrouwen op het gedrag vlucht veroorzaakt door een knaagdier `s afkeer van water, of open en helder verlichte ruimtes. Beide tests laten een onderzoek naar ruimtelijke oriëntatie, en de daarmee verband houdende geheugenprestaties. Hoewel de hippocampus speelt een algemene en essentiële rol in de ruimtelijke vorming van het geheugen, de hippocampus rgewesten betrokken verschillen afhankelijk van de gebruikte test. Het geheugen getest BM voortvloeit uit neuronale activiteit tussen de enthorinal cortex (EC) en de piramidale neuronen in het CA1-gebied van de hippocampus zonder bijdrage van DG ^13-16. Met name de klassieke BM berust vooral op navigatie via de monosynaptic temporo-ammonic weg van EG III CA1 EG V. Belangrijk is DG cruciaal betrokken bij de zogenaamde ruimtelijk patroonherkenning ^17, die niet alleen de verwerking impliceert visuele en ruimtelijke informatie, maar ook de transformatie van soortgelijke verklaringen of herinneringen in ongelijksoortige, niet-overlappende representaties. Deze taak vereist een functionele tri-synaptische circuit van EC II DG om CA3 naar CA1 en EG VI, die niet kunnen worden getest in de BM ^15.

Om deze uitdagingen aan te pakken, hebben we SPS-BM bedacht als een gedragstest om specifiek te testen dentate gyrus-afhankelijke cognitieve prestaties in control dieren en met de IKB / tTA super-repressor model na NF-KB-inhibitie. Belangrijk is, in tegenstelling tot de MWM of BM, de SPS-BM subtiele gedragstekorten gevolg van aantasting van neurogenese onthullen. Sinds ruimtelijk-patroon-scheiding is strikt afhankelijk van een functioneel circuit tussen EC II en DG en CA3 en CA1 en EG VI, deze test is zeer gevoelig voor potentiële veranderingen in neurogenese, wijzigingen van het bemoste vezels pad of wijzigingen van weefsel homeostase binnen de DG.

Technisch gezien is de set-up van onze test op basis van de studie van Clelland et al.., Waarin de ruimtelijke scheiding patroon werd getest met behulp van een houten 8-arm radiale arm doolhof (RAM) ^19. In onze gewijzigde set-up, werden de acht armen vervangen door zeven identieke gele voedsel huizen. Kortom, hier de methoden getoond, inclusief een analyse van-doublecortin uitdrukken (DCX +) cellen in de hippocampus, de mosvezel projecties, neuronale cel death en met name de SPS-BM gepresenteerd hier, kan worden toegepast op onderzoeken van andere muismodellen waarin transgenen die een impact hebben op volwassen neurogenese hebben. Verdere toepassingen kan de bestudering van farmacologische middelen en het meten van hun impact op de DG en ruimtelijk patroon scheiding omvatten.

Protocol

Ethiek verklaring

Dit onderzoek is uitgevoerd in strikte overeenstemming met de voorschriften van de overheid dier en zorggebruik commissie, LANUV van de staat Noord-Rijnland-Westfalen (Düsseldorf, Duitsland) uitgevoerd. Alle dierproeven werden goedgekeurd door LANUV, Düsseldorf onder licentie nummer 8.87-51.04.20.09.317 (LANUV, NRW). Alle inspanningen werden gedaan om nood en het aantal dieren dat nodig is voor de studie zoveel mogelijk te beperken.

1. Animal Care en Huisvesting

1. Alle dieren die in de hierin beschreven protocollen moeten onder specifieke pathogeen-vrije omstandigheden worden gehouden, zoals bepaald door de Federatie Europese Laboratory Animal Science Association (FELASA).
2. Muizen moeten in standaard kooien worden gehouden in een temperatuur-en vochtigheid gecontroleerde (22 ° C) ruimte onder dagelijkse omstandigheden (12 uur licht / donker cyclus) met HEPA gefilterde lucht.
3. Gestandaardiseerd voedsel en water moet worden ad libitum. </ Li>
4. Als IKB / tTA en IKB / - controle muizen worden gebruikt, moeten PCR-gebaseerde genotypering uitgevoerd worden voor elk dier, zoals beschreven in ^{7, 18.}
5. Mannelijke dieren met een leeftijd verschil van minder dan vier dagen dienen te worden gebruikt om de variabiliteit te verminderen.
6. (Optioneel): Voor de NF-kB reactivering experimenten, doxycycline moet worden toegediend in het drinkwater (2 mg / ml met 2,5% sucrose) gedurende ten minste 14 dagen.

2. Ruimtelijk patroon Scheiding-Barnes Maze (SPS-BM)

1. Alle gedrags tests moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met internationale en lokale richtlijnen.
2. BELANGRIJK! Gebruik alleen mannelijke muizen met een leeftijd van zes maanden of ouder. Het leeftijdsverschil tussen de dieren van een testreeks moet minder dan vier dagen. De test moet worden uitgevoerd door dezelfde exploitant voor elke serie. De muizen moeten een standaard dieet ontvangen voorafgaand aan de test om verder te verhogen de motivatie gedeeltelijk gedreven door alsWeet voedsel beloning.
3. Het opzetten van een witte cirkelvormige plaat gemaakt van hard plastic (diameter 120 cm, zie figuur 5A) in een vochtige-en temperatuur gecontroleerde ruimte (22 ° C), verlicht met ten minste 4 x 80 W en 3 x 215 W fluorescerende lampen . BELANGRIJK! Zorgen voor de juiste verlichting wordt gebruikt, zoals de motivatie van de muizen om het voedsel de huizen betreedt wordt gedeeltelijk gedreven door hun afkeer van heldere, zichtbare plaatsen.
4. Stel de video-tracking systeem. De camera moet 115 cm boven het midden van de plaat (zie figuur 5A) worden geplaatst.
5. Bevestig veelkleurige extra-doolhof cues (EMC) om een wit-gekleurde doek in posities gemakkelijk toegankelijk voor de dieren, ongeveer 100 cm van de rand van de plaat (zie figuur 5A).
6. Reinig de plaat voorzichtig met een snelle ontsmettingsmiddel dat een geur uit de experimentele set-up kan verwijderen.
7. Plaats zeven identieke gele voedsel huizen (12 cm x 7 cm x 8 cm, zie figuur 5A figuur 5A).
8. Plaats zoet voedsel pellet beloningen (een kwart van een Kellogs `s Froot Loop / food huis) binnen alle levensmiddelen huizen op welbepaalde plaatsen (zie figuur 5A) met slechts een bepaald voedsel huis zijn vrij toegankelijk voor het dier (locatie F, zie figuur 5A ). Sluit de nontarget voedsel huizen met transparante folie.
9. Voorafgaand aan de test uitvoeren gewenning (een dag voor aanvang van de opdracht). Maak alle voedsel huizen vrij toegankelijk en laat de muizen om het doolhof vrij te verkennen en om een ​​levensmiddel pellet beloning (10 min / dier) te halen.
10. Schakel de computer en de camera aan en start de video-tracking systeem software.
11. Start de opname.
12. Plaats het dier in de gedefinieerde startpunt op de ronde plaat (figuur 5A, S: startpositie) en laat de muizen om te zoeken naar het doel voedsel voor 10 minuten.
13. Stop de video-tracking.
14. BELANGRIJK! Reinig de cirkelvormige plaat en het eten huizen na elke proef met snelle ontsmettingsmiddel.
15. Herhaal de test dagelijks gedurende zeven opeenvolgende dagen (per dier).
16. Analyseer de resultaten (latency, de afgelegde afstand en fouten) met behulp van geschikte statistische software. Fouten te definiëren als het naderen van het verkeerde voedsel huis en / of contact met de juiste doos zonder het invoeren van en het ophalen van de voedsel pellet beloning. Voor gegroepeerde analyse gebruik van twee-weg ANOVA met Bonferroni post-hoc test.
17. (OPTIE) Offer de muizen en de hippocampus zoals hieronder beschreven te analyseren.

3. BrdU Labeling

1. Intraperitoneaal injecteren 50 mg / kg ip BrdU eenmaal daags gedurende 3 dagen (analyse van differentiatie en integratie) of 200 mg / kg ip een enkele injectie (analyse van de proliferatie).
2. Offer de dieren, ontleden de hippocampus en bereid 40 urn zoals hieronder beschreven.
3. Denatureren desecties met 2 M HCl gedurende 10 minuten en incubeer in 0,1 M boraatbuffer gedurende 10 minuten.
4. Label een in twaalf reeks van 40 urn (240 urn van elkaar) van elk dier immunohistochemisch, zoals hieronder beschreven met behulp van antilichamen tegen BrdU.
5. Kwantificeer de gelabelde cellen met confocale microscopie analyse gehele rostrocaudal omvang van de korrel cellaag en subgranulaire zone. Vermenigvuldig de verkregen getallen door 12 het geschatte aantal BrdU-gelabelde cellen per hippocampus en delen verkrijgen door twee aan het totale aantal gelabelde cellen per DG verkrijgen.

4. Verwijdering van de Hersenen en voorbereiding van Weefsel secties van Nonperfused Dieren

1. Let op lokaal goedgekeurde procedures voor euthanasie dieren. Muizen kunnen direct worden gedood door cervicale dislocatie.
2. (OPTIE) Dieren kunnen worden verdoofd voordat euthanization volgens de lokale en internationale richtlijnen, bijv. door intraperitoneale injectie van 0,8 ml Avertin voor een 33 g muis (vers gemaakt door het mengen van 150 ml stockoplossing gemaakt van 2,2 mg 2,2,2-tribroomethanol in 1 ml isoamylacetaat ethanol met 1,85 ml van een zoutoplossing of fysiologische buffer).
3. Steriliseer het hoofd met Betadine (10% povidon-jood)-gedrenkt gaas en vervolgens wattenstaafje met gaas geweekt in 70% ethanol.
4. Onthoofden het dier met behulp van passende chirurgische schaar en trek de huid opzij.
5. (OPTIONEEL) Bevestigingsklemmen kan worden toegepast om te voorkomen terugvouwen van het vertraagde huid.
6. Maak een middellijn incisie in de schedel en trek de schedel fragmenten opzij.
7. Verwijder de hele hersenen zorgvuldig met een geschikt chirurgisch instrument (bijv. Moria Spoon).
8. Precool 25 ml 2-methylbutaan in een 50 ml bekerglas (bijvoorbeeld Schott Duran) tot -30 tot -40 ° C op droog ijs.
   Opmerking: Voor vrij zwevende kleuring van "dikke" secties die bij uitstek geschikt zijn voor confocale laser scanning microscopie, verwijder de hersenen, was 3keer in buffer en bewaar bij 4 ° C in fosfaat gebufferde 30% sucrose-oplossing in 50 ml buis totdat hersenen beneden gezonken naar beneden (typisch overnacht).
9. Plaats voorzichtig de hersenen op een stuk van Nescofilm (Parafilm) en dek af met een ruime hoeveelheid TissueTek oktober verbinding, bevriezen Nescofilm in 2-methylbutaan, bewaar bij -80 ° C tot gebruik.
   Opmerking: Voor de lange termijn opslag bij -20 ° C op te slaan in 9% sucrose, 7 mM _MgCl2, 50 mM fosfaatbuffer, 44% glycerol.
10. Snijd de hersenen in 10-12 micrometer dikke secties over passende cryomicrotoom.
    Opmerking: Voor dikke, vrij zwevende delen, te bevriezen hersenen op cryotoom stadium van geschikte cryotoom (bijv. Reichert Jung, Frigomobil.) En snijd 40 micrometer horizontale secties bij -20 ° tot - 25 ° C. Verzamel secties van mes met fijne borstel en in een buffer of in storage oplossing te houden (stap 4.9) bij -20 ° C gedurende langere tijd opslaan.
11. Mount zorgvuldig twee plakjes op enkele objectglaasjes. De onse van Superfrost UltraPlus dia's wordt ten zeerste aanbevolen om de hechting van de secties te maximaliseren.
12. Droog de objectglaasjes gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Dia's kunnen worden opgeslagen bij -80 ° C tot gebruik.

5. Bereiding van de punten uit geperfuseerde Dieren

1. Verdoven dieren zoals hierboven (stap 4.2) beschreven.
2. Perfuseren het dier voorzichtig transcardiaal met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met heparine (0,025 g/100 ml PBS) en procaïne (0,5 g/100 ml PBS) gedurende 2-4 minuten, gevolgd door 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 10-15 min . Perfusie wordt optimaal uitgevoerd te doorstromen via de linker ventrikel en openen van de rechter atrium met een hydrostatische druk van ongeveer 1,2-1,4 m of gebruik van een peristaltische pomp ingesteld op ongeveer 15 ml / min. Optimale perfusie resultaten in een bleke witte hersenen zonder rode bloedvaten zichtbaar.
3. Ontleden en na vaststellen van de hersenen in 4% paraformaldehyde bij 4 ° C gedurende 24 uur.
4. Cryobeschermen de hersenen in 30% sucrose in PBS bij 4 ° C gedurende ten minste 24 uur.
5. Bevries de hersenen op de cryotoom podium.
6. Bereid 40 micrometer horizontale delen van hele forebrains met een geschikte cryotoom.
7. De objectglaasjes kunnen worden opgeslagen in cryobeschermingsmiddeloplossing (0,1 M fosfaatbuffer, 50% glycerol, 0,14% _MgCl2, 8,6% sucrose) bij -20 ° C tot gebruik.

6. Immunohistochemie van Brain secties van Nonperfused Dieren

1. Post-fix de cryosecties, bereid zoals boven beschreven, met -20 ° C koude methanol gedurende 10 minuten.
2. Blokkeer met 5% normaal serum dat 0,3% Triton-X (van de soort die werd gebruikt voor het verhogen van het secundaire antilichaam) overnacht bij 4 ° C.
3. Spoel 3x met 1x PBS en incubeer met primaire antilichamen overnacht bij 4 ° C.
4. Spoel 3x met 1x PBS en geïncubeerd met secundaire antilichamen bij kamertemperatuur gedurende een uur.
5. Spoel 3x met 1x PBS
6. Counterstain de sectie voor DNA met behulp SYTOX groen of DAPI (of een alternatieve DNA-kleurstof).
7. Spoel 3x met 1x PBS
8. Insluiten de secties in een waterig inbeddingsmedium.
9. Laat de inbedding medium polymeriseren gedurende tenminste 48 uur.

7. Immunohistochemie van Brain secties van geperfuseerde Dieren

1. Blok zoals beschreven in stap 6.2 en vervolgens incubeer vaste hersencoupes in primair antilichaam verdund in PBS dat 0,3% Triton-X (vrij zwevende) overnacht bij 4 ° C.
2. Spoel driemaal met 1 x PBS en geïncubeerd in secundair antilichaam verdund in PBS dat 0,3% Triton-X (vrij zwevend) bij kamertemperatuur gedurende 3 uur.
3. Spoel 3x met 1x PBS
4. Tegenkleuring de sectie voor DNA met behulp SYTOX groen of DAPI (of een alternatieve DNA-kleurstof).
5. Spoel driemaal met 1x PBS
6. Insluiten de secties in een waterig inbeddingsmedium.
7. Laat de inbedding medium polymeriseren voor eent minste 48 uur.

8. Onderzoek van mosvezel projecties

1. Offer de dieren bereiden 40 urn coronale secties zoals hierboven beschreven en vlekken de hippocampus gedeelte met antilichaam voor neurofilament M.
2. Scan de secties op de juiste golflengte met behulp van een confocale laser scanning microscoop om bemoste vezels en kernen te visualiseren. Start het scannen bij een lage vergroting.
3. Gebruik de lage vergroting beelden voor oriëntatie en de doelstelling van de hippocampus met mosvezel projecties.
4. Scan de secties (z-snijden) met een hoge resolutie en hoge vergroting.
5. Analyseer de morfologische verschijning en connectiviteit van de bemoste vezels gevisualiseerd via kleuring voor NF-M.
6. (OPTIE) Analyseer de grootte en het volume van de hippocampus messen. Gebruik het DNA signaal voor de metingen.

9. Fluor-Jade C Assay (neuronale celdood)

1. Offer de dieren, ontleden de hippocAmpus, en bereid 12 urn zoals hierboven beschreven.
2. Laat de onderdelen drogen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
3. Bevestig de secties in 4% PFA gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
4. Kort was de secties 3x met DDH ₂ O.
5. Incubeer de secties met 0,06% kaliumpermanganaat (KMnO ₄₎ gedurende 10 minuten onder voortdurend, voorzichtig schudden.
6. Was de secties 3x met DDH ₂ O.
7. Incubeer de secties met 0.002% Fluoro-Jade C oplossing gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
8. (OPTIONEEL) Bij gelijktijdige nucleaire kleuringen, 0.002% Fluoro-Jade C oplossing aangevuld met 10 ug / ml DAPI.
9. Kort was de secties 3x met DDH ₂ O.
10. Laat de onderdelen drogen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
11. Incubeer de secties met Xyleen (1 min)
12. Monteer de secties met een Xyleen-op basis van montage medium (DPX).

Representative Results

Kruisen van de IKB / - en tTA transgene muizenlijnen tot voorwaardelijke remming van NF-KB-activiteit in de hippocampus.

Om de expressie van de IKBa-AA1-transgen in de dubbele transgene muizen (Figuur 1A) te onderzoeken, werden hersenen geïsoleerd cryosectioned en gekleurd met een antilichaam tegen GFP (groen fluorescent eiwit). Confocale laser scanning microscopie onthulde hoge expressie van het transgen in het CA1 en CA3 regio en DG (Figuur 1B).

De IKBa-AA1-transgen wordt uitgedrukt in type-2b voorouders, en is actief in tussenliggende onvolwassen staten en in de volwassen korrelcellen.
Om de vroegste celtype uiting van de CAMKIIα-driven IKBa-AA1 in de hippocampus neurogene regio te bepalen, werden cryosecties van zeepaardjes van IKB / tTA dieren gekleurd voor doublecortin(DCX) en het transgen (GFP). Confocale analyse onthulde GFP-signalen bij jonge DCX-positieve granule cellen aangeeft inductie van de expressie van het transgen door CAMKIIα-activiteit (Figuur 2, pijlen).

Remming neuronale NF-kB via IKBa-AA1 vermindert mosvezel projecties, en de dikte en het volume van de DG.

Coronale secties van de hippocampus van IKB / tTA en IKB / - muizen werden gekleurd voor neurofilament M (NF-M) mosvezel projecties visualiseren en onthullen complexe en fasciculair ordening (Figuur 3). In IKB / tTA muizen, werden de mosvezel projecties ernstig gestoord. Bovendien NF-KB remming tot een aanzienlijk verminderd suprapyramidal bladdikte en een kleinere DG volume (figuur 3B).

Neuronale inhibitie van NF-kB in IKB / tTA muizen leidt tot verhoogde neuronale degenking, verhoogde neurogenese, en een verstoorde migratie van DCX-uitdrukken voorouders.

Om de mogelijke redenen voor de dramatische structurele defecten, vers bestuderen, werden losgemaakte hippocampus segmenten van IKB / tTA muizen gekleurd met Fluor-Jade C, waarin de specifieke detectie van neuronale celdood (Figuur 4A) maakt. Hier, een sterk toegenomen aantal degenererende neurites werden waargenomen in dubbel transgene dieren, in vergelijking met een enkele transgene controles. Bovendien is een aanzienlijke toename van gesplitst caspase-3-positieve apoptotische cellen werd gedetecteerd in IKB / tTA muizen. Daarentegen immunohistochemische kleuring tegen DCX bleek significant grotere hoeveelheden DCX + cellen in de hersenen van IKB / tTA muizen. Bovendien werden DCX + cellen in IKB / tTA-hippocampus niet uitsluitend aangebracht in de subgranulaire zone, maar werden ook gevonden in de diepere regionen van DG (figuur 4B), terwijl de DCX +-progenitors in de controle dieren werden bijna uitsluitend binnen de subgranulaire zone gelokaliseerd. Om te testen of de verhoogde hoeveelheid DCX expressie brengende cellen is een resultaat van rijping van eerdere voorlopercellen of rechtstreeks door proliferatie van DCX + cellen, werd BrdU geïnjecteerd in de hippocampus van IKB / tTA en controlemuizen, die vervolgens werden cryosectioned en gekleurd met DCX en BrdU (figuur 4). Voor de analyse van proliferatie werd BrdU eenmaal geïnjecteerd (zie Figuur 4B schema), gevolgd door analyse na 24 uur. Voor de analyse van de differentiatie werden drie injecties dagelijks uitgevoerd, gevolgd door onderzoek na zeven dagen. Na een BrdU-injectie werden geen significante verschillen in het aantal BrdU-positieve cellen tussen IκB/tTA- en controledieren waargenomen, terwijl de drie seriële injecties benadering bleek een duidelijk verhoogde hoeveelheid BrdU / DCX + cellen in de DG van IKB / tTA muizen. Dit geeft aan dat verstoorde differentiatie of integratie van DCX-exdrukken cellen kunnen de verhoogde aantallen DCX + cellen veroorzaakt, en suggereert dat type-3-cellen werden betrokken.

Neuronale inhibitie van NF-kB leidt tot ernstige leren gebreken, zoals blijkt uit het ruimtelijk patroon Separation-Barnes Maze test. Om het gedrag van de dubbel transgene muizen in een DG-afhankelijke taak specifiek te testen hebben we gebruik gemaakt van de SPS-BM, waarbij dieren moeten maken tussen locaties met subtiele verschillen (figuur 5). In deze gedragstest, het IKB / - onderzocht controledieren het eten huizen serieel op de eerste dag van het experiment (Figuur 5). Na zeven dagen van de opleiding, waren de dieren in staat om de open voedsel huis direct te vinden. Daarentegen is de IKB / tTA dieren bleef het eten huizen in serie staand, zelfs na de training (figuur 5B). De waarneming van een aanzienlijke stijging van de afgelegde afstanden en hogere latencies en error aanbiedingen in het IKB / tTA dieren vergeleken met de IKB / - controledieren, suggereert dat deze dieren een ernstige defecten leren (figuur 5C) had.

Figuur 1. Ontwikkeling van een conditionele forebrain-specifieke inhibitie van NF-KB-activiteit. A. Schematische tekening van de voor het bestuderen van de rol van NF-kB bij volwassen hippocampus neurogenese transgene modellen. Calcium-calmoduline-afhankelijke kinase IIα (CAMKIIα)-promotor aangedreven tetracycline transactivator (tTA) muizen werden gebruikt om de expressie van trans-dominant negatieve mutant IκBa (IκBa-AA1 super-repressor in IKB muizen) in combinatie met een groen fluorescerend eiwit reguleren tracer (GFP). In IKB / tTA muizen wordt NF-kB in het cytoplasma bewaard in zijn onwerkzame stadoor te afbreekbare IκBa-AA1, dat via GFP-fluorescentie kan worden gedetecteerd. De remming kan door doxycycline, die op verschillende hippocampus van IKB / tTA muizen (CA1, CA3 en DG) tTA. B. Representatieve transgenexpressie remt. Cryosecties werden bereid uit geïsoleerde hersenen van IKB / - en IKB / tTA muizen en werden gefixeerd en gekleurd met een antilichaam tegen GFP. Merk op dat het transgen hoog tot expressie in de DG. De: Dendrieten, DG: gyrus dentatus, ML: moleculaire laag; SL: Stratum lucidum. Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 2. De IκBa-AA1 transgen wordt uitgedrukt in DCX-positieve, type 2b progenit ors en is actief in meer tussenliggende staten en in de volwassen korrelcellen. A. Cryosectioned hippocampus van IKB / tTA dieren doublecortin (DCX) kleuring en GFP-expressie blijkt expressie van het transgen bij jonge DCX-positieve granule cellen (pijlen). DG: gyrus dentatus, ML: moleculaire laag B. Schematische tekening van transgene expressie in verschillende ontwikkelingsstadia tijdens korrel cel ontwikkeling.. IκBa-AA1-transgen expressie werd gedetecteerd in de DCX-positieve, type 2b voorouders, alle tussenliggende onvolwassen staten en in de volwassen korrelcellen. Daarentegen leverde vroeg type-1 en type-2a voorlopercellen (ontbreekt DCX-expressie) niet uitdrukken het transgen, en werden daarom niet beïnvloed door NF-kB remming. Gewijzigd na Kempermann et al.. ²⁰ Klik hier voor grotere afbeelding.

egen ">
Figuur 3. NF-KB remming leidt tot verminderde mosvezel projecties en een verminderde DG dikte en volume IKB / tTA muizen, vergeleken met enkelvoudige transgene controle (IKB / -). A. Immunokleuring van cryosectioned zeepaardjes voor neurofilament M (NF-M) naar mosvezel projecties visualiseren. In controlemuizen (IKB / -), een complexe en fasciculair ordening bemoste vezels verbinden granule cellen hun doelcellen in CA3 blijkt, dat werd verminderd na neuronale inhibitie van NF-kB in IKB / tTA muizen. Bovendien expressie van de super-repressor tot een aanzienlijk verminderd suprapyramidal bladdikte (vergelijk pijl in linker en rechter paneel) en een verminderde DG volume. B. Kwantificering en statistische analyse van structurele defecten gevolg van NF-KB remming. Ongepaarde t-test, tweezijdig. Gegevens uit de OA-versie van Imielski et al.. ² Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 4. Inhibitie van NF-kB in IKB / tTA muizen leidt tot neuronale celdood, verbeterde neurogenese en een verstoord patroon van migratie DCX expressie brengende cellen verhoogd. A. Neuron-specifieke Fluor-Jade kleuring C en verhoogde aantallen gesplitst caspase-3-positieve cellen in hippocampale secties onthult een hoger niveau van neuronale celdood in IKB / tTA muizen dan in het IKB / - controls. Degenererende neuronen zijn gemarkeerd met pijlen en kernen zijn aangegeven met een asterisk. Zoeken: kwantificering van gesplitst caspase-3-polige cellen in de hippocampus suggereert sterk verhoogde apoptose in dubbel transgene dieren. B. Kleuring van hippocampale vriescoupes van DCX onthult een verhoogd aantal DCX expressie brengende cellen in een dubbele transgene dieren. Merk op dat DCX + cellen in IKB / tTA-hippocampus niet uitsluitend aangebracht in de subgranulaire zone, maar migreerden dieper DG dan in het IKB / -. Control C. Linker paneel: Om de invloed van het transgen proliferatie testen, werd een BrdU-injectie uitgevoerd, waardoor geen significante verschillen in het aantal BrdU-positieve cellen van IKB / tTA en bediening Rechter paneel:. Statistische evaluatie bracht talrijke toename DCX expressie brengende cellen in IKB / tTA dieren na drie dagelijkse BrdU-injecties. De analyse werd uitgevoerd zeven dagen na de laatste injectie (test van differentiatie en integratie). Een significante toename van BrdU / DCX + werd gedetecteerd in de DG van IkB / tTA muizen (n = 3). Gegevens gedeeltelijk overgenomen uit de OA-versie van Imielski et al.. ² Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 5. Set-up en typische resultaten van ruimtelijk patroon scheiding-Barnes maze (SPS-BM). A. Links: Schematische tekening van de experimentele opstelling. Zeven identieke voedsel huizen (zelfde kleur, grootte en vorm) werden symmetrisch geplaatst op bepaalde plekken van een ronde, zelfgemaakte plaat opgebouwd uit harde inerte kunststof (diameter van 120 cm), met een vrije plaats (startpunt, S). Veelkleurige extra-doolhof cues (EMC) worden in de voorkant van een wit-gekleurde doek in de posities goed zichtbaar voor de dieren, ongeveer 100 cm van de b bijgevoegdevolgorde van de plaat. Om de oriëntatie te vermijden door geur, zijn voedsel pellets afgezet in elk huis, maar slechts een voedsel huis bereikbaar (sluiting gemaakt van transparante folie). Rechts: Video camera gericht op de plaat (afstand tot het bord: 115 cm), en een foto van de set-up inclusief de extra-doolhof signalen B. Typische experimentele uitkomst van een SPS-BM test.. De IKB / - controle dier verkent het eten huizen in serie op de eerste dag van de test-serie, en de open voedsel huis is gevonden direct na zeven dagen van de opleiding. In tegenstelling, IKB / tTA muizen onthullen armere leren, zoals aangetoond door seriële exploratie, zelfs na de training fase C. Vergelijking van de gemeten parameters in de SPS-BM in IKB / -. En IKB / tTA dieren. Dubbel transgene muizen tonen significante tekorten geheugen (n = 9) in vergelijking met controles (n = 8) met betrekking tot latency, afgelegde afstand en foutenpercentage. two-way ANOVA evaluatie; foutstaven: SEM. Gegevens in BC werden genomen uit de OA-versie van Imielski et al.. ² Klik hier voor grotere afbeelding.

Discussion

Volwassen neurogenese en de mogelijkheid van een manipulatie door remming van NF-KB in neuronen en de latere reactivering via doxycycline, biedt een fascinerende voor onderzoek naar pasgeboren neuronen in de volwassen hersenen, alsook in neuronale de-en regeneratie . Het mooie van dit systeem is dat NF-kB signaling pathway remming in neuronen niet alleen tot veranderingen in neuronale celdood, progenitor proliferatie en migratie, en ernstige structurele en anatomische veranderingen, maar ook evidente defecten leren. Belangrijk is dat het fenotype van de IKB / tTA dieren experimenteel worden omgekeerd en gered na toediening van doxycycline. Deze omkering van de fenotype omvat structurele aspecten, en kan ook leiden tot een significante verbetering van de DG-afhankelijke leren ^2.

Om een ​​interpreteerbaar resultaat voor de gedragsexperimenten garanderen, is het essentieel dat alleen mannelijke dieren met een leeftijd differentie van minder dan vier dagen te worden gebruikt. Bovendien moeten alle testreeks worden uitgevoerd door dezelfde. Met betrekking tot de testkamer, raden wij u aan de proef in een akoestisch geïsoleerde omgeving om stress en verlies van aandacht als gevolg van externe geluidsbronnen te voorkomen. Om de oriëntatie te voorkomen op basis van geur detectie plaats van extra-doolhof signalen, moet de gesloten voedsel huizen niet toegankelijk zijn voor het dier, en normale lucht en geur circulatie moeten worden toegestaan. Daarnaast dient de plaat voor de test gebruikte bouwen geur-neutraal en detergent-bestendig materiaal en zorgvuldig gereinigd tussen experimenten. Een andere mogelijke bron van experimentele variatie is ruimte verlichting. De lichtbron moet helder genoeg om beeldopname, de erkenning van de extra-doolhof signalen mogelijk te maken, en vlieggedrag induceren, maar mag niet van een intensiteit aan het dier blind zijn. Bovendien stellen we voor het uitvoeren van de tests voor elk dier op hetzelfde momentdag circadiane variaties te voorkomen.

Mus musculus heeft een vrij goede visie op het vermogen dat is, in natuurlijke omstandigheden, onder andere gebruikt om territoriale grenzen detecteren visueel opvallende kenmerken (visuele aanwijzingen zoals bomen) (Latham et al.., Appl. Animal Behav. Sci. 86 (3-4 ), 261-289, 2004). In een klassiek experiment Balkema et al.. (J. Neurophysiol. 48 (4), 968-980, 1982) die 6, 0 en -7 dioptrie lenzen voor muisogen en namen geen significante veranderingen van receptieve veld grootte in retinale ganglioncellen. Door deze grote scherptediepte visuele stimuli (bv. extra-doolhof signalen) over een groot bereik van afstanden voor muizen kan worden geplaatst en blijven gericht. In onze benadering de afstand extra-doolhof signalen van het uitgangspunt was 30 cm van de rand van de plaat, die overeenkomstig de literatuur (bijv. 140 cm Wong et al.., Genes Brain Behav. 5 (5), 389-403, 2006)

Knaagdieren hebben de neiging dicht bij de muren van een open veld te blijven. Dit gedrag wordt gedefinieerd als thigmotaxis (Barnett, SH, De rat: een studie in gedrag, Aldline publiceren, Chicago, pp 31-32, 1963). Een recente studie van O `Leary et al.. (Behav. Brain Res. 216 (2), 531-542, 2011) toonde aan dat de C57BL/6J-muizen toonde beter leren in een Barnes Maze in vergelijking met 12 andere muizen stammen. 28% van de geteste muizen gebruikt ruimtelijke zoeken, terwijl 64% gebruikt serial-thigmotactic strategie. Deze gegevens geldt voor kleine doolhof met een diameter van 69 cm en een 15 cm wand-omgeving. Echter, muizen getest op een groot labyrint zonder muren of intramaze signalen, zoals onze instelling (diameter 120 um) op betrouwbare wijze bewijs voor het gebruik van hoofdzakelijk buiten maze visuele signalen (zie bijvoorbeeld Bach et al.., Cell. 81 bijv. door microstructuur verschillen voorkomen, werd de plaat gedraaid na elk experiment.

De gedragstest kan eenvoudig worden aangepast voor het onderzoeken van de invloed van andere transcriptiefactoren op volwassen hippocampus neurogenese, met behulp van geschikte muismodellen. Het is echter vooral bedoeld om DG-afhankelijk leren (ruimtelijk patroon scheiding) te testen, en mogelijk niet geschikt voor het onderzoek van neurogenese en neuronale degeneratie in andere gebieden van de hersenen zijn. In dit opzicht is het gebruik van SPS-BM verder beperkt door de DG-specificiteit (strikte afhankelijkheid van een functioneel circuit tussen EC II en DG en CA3 en CA1 en EG VI), en mag daarom niet worden toegepast voor het onderzoeken van taken die betrekking de monosynaptic EC III - CA1 - EC V - circuit.

Toekomstige toepassingen van de hierin beschreven werkwijzen kunnen omvatten onderzoeken naar effecten stamceltransplantaties, farmaceutische behandelingen op volwassen hippocampus neurogenese, en weefsel homeostase in de hippocampus.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Moria MC17 Perforated Spoon	FST	10370-18	removal of the brains
Dissecting microscope	Carl Zeiss	Stemi SV8	removal of the brains
Surgical scissors	FST	14084-08	removal of the brains
Surgical scissors	FST	14381-43	removal of the brains
Dumont #5 forceps	FST	11254-20	removal of the brains
SuperFrost Slides	Carl Roth	1879	slides for immunohistochemistry
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	fixative
TissueTek OCT compound	Sakura Finetek	1004200018	embedding of the brains
Normal Goat Serum	Jackson Immunolabs	005-000-001	blocking in IHC
Normal Rabbit Serum	Jackson Immunolabs	011-000-001	blocking in IHC
Normal Donkey Serum	Jackson Immunolabs	017-000-001	blocking in IHC
anti-Neurofilament-M antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	2H3	IHC, Dilution 1:200
anti-Doublecortin antibody	sc-8066	Santa Cruz	IHC, Dilution 1:800
anti-GFP antibody	Abcam	ab290	IHC, Dilution 1:2,000
anti-BrdU antibody	OBT0030G	Accurate Chemicals	IHC, Dilution 1:2,000
Fluoro-Jade C	FJ-C	HistoChem	Determination of neuronal cell death
Betadine	Mundipharma	D08AG02	disinfectant
Cryomicrotome	Leica	CM1900	preparation of brain slices
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H3393	perfusion
Circular plate made from hard-plastic (diameter 120 cm)	lab made	none	plate for SPS-BM, diameter 120 cm
Buraton rapid disinfectant	Schülke Mayr	113 911	disinfectant
Video-tracking system TSE VideoMot 2 with Software Package VideoMot2	TSE Systems	302050-SW-KIT	tracking and analysis of SPS-BM
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787	permeabilization/IHC
Cryotome	Reichert Jung/Leica	Frigomobil 1206	preparation of 40 µm brain slices
Mowiol 4-88	Carl Roth	Art.-Nr. 0713	embedding of the slides
SYTOX green	Invitrogen	S7020	Nuclear staining
Food pellets (Kellog`s Froot Loops)	Kellog`s		SPS-BM
Prism, Version 3.0	Graph Pad Software, San Diego, USA		Statistical evaluation of SPS-BM
Zen 2008 or Zen 2011 Software	Carl Zeiss		Software (Confocal microscope)
D.P.X	Sigma-Aldrich	317616	mounting medium for Fluoro-Jade C staining