Summary
وصفت وسائل للتلاعب وتحليل NF كيلوبايت التي تعتمد على تكوين الخلايا العصبية الحصين الكبار. ويرد بروتوكول مفصلة لاختبار تعتمد على التلفيف المسنن السلوكية (وهو ما يسمى نمط المكاني فصل بارنز متاهة) للتحقيق في نتائج المعرفية في الفئران. هذا الأسلوب من شأنه أن يساعد أيضا تمكين التحقيقات في إعدادات التجريبية الأخرى.
Abstract
الحصين يلعب دورا محوريا في تشكيل وترسيخ ذكريات العرضية، والتوجه المكاني. تاريخيا، تم استعراض الحصين الكبار كمنطقة تشريحية جامدة جدا للدماغ الثدييات. ومع ذلك، فقد أظهرت النتائج الأخيرة التي التلفيف المسنن لقرن آمون هو مجال اللدونة هائلة في البالغين، والتي تنطوي ليس فقط إدخال تعديلات على الدوائر العصبية الموجودة، ولكن أيضا تكوين الخلايا العصبية الكبار. وينظم هذا اللدونة عن طريق الشبكات النسخي المعقدة، التي عامل النسخ NF كيلوبايت يلعب دورا بارزا. لدراسة والتلاعب تكوين الخلايا العصبية الكبار، نموذج الفأر وراثيا لتثبيط الدماغ الأمامي محددة العصبية النشاط NF كيلوبايت يمكن استخدامها.
في هذه الدراسة، وصفت وسائل لتحليل الخلايا العصبية NF كيلوبايت تعتمد، بما في ذلك جوانبه الهيكلية وموت الخلايا المبرمج العصبية وانتشار السلف، وأهميتها المعرفية، whicتم تقييم ح تحديدا عبر التلفيف المسنن (DG) التي تعتمد على اختبار السلوكية، ونمط المكاني فصل بارنز متاهة (SPS-BM). بروتوكول SPS-BM يمكن تكييفها لمجرد استخدام مع النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا أخرى مصممة لتقييم تأثير جينات معينة على تكوين الخلايا العصبية الحصين الكبار. علاوة على ذلك، SPS-BM يمكن استخدامها في إعدادات التجريبية الأخرى التي تهدف إلى التحقيق والتلاعب التعلم DG-تعتمد، على سبيل المثال، وذلك باستخدام وكلاء الدوائية.
Introduction
وجوديا، وقرن آمون هو واحد من أقدم الهياكل التشريحية في الدماغ المعروفة. أنها مسؤولة عن المهام المعقدة المتنوعة، مثل وظائف محوريا في تنظيم الذاكرة طويلة المدى، والتوجه المكاني، وتشكيل وتوطيد الذاكرة منها. تشريحيا، ويتألف من طبقات الحصين الخلايا الهرمية (الطبقة الهرمية) بما في ذلك قرن آمون (CA1، CA2، CA3، وCA4) والمناطق التلفيف المسنن (التلفيف المسنن)، الذي يحتوي على الخلايا الحبيبية وعدد قليل من الأسلاف العصبية داخل منطقته جزئي التحبب . المشروع الخلايا الحبيبية تجاه المنطقة CA3 عبر ما يسمى الألياف المطحلب (محاور الخلايا الحبيبية).
حتى نهاية القرن الماضي، وكان يعتقد أدمغة الثدييات الكبار ليكون جهازا ثابتة تفتقر إلى اللدونة الخلوية وتكوين الخلايا العصبية. ومع ذلك، خلال العقدين الماضيين، كمية متزايدة من الأدلة يدل بوضوح على تكوين الخلايا العصبية الكبار التي تجري في ما لا يقل عنمناطق الدماغ، وهما منطقة subventricular (SVZ) والمنطقة جزئي التحبب من قرن آمون.
لدينا دراسات سابقة، وتلك من المجموعات الأخرى، أظهرت أن عامل النسخ NF كيلوبايت هي واحدة من المنظمين الجزيئية الحاسمة لتكوين الخلايا العصبية الكبار، وأن نتائج إلغاء التنظيمات في قرن آمون العيوب الهيكلية الحادة وإدراكيا 1-6. NF كيلوبايت هو اسم عام لعامل النسخ محرض تتألف من مجموعات مختلفة من مثنوي خمس مفارز الحمض النووي ملزم: P50، P52، ج، الرطوبة، RelB، وP65 (RELA)، وهذه الأخيرة ثلاثة من التي لديها المجالات transactivation. داخل الدماغ، الشكل الأكثر وفرة وجدت في السيتوبلازم هو مغاير للP50 P65 والتي يتم الاحتفاظ بها في شكل غير نشط من قبل المانع من كابا B (IκB) البروتينات.
لدراسة ومعالجة مباشرة تكوين الخلايا العصبية NF كيلوبايت يحركها، ونحن نستخدم نماذج الماوس المعدلة وراثيا لتمكين تثبيط بسيطة من كل من subun NF كيلوبايتلها، وتحديدا في الدماغ الأمامي 7 (انظر الشكل 1). لهذا الغرض، ونحن عبور لدت-خطوط الماوس المعدلة وراثيا التالية، IκB / - و-/tTA. تم إنشاء خط باستخدام متحولة السلبية عبر المهيمن NF-كيلوبايت المانع IκBa (فائقة قامع IκBa-AA1) 8 - وIκB المعدلة وراثيا /. وعلى النقيض من النوع البري IκBα، IκBα-AA1 اثنين من بقايا سيرين تحور إلى alanines (V32 V36 و)، والتي تعيق الفسفرة وتدهور proteasomal لاحقة من المانع. للعصبون الدماغ الأمامي محددة التعبير عن IκBa-AA1-التحوير، IκB / - تم الفئران ولدت المتبادل مع الفئران بايواء كيناز الكالسيوم كالمودولين التي تعتمد IIα (CAMKIIα) المروج التي يمكن أن تكون مدفوعة من قبل التتراسيكلين عبر المنشط (TTA) 9.
P65 الفئران خروج المغلوب لها النمط الظاهري الجنينية قاتلة بسبب موت الخلايا المبرمج الكبد ضخمة 10، وبالتالي فإن النهج هو موضح هنا يوفر طريقة أنيقةللتحقيق في دور NF كيلوبايت في تكوين الخلايا العصبية بعد الولادة والكبار.
وقد وصفت الاختبار السلوكية الكلاسيكية لدراسة التعلم والذاكرة المكانية في 1980s من قبل ريتشارد موريس، وهو اختبار المعروفة باسم موريس المياه متاهة (MWM) 11. في هذا المجال المفتوح المياه متاهة، الحيوانات تتعلم من الفرار من المياه مبهمة على منصة مخفية على أساس الميول وخارج المتاهة العظة. متغير الجافة من MWM هو ما يسمى متاهة بارنز (BM) 12. هذا الاختبار يستخدم لوحة دائرية مع 20 حفرة دائرية رتبت على الحدود من لوحة، مع واحد ثقب يعرف بأنه مربع الهروب، والعظة من خارج المتاهة البصرية لتحديد اتجاهاتها. كلا نماذج تجريبية تعتمد على سلوك طيران الناجمة عن القوارض سيصدره النفور من الماء، أو مفتوحة، ومساحات مضيئة الزاهية. الاختبارين السماح بإجراء تحقيق من التوجه المكاني، وأداء الذاكرة ذات الصلة. على الرغم من أن الحصين يلعب دورا العامة والأساسية في تشكيل الذاكرة المكانية، ص الحصينegions تشارك تختلف تبعا لاختبار تطبيقها. الذاكرة اختبارها في BM تنشأ من نشاط الخلايا العصبية بين القشرة enthorinal (EC) والخلايا العصبية الهرمية الموجودة في CA1-منطقة قرن آمون دون مساهمة DG 13-16. على وجه الخصوص، BM الكلاسيكية تعتمد بشكل رئيسي على الملاحة عبر الممر-الصدغي ammonic الأحادي المشبك من EC الثالث لCA1 لEC خامسا الأهم من ذلك، DG تشارك بشكل حاسم في ما يسمى نمط الاعتراف المكانية 17، وهو ما يعني ضمنا ليس فقط معالجة المعلومات البصرية والمكانية، ولكن أيضا تحويل بيانات أو ذكريات مماثلة في متباينة، تمثيلات غير المتداخلة. هذه المهمة تتطلب الدوائر ثلاثي متشابك وظيفية من EC DG الثاني للCA3 لCA1 وEC السادس، والتي لا يمكن اختبارها في BM 15.
للتصدي لهذه التحديات، ونحن قد وضعت SPS-BM بمثابة اختبار لاختبار السلوكية على وجه التحديد التي تعتمد على التلفيف المسنن في الأداء الإدراكي المشتركالحيوانات ntrol، وفي IκB / TTA نموذج فائقة قامع التالية NF كيلوبايت تثبيط. الأهم من ذلك، وعلى النقيض من MWM أو BM، يمكن للSPS-BM تكشف العجز السلوكية الناتجة عن انخفاض القيمة خفية من الخلايا العصبية. منذ المكانية ونمط الفصل يعتمد بشكل صارم على دائرة وظيفية بين EC II وDG وCA3 وCA1 وEC السادس، وهذا الاختبار هو حساسة للغاية للتغيرات المحتملة في تكوين الخلايا العصبية، إدخال تعديلات على مسار الألياف المطحلب أو تغيرات في توازن الأنسجة داخل DG.
من الناحية الفنية، ويستند انشاء الاختبار لدينا في الدراسة التي Clelland وآخرون، حيث تم اختبار نمط الفصل المكاني باستخدام خشبية 8 الذراع ذراع شعاعي المتاهة (RAM) 19. لدينا في تعديل مجموعة المتابعة، تم استبدال ثمانية السلاح من قبل سبع متطابقة المنازل الغذاء الأصفر. وباختصار، فإن الأساليب هو موضح هنا، بما في ذلك تحليل (DCX +) الخلايا، معربا عن doublecortin داخل الحصين، والتوقعات الألياف المطحلب، خلية العصبية دياته وعلى وجه الخصوص قدمت SPS-BM هنا، يمكن تطبيقها على التحقيقات في نماذج الماوس الأخرى دمج الجينات المحورة التي لها تأثير على تكوين الخلايا العصبية الكبار. ويمكن أن تشمل التطبيقات مزيد من الدراسة من وكلاء الدوائية وقياس أثرها على DG والمكانية فصل النمط.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بيان الأخلاق
وقد أجريت هذه الدراسة وفقا للوائح صارمة للجنة رعاية الحيوان واستخدام الحكومية، LANUV من ولاية شمال الراين وستفاليا، (دوسلدورف، ألمانيا). تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل LANUV، دوسلدورف تحت الرخصة رقم 8.87-51.04.20.09.317 (LANUV، NRW). تم بذل جميع الجهود للحد من الاستغاثة وعدد الحيوانات اللازمة للدراسة.
1. رعاية الحيوان والإسكان
- يجب أن تبقى جميع الحيوانات المستخدمة في بروتوكولات الموصوفة هنا تحت ظروف معينة خالية من مسببات الأمراض، على النحو المحدد من قبل جمعية الاتحاد الأوروبي مختبر علم الحيوان (FELASA).
- يجب أن تبقى الفئران في أقفاص القياسية في درجة الحرارة والرطوبة التي تسيطر عليها (22 ° C) غرفة تحت ظروف نهاري (12 ساعة ضوء / دورة الظلام) مع HEPA تصفية الهواء.
- وينبغي توفير الغذاء والماء بالمال وبالشهرة أيضا موحدة الإعلان. </ لى>
- إذا IκB / TTA وIκB / - تستخدم السيطرة على الفئران، يجب أن يتم تنفيذ التنميط الجيني PCR القائم لكل حيوان، كما هو موضح في 7 و 18.
- الحيوانات الذكور مع فارق السن أقل من أربعة أيام يجب أن يتم استخدامها للحد من تقلب الفردية.
- (اختياري): لNF كيلوبايت التجارب تنشيط، يجب أن تدار الدوكسيسيكلين في مياه الشرب (2 ملغ / مل مع 2.5٪ سكروز) لمدة 14 يوما على الأقل.
2. نمط المكاني فصل بارنز المتاهة (SPS-BM)
- وينبغي إجراء جميع الاختبارات السلوكية وفقا للمبادئ التوجيهية الدولية والمحلية.
- هام! فقط استخدام الفئران الذكور مع سن ستة أشهر أو أكثر. فارق السن بين الحيوانات من سلسلة اختبار واحد ينبغي أن يكون أقل من أربعة أيام. يجب إجراء اختبار من قبل نفس المشغل لكل سلسلة. الفئران يجب أن يحصل على نظاما غذائيا عاديا قبل الاختبار لزيادة الدافع مدفوعة جزئيا كماweet مكافأة الغذاء.
- إعداد لوحة دائرية بيضاء مصنوعة من البلاستيك الصلب (قطر 120 سم، انظر الشكل 5A) في والرطوبة غرفة التحكم في درجة حرارته (22 درجة مئوية)، مع مضيئة لا يقل عن 4 × 80 واط و 3 × 215 W مصابيح الفلورسنت النيون . هام! ضمان يتم استخدام الإضاءة الصحيحة، والدافع من الفئران لدخول المنازل الغذاء مدفوعة جزئيا كرههم للمشرق، والأماكن المكشوفة.
- إعداد نظام الفيديو تتبع. ينبغي أن توضع الكاميرا 115 سم فوق وسط لوحة (انظر الشكل 5A).
- نعلق متعددة الالوان العظة خارج المتاهة (EMC) على قطعة قماش بيضاء اللون في المناصب بسهولة للحيوانات، ما يقرب من 100 سم من الحدود من لوحة (انظر الشكل 5A) مرئية.
- تنظيف بعناية لوحة بمطهر السريع الذي يمكن أن يزيل أي رائحة من التجريبية مجموعة المتابعة.
- وضع سبع متطابقة المنازل الأصفر الطعام (12 سم × 7 سم × 8 سم، انظر الشكل 5A الشكل 5A).
- وضع الحلو المكافآت الغذاء بيليه (ربع منزل Froot حلقة / الغذاء Kellogs سيصدره) داخل كل البيوت الغذاء على مواقع محددة (انظر الشكل 5A) واحد فقط مع بيت الغذائية المحددة التي يمكن الوصول إليها بحرية للحيوان (الموقع F، انظر الشكل 5A ). إغلاق المنازل الغذائية غير المستهدفة مع رقائق شفافة.
- قبل إجراء الاختبار، نفذ التعود (قبل بدء المهمة يوم واحد). جعل جميع المنازل الغذائية المتاحة بحرية والسماح للفئران لاستكشاف متاهة بحرية واسترداد مكافأة الغذاء بيليه (10 دقيقة / الحيوان).
- تبديل جهاز الكمبيوتر والكاميرا والبدء في برنامج نظام الفيديو تتبع.
- بدء التسجيل.
- وضع الحيوان في نقطة بداية محددة على لوحة دائرية (الشكل 5A، S: بدء الموقف) والسماح الفئران للبحث عن منزل الغذائية المستهدفة لمدة 10 دقيقة.
- ستوع وتتبع الفيديو.
- هام! تنظيف لوحة دائرية والمنازل الطعام بعد كل محاكمة مع مطهر سريع.
- كرر الاختبار يوميا لمدة سبعة أيام متتالية (لكل حيوان).
- تحليل النتائج (الكمون، والمسافة المقطوعة والأخطاء) باستخدام برنامج الإحصاءات المناسبة. تحديد الأخطاء كما يقترب من بيت الغذائية الخاطئة و / أو الاتصال مع مربع السليم دون إدخال واسترجاع المكافأة بيليه الغذاء. لتحليل مجمعة استخدام اتجاهين أنوفا مع Bonferroni اختبار بعد مخصصة.
- (اختياري) التضحية الفئران وتحليل الحصين كما هو موضح أدناه.
3. BrdU وصفها
- حقن الغشاء البريتونى 50 ملغ / كغ الملكية الفكرية BrdU مرة واحدة يوميا لمدة 3 أيام (تحليل التفاضل والتكامل) أو 200 ملغ / كغ الملكية الفكرية لحقنة واحدة (تحليل الانتشار).
- تضحية الحيوانات، تشريح الحصين وإعداد 40 ميكرومتر أقسام كما هو موضح أدناه.
- Denaturate وأقسام مع 2 M حمض الهيدروكلوريك لمدة 10 دقيقة واحتضان في 0.1 م العازلة بورات لمدة 10 دقيقة.
- تسمية سلسلة واحدة في واثني عشر من 40 ميكرومتر أقسام (240 ميكرون بعيدا) من كل حيوان immunohistochemically، كما هو موضح أدناه باستخدام الأجسام المضادة الموجهة ضد BrdU.
- تحديد الخلايا المسمى عن طريق التحليل المجهري متحد البؤر في جميع أنحاء مدى rostrocaudal من طبقة الخلايا الحبيبية ومنطقة جزئي التحبب. مضاعفة الأرقام الناتجة بنسبة 12 في الحصول على العدد الإجمالي المقدر للخلايا المسمى BrdU في قرن آمون والقسمة على اثنين للحصول على العدد الكلي للخلايا المسمى في DG.
4. إزالة المخ وإعداد Cryosections من Nonperfused الحيوانات
- مراقبة الإجراءات المعتمدة محليا القتل الرحيم الحيوانات. الفئران قد يتم التخلص مباشرة من قبل خلع عنق الرحم.
- (اختياري) الحيوانات يمكن تخدير قبل euthanization فقا للمبادئ التوجيهية المحلية والدولية، مثلا عن طريق inje داخل الصفاقكشن من 0.8 مل آفيرتين ل33 غرام الماوس (تقدم طازجة عن طريق خلط 150 مل حل الأسهم مصنوعة من 2.2 ملغ 2،2،2-ثلاثي بروم إيثانول في 1 مل أيزو أميلي الإيثانول مع 1.85 مل من المياه المالحة أو العازلة الفسيولوجية).
- تعقيم الرأس مع بتدين (10٪ بوفيدون اليود) غارقة الشاش ومسحة في وقت لاحق مع الشاش غارقة في الايثانول 70٪.
- قطع رأس الحيوان باستخدام مقص جراحي المناسبة وسحب الجلد جانبا.
- (اختياري) التبعي يمكن تطبيقها لتجنب للطي الخلفي من الجلد المتخلفين.
- جعل شق خط الوسط في الجمجمة وسحب بعناية شظايا الجمجمة جانبا.
- إزالة بعناية الدماغ كله باستخدام أداة جراحية المناسبة (مثل موريا ملعقة).
- Precool 25 مل من 2 methylbutane في 50 مل دورق (مثل شوت دوران) إلى -30 إلى -40 درجة مئوية على الثلج الجاف.
ملاحظة: للحصول على تلطيخ التعويم الحر المقاطع "سميكة" والتي هي مناسبة بشكل مثالي لمتحد البؤر المسح المجهري بالليزر، وإزالة المخ، ويغسل 3مرات في المخزن وتخزينها في 4 درجات مئوية في الفوسفات مخزنة 30٪ محلول السكروز في أنبوب 50 مل حتى غرقت الدماغ أسفل إلى أسفل (عادة بين عشية وضحاها). - وضع بعناية الدماغ على قطعة من Nescofilm (Parafilm)، وتغطي مع كمية وافرة من TissueTek أكتوبر مركب، وتجميد Nescofilm في 2-methylbutane، مخزن في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
ملاحظة: للحصول على تخزين لفترة طويلة في -20 درجة مئوية في مخزن 9٪ سكروز، 7 ملم MgCl 2، 50 ملي العازلة الفوسفات، 44٪ الجلسرين. - قطع الدماغ إلى 10-12 ميكرومتر أقسام سميكة على cryomicrotome المناسبة.
ملاحظة: للحصول على والمقاطع التعويم الحر سميكة، وتجميد الدماغ على مبضع بردي مرحلة مبضع بردي المناسبة (على سبيل المثال رايشرت جونغ، Frigomobil.) وخفض 40 ميكرومتر أقسام أفقية في -20 ° إلى - 25 درجة مئوية. جمع المقاطع من سكين مع فرشاة غرامة، وجمع في المخزن أو الاحتفاظ بها في حل التخزين (الخطوة 4.9) في -20 درجة مئوية لمدة التخزين لفترة طويلة. - جبل بعناية شريحتين على الشرائح المجهر واحدة. ولناينصح بشدة (ه) من الشرائح Superfrost UltraPlus لتعظيم التصاق من الأقسام.
- تجفيف الشرائح لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ويمكن تخزين الشرائح في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
5. إعداد أقسام من الحيوانات Perfused
- تخدير الحيوانات كما هو موضح أعلاه (الخطوة 4.2).
- يروي بعناية الحيوان transcardially مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي تحتوي على الهيبارين (0.025 g/100 مل PBS) وبروكايين (0.5 g/100 مل PBS) لمدة 2-4 دقيقة، تليها بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 10-15 دقيقة . يتم تنفيذ نضح على النحو الأمثل من قبل perfusing عبر البطين الأيسر وفتح الأذين الأيمن باستخدام الضغط الهيدروليكي من حوالي 1،2-1،4 متر أو باستخدام مضخة تحوي مجموعة إلى ما يقرب من 15 مل / دقيقة. النتائج نضح الأمثل في الدماغ الأبيض الشاحب مع عدم وجود الأوعية الدموية الحمراء كونها مرئية.
- تشريح وإصلاح آخر، العقل المدبر في بارافورمالدهيد 4٪ عند 4 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
- البردحماية أدمغة في 30٪ سكروز في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية لمدة لا تقل عن 24 ساعة.
- تجميد العقول على الساحة مبضع بردي.
- إعداد 40 ميكرومتر أقسام أفقية من forebrains بأكملها باستخدام مبضع بردي المناسبة.
- ويمكن تخزين الشرائح في حل cryoprotectant (0.1 M العازلة الفوسفات، و 50٪ الجلسرين، 0.14٪ MgCl 2، 8.6٪ سكروز) في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
6. المناعية من أقسام الدماغ من Nonperfused الحيوانات
- بعد إصلاح cryosections، أعد كما هو موضح أعلاه، وذلك باستخدام -20 درجة مئوية الميثانول الباردة لمدة 10 دقيقة.
- منع مع 5٪ مصل العادية تحتوي على 0.3٪ تريتون-X (من الأنواع التي كانت تستخدم لرفع الأجسام المضادة الثانوية) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- شطف 3X مع برنامج تلفزيوني 1X واحتضان مع الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- شطف 3X مع برنامج تلفزيوني 1X واحتضان مع الأجسام المضادة الثانوية في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.
- شطف 3X مع برنامج تلفزيوني 1X
- فصول التوجيه الجامعيnterstain قسم لالحمض النووي باستخدام SYTOX الأخضر، أو دابي (أو صبغ الحمض النووي البديلة).
- شطف 3X مع برنامج تلفزيوني 1X
- تضمين المقاطع في تضمين مائي المتوسط.
- السماح للمتوسطة تضمين تتبلمر لمدة 48 ساعة على الأقل.
7. المناعية من أقسام الدماغ من Perfused الحيوانات
- كتلة كما هو موضح في الخطوة 6.2 و في وقت لاحق احتضان أقسام الدماغ ثابتة في حل الأجسام المضادة الأولية مخففة في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.3٪ تريتون-X (مجاني العائمة) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- شطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X واحتضان في حل الضد الثانوية مخففة في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.3٪ تريتون-X (التعويم الحر) في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 ساعة.
- شطف 3X مع برنامج تلفزيوني 1X
- مباين لقسم الحمض النووي باستخدام SYTOX الأخضر أو دابي (أو صبغ الحمض النووي البديلة).
- شطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X
- تضمين المقاطع في تضمين مائي المتوسط.
- السماح للبلمرة المتوسطة التضمين لر الأقل 48 ساعة.
8. التحقيق في التوقعات موسي الألياف
- تضحية الحيوانات، وإعداد 40 ميكرومتر المقاطع الاكليلية كما هو موضح أعلاه وصمة عار على القسم الحصين باستخدام الأجسام المضادة لخيط عصبي M.
- مسح الأقسام في الطول الموجي المناسب باستخدام المجهر متحد البؤر المسح الضوئي ليزر لتصور الألياف المطحلب ونوى. بدء المسح الضوئي في التكبير المنخفض.
- استخدام الصور التكبير منخفضة للتوجيه واستهداف الحصين مع التوقعات الألياف المطحلب.
- مسح المقاطع (ض باجتزاء) بدقة عالية وتضخم عالية.
- تحليل مظهر المورفولوجية والاتصال من الألياف المطحلب تصور عبر تلطيخ لNF-M.
- (اختياري) تحليل حجم وحجم شفرات الحصين. استخدام الحمض النووي لإشارة القياسات.
9. الفلورية اليشم C الفحص (موت الخلية العصبية)
- تضحية الحيوانات، تشريح hippocampus، وإعداد 12 ميكرومتر أقسام كما هو موضح أعلاه.
- السماح للأقسام تجف لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إصلاح المقاطع في PFA 4٪ لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- لفترة وجيزة غسل 3X مع المقاطع [ده 2 O.
- احتضان المقاطع مع 0.06٪ برمنجنات البوتاسيوم (KMnO 4) لمدة 10 دقيقة تحت المستمر، والهز لطيف.
- غسل المقاطع 3x أخرى مع [ده 2 O.
- احتضان المقاطع مع 0.002٪ الفلورية اليشم C الحل لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- (اختياري) لstainings النووية في وقت واحد، 0.002٪ الفلورية اليشم C الحل يمكن أن تستكمل مع 10 ميكروغرام / مل دابي.
- لفترة وجيزة غسل 3X مع المقاطع [ده 2 O.
- السماح للأقسام تجف لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان المقاطع مع الزيلين (1 دقيقة)
- تحميل المقاطع باستخدام وسيلة تصاعد مقرها الزيلين (DPX).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
التهجين من IκB / - وTTA خطوط الماوس المعدلة وراثيا يؤدي إلى تثبيط النشاط الشرطي NF كيلوبايت في قرن آمون.
للتحقيق في التعبير عن IκBα-AA1-التحوير في مضاعفة المعدلة وراثيا الماوس (الشكل 1A)، تم عزل العقول، cryosectioned والملون باستخدام الأجسام المضادة ضد GFP (بروتين الفلورية الخضراء). كشفت متحد البؤر المسح المجهري بالليزر التعبير عالية من التحوير في المناطق CA1 CA3 و، وفي DG (الشكل 1B).
وأعرب التحوير IκBα-AA1 في الأسلاف نوع-2B، وتنشط في الدول غير ناضجة والمتوسطة في الخلايا الحبيبية ناضجة.
لتحديد أقرب نوع من الخلايا معربا عن CAMKIIα يحركها IκBα-AA1 في المنطقة العصبية قرن آمون، كانت ملطخة cryosections من الحصين من الحيوانات IκB / TTA لdoublecortin(DCX) والتحوير (GFP). وكشف تحليل متحد البؤر إشارات GFP في الخلايا الحبيبية DCX إيجابية الشباب، مشيرا إلى تحريض التعبير عن التحوير من قبل CAMKIIα النشاط (الشكل 2، والسهام).
العصبية NF كيلوبايت تثبيط عبر IκBα-AA1 يقلل التوقعات الألياف المطحلب، وسمك وحجم DG.
كانت ملطخة الفئران لخيط عصبي M (NF-M) لتصور التوقعات الألياف المطحلب، وتكشف منظمة معقدة وحزمي (الشكل 3) - أقسام الاكليلية من الحصين من IκB / TTA وIκB /. في الفئران IκB / TTA، وضعف التوقعات الألياف المطحلب بشدة. بالإضافة إلى ذلك، أدى NF كيلوبايت تثبيط لسمك شفرة suprapyramidal انخفاض كبير وحجم أصغر DG (الشكل 3B).
تثبيط الخلايا العصبية من NF كيلوبايت في الفئران IκB / TTA يؤدي إلى ارتفاع ديجين العصبيةالمساع، وزيادة تكوين الخلايا العصبية، والهجرة بالانزعاج من الأسلاف، معربا عن DCX.
لدراسة أسباب محتملة للعيوب هيكلية دراماتيكية، طازجة، وكانت ملطخة شرائح الحصين غير المثبتة من الفئران IκB / TTA مع الفلورية اليشم C، والذي يسمح للكشف محددة من موت الخلايا العصبية (الشكل 4A). هنا، شوهد عدد من neurites التي زادت بشكل كبير المنحطة في الحيوانات المعدلة وراثيا مزدوجة، مقارنة مع الضوابط المعدلة وراثيا واحد. علاوة على ذلك، تم الكشف عن زيادة كبيرة في الخلايا المشقوق كاسباس 3 أفكارك الإيجابية في الفئران IκB / TTA. على النقيض من ذلك، وتلطيخ المناعى ضد DCX كشفت زيادة كبيرة مبالغ DCX + الخلايا في أدمغة الفئران IκB / TTA. علاوة على ذلك، لم يتم الترتيب لDCX + الخلايا في IκB / TTA-الحصين حصرا في منطقة جزئي التحبب، ولكن تم العثور أيضا في مناطق أعمق من DG (الشكل 4B)، في حين أن DCX +-الأسلاف طن تم المترجمة الحيوانات السيطرة تقريبا على وجه الحصر داخل المنطقة جزئي التحبب. لاختبار ما إذا كانت زيادة كمية خلايا DCX، معربا عن هو نتيجة لنضوج الأسلاف في وقت سابق أو مباشرة بسبب انتشار DCX + الخلايا، تم حقن BrdU في الحصين من IκB / TTA والسيطرة الفئران، والتي كانت ثم cryosectioned وملطخة DCX وBrdU (الشكل 4). لتحليل الانتشار، تم حقن BrdU مرة واحدة (انظر الشكل 4B، مخطط)، تليها التحليل بعد 24 ساعة. لتحليل التمايز، وأجريت ثلاث حقن يوميا، تليها تحليل بعد سبعة أيام. بعد BrdU-حقنة واحدة، لم يلاحظ أي فروق ذات دلالة إحصائية في العدد الكلي للخلايا BrdU إيجابية بين IκB/tTA- والحيوانات السيطرة، في حين كشفت المسلسل الحقن النهج الثلاثة مبلغ الزيادة بشكل واضح من BrdU / DCX + الخلايا في DG من الفئران IκB / TTA. هذا يشير إلى أن التمايز بالانزعاج أو دمج DCX السابقينقد يكون تسبب خلايا الضغط على أعداد متزايدة من DCX + الخلايا، ويشير إلى أن نوع 3 خلايا شاركوا.
تثبيط الخلايا العصبية من نتائج NF كيلوبايت في عيوب التعلم الشديدة، كما يتضح من نمط المكاني فصل بارنز متاهة الاختبار. خصيصا لاختبار سلوك الفئران المعدلة وراثيا مزدوجة في مهمة DG-تعتمد، استخدمنا SPS-BM، حيث الحيوانات يجب أن نفرق بين المواقع مع الفروق الدقيقة (الشكل 5). في هذا الاختبار السلوكية، وIκB / - استكشاف الحيوانات السيطرة المنازل الغذائية متسلسل في اليوم الأول من التجربة (الشكل 5). بعد سبعة أيام من التدريب، وكانوا قادرين على العثور على منزل مفتوح عن الطعام بشكل مباشر على الحيوانات. على النقيض من ذلك، واصلت الحيوانات IκB / TTA لاستكشاف المنازل الغذائية متسلسل، حتى بعد التدريب (الشكل 5B). مراقبة زيادات كبيرة في المسافات المقطوعة، والإختفاء العالي وإيهمعدلات ROR في الحيوانات IκB / TTA، مقارنة مع IκB / - حيوانات السيطرة، يشير إلى أن هذه الحيوانات كان العيوب التعلم الشديدة (الشكل 5C).
الشكل 1. جيل من تثبيط الدماغ الأمامي محددة مشروطة النشاط NF كيلوبايت. A. التخطيطي الرسم من النماذج المعدلة وراثيا المستخدمة لدراسة دور NF كيلوبايت في تكوين الخلايا العصبية الحصين الكبار. الكالسيوم التي تعتمد على كالمودولين كيناز IIα (CAMKIIα) يحركها المروج التتراسيكلين transactivator استخدمت (TTA) الفئران لتنظيم تعبير عن متحولة السلبية عبر المهيمنة IκBa (IκBa-AA1 فائقة كاظمة في IκB الفئران) جنبا إلى جنب مع بروتين الفلورية الخضراء التتبع (GFP). في الفئران IκB / TTA، يتم الاحتفاظ NF كيلوبايت في السيتوبلازم في ستا لغير نشطالشركة المصرية للاتصالات عن طريق nondegradable IκBa-AA1، التي يمكن الكشف عنها عن طريق GFP مضان. تثبيط يمكن عكسه من الدوكسيسيكلين، والذي يحول دون نقل واكتساب التكنولوجيا. التحوير التعبير B. الممثل في مناطق مختلفة من الفئران الحصين IκB / TTA (CA1، CA3 وDG). أعدت Cryosections من أدمغة معزولة من IκB / - وIκB / TTA الفئران، وكانت ثابتة وملطخة باستخدام الأجسام المضادة ضد GFP. لاحظ أن يتم التعبير عن التحوير للغاية داخل DG. دي: التشعبات، DG: التلفيف المسنن، ML: الطبقة الجزيئية؛ SL: الطبقة الصافية. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الشكل 2. يتم التعبير عن التحوير IκBa-AA1 في DCX إيجابية، نوع-2B progenit الأملاح وتنشط في مزيد من الدول المتوسطة والخلايا الحبيبية ناضجة. الحصين A. Cryosectioned الحيوانات IκB / TTA مع doublecortin (DCX) وتلطيخ GFP التعبير تكشف عن التعبير عن التحوير في الخلايا الحبيبية DCX إيجابية الشباب (السهام). DG: التلفيف المسنن، ML: الطبقة الجزيئية B. التخطيطي الرسم التعبير التحوير في مراحل النمو المختلفة أثناء التطور الخلية الحبيبية. تم الكشف عن IκBa-AA1 التحوير التعبير في DCX إيجابية، الأسلاف نوع-2B، جميع الدول غير ناضجة والمتوسطة في الخلايا الحبيبية ناضجة. على النقيض من ذلك، لم النوع 1 والنوع-2A الأسلاف في وقت مبكر (التي تفتقر إلى DCX-التعبير) لا تعبر عن التحوير، وكان ذلك لا تتأثر NF كيلوبايت تثبيط. تعديل بعد Kempermann آخرون 20 اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الرقم 3. NF كيلوبايت تثبيط يؤدي إلى ضعف التوقعات الألياف المطحلب وسمك DG تخفيض وحدة التخزين في الفئران IκB / TTA، مقارنة مع السيطرة المعدلة وراثيا واحد (IκB / -). A. المناعية من الحصين cryosectioned لM خيط عصبي (NF-M) لتصور التوقعات الألياف المطحلب. في السيطرة على الفئران (IκB / -)، وهي منظمة معقدة وحزمي من الألياف المطحلب ربط الخلايا الحبيبية إلى الخلايا المستهدفة في CA3 هو واضح، والتي كان ضعاف بعد تثبيط الخلايا العصبية من NF كيلوبايت في الفئران IκB / TTA. علاوة على ذلك، أدى التعبير عن فائقة قامع لسمك انخفاض كبير suprapyramidal شفرة (قارن سهم في لوحة اليسار واليمين) وحجم DG تقلص. B. الكمي والتحليل الإحصائي من العيوب الهيكلية الناجمة عن NF كيلوبايت تثبيط. المفردة اختبار t، الذيل يومين. بيانات مأخوذة من الإصدار OA من Imielski وآخرون. 2 اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الشكل 4. تثبيط NF كيلوبايت في الفئران IκB / TTA يؤدي إلى زيادة فاة الخلايا العصبية الخلية، وتعزيز تكوين الخلايا العصبية، ونمط الهجرة بالانزعاج من الخلايا DCX، معربا عن. A. العصبية محددة الفلورية اليشم C تلطيخ وزيادة أعداد خلايا كاسباس 3 المشقوق إيجابية في أقسام قرن آمون يكشف عن مستوى أعلى من موت الخلايا العصبية في الفئران IκB / TTA مما كانت عليه في IκB / - الضوابط. وتتميز neurites التي تحولها عن طريق السهام، ويشار إلى نواة نجمية. موقع الحق: القياس الكمي للالمشقوق كاسباس 3 بوخلايا sitive داخل الحصين تقترح زيادة للغاية موت الخلايا المبرمج في الحيوانات المعدلة وراثيا مزدوجة. B. تلون cryosections الحصين لDCX يكشف زيادة عدد DCX، معربا عن الخلايا في الحيوانات المعدلة وراثيا مزدوجة. نلاحظ أن DCX + الخلايا في IκB / TTA-الحصين غير مرتبة بشكل حصري في المنطقة جزئي التحبب، ولكن هاجر أعمق في DG مما كانت عليه في IκB / - السيطرة C. اللوحة اليسرى: لاختبار تأثير التحوير على الانتشار، تم إجراء BrdU-حقنة واحدة، مما أدى إلى عدم وجود فروق كبيرة في عدد الخلايا BrdU إيجابية بين IκB / TTA والضوابط لوحة الحق: كشف التقييم الإحصائية الهامة زيادة في DCX، معربا عن الخلايا في الحيوانات IκB / TTA بعد ثلاثة BrdU-حقن يومية. تم إجراء التحليل بعد سبعة أيام من الحقن الماضي (اختبار التفاضل والتكامل). تم الكشف عن زيادة كبيرة في BrdU / DCX + في المديرية العامة للأناالفئران كيلوبايت / TTA (ن = 3). أخذ البيانات جزئيا من الإصدار OA من Imielski وآخرون. 2 اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الرقم 5. انشاء ونتائج نموذجية من النمط المكاني فصل بارنز متاهة (SPS-BM). A. من الزمن: الرسم تخطيطي التجريبية مجموعة المتابعة. وضعت سبعة منازل الغذائية متطابقة (نفس اللون والحجم والشكل) بشكل متناظر على بقع محددة من ذلك، لوحة محلية الصنع الجولة بنيت من البلاستيك الخامل الثابت (قطر 120 سم)، مع بقعة واحدة مجانا (نقطة البداية، S). وترد متعددة الالوان العظة خارج المتاهة (EMC) أمام قطعة قماش بيضاء اللون في المناصب مرئية بسهولة للحيوانات، ما يقرب من 100 سم من بترتيب اللوحة. لتجنب التوجه رائحة، تترسب الكريات الغذائية في كل بيت، ولكن واحدة فقط يمكن الوصول بيت الغذاء (إغلاق مصنوعة من رقائق شفافة). ركزت الكاميرا فيديو على لوحة (المسافة إلى لوحة: 115 سم) الحق، وصورة فوتوغرافية للانشاء بما في ذلك العظة خارج المتاهة B. نتائج تجريبية نموذجية لاختبار SPS-BM. وIκB / - الحيوان السيطرة يستكشف المنازل الغذائية متسلسل في اليوم الأول من سلسلة الاختبار، ويتم العثور على منزل مفتوح عن الطعام مباشرة بعد سبعة أيام من التدريب. في المقابل، الفئران IκB / TTA تكشف التعلم الأكثر فقرا، كما يتبين من الاستكشاف المسلسل حتى بعد مرحلة التدريب جيم مقارنة بين المعلمات يقاس في SPS-BM في IκB / - وIκB / TTA الحيوانات. تظهر الفئران المعدلة وراثيا ضعف العجز في الذاكرة كبير (ن = 9) مقارنة مع الضوابط (ن = 8) فيما يتعلق الكمون، والمسافة المقطوعة ومعدل الخطأ. في اتجاهين ANOVA التقييم؛ أشرطة الخطأ: SEM. البيانات في B واتخذت C من الإصدار OA من Imielski وآخرون. 2 اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تكوين الخلايا العصبية الكبار، وإمكانية التلاعب بها عن طريق تثبيط NF كيلوبايت في الخلايا العصبية، وتنشيط في وقت لاحق عبر الدوكسيسيكلين، ويوفر نظام رائعة للتحقيقات في الخلايا العصبية في الدماغ حديثي الولادة والكبار، وكذلك في دي وإعادة توليد الخلايا العصبية . جمال هذا النظام هو أن NF كيلوبايت مسار الإشارات تثبيط الخلايا العصبية في النتائج ليس فقط في التغييرات في وفاة الخلايا العصبية الخلية، وانتشار السلف، والهجرة، والتغيرات الهيكلية والتشريحية شديدة، ولكن أيضا في عيوب التعلم واضحة. الأهم من ذلك أن النمط الظاهري للحيوانات IκB / TTA يمكن عكسها تجريبيا وانقاذهم بعد إدارة doxycyclin. هذا الارتداد من النمط الظاهري يشمل الجوانب الهيكلية، ويمكن أن يؤدي أيضا إلى تحسن كبير في DG-تعتمد التعلم 2.
لضمان نتيجة للتفسير للتجارب السلوكية، فمن الأهمية بمكان أن الحيوانات فقط الذكور مع اح سنالامتحانات التنافسية الوطنية أن تستخدم أقل من أربعة أيام. علاوة على ذلك، يجب أن يتم تنفيذ كل سلسلة اختبار من قبل نفس المشغل. فيما يتعلق غرفة الاختبار، ونحن نوصي بشدة أداء الاختبار في بيئة معزولة صوتيا لتجنب الإجهاد وفقدان الاهتمام الناتجة عن مصادر الضوضاء الخارجية. لمنع التوجه على أساس الكشف عن الرائحة بدلا من العظة خارج المتاهة، ينبغي للمنازل الغذاء مغلقة لا يمكن الوصول إلى الحيوان، ويجب أن يسمح للهواء ورائحة طبيعية الدورة الدموية. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن يبنى لوحة تستخدم لاختبار المواد رائحة محايدة ومقاومة للالمنظفات، وينبغي تنظيفها بعناية بين التجارب. مصدر المحتملة مزيد من التباين التجريبية هو إضاءة الغرفة. يجب أن يكون مصدر الضوء الساطع بما يكفي للسماح الحصول على الصور، والاعتراف العظة خارج المتاهة، للحث على السلوك والطيران، ولكن لا ينبغي أن يكون من شدة لأعمى الحيوان. علاوة على ذلك، فإننا نقترح إجراء الاختبارات لكل حيوان في نفس الوقتمن يوم لتجنب الاختلافات الإيقاعية.
المصحف العضلة لديه قدرة الرؤية جيدة الى حد ما والذي هو، في الظروف الطبيعية، من بين أمور أخرى تستخدم للكشف عن الحدود الإقليمية في السمات البارزة بصريا (الإشارات البصرية مثل الأشجار) (اثام وآخرون، تطبيق ورقة. الحيوان Behav. العلوم 86 (3-4 )، 261-289، 2004). في التجربة الكلاسيكية Balkema وآخرون. (J. Neurophysiol 48 (4)، 968-980، 1982) وضعت +6، 0، و-7 العدسات الديوبتر أمام أعين الماوس ويلاحظ أي تغييرات كبيرة في أحجام الحقول تقبلا في الخلايا العقدية للشبكية. بسبب هذا العمق الهائل من المحفزات البصرية الميدان (مثل العظة خارج المتاهة) يمكن وضعها على مجموعة كبيرة من مسافات أمام الفئران والبقاء في التركيز. في نهجنا، كانت المسافة من العظة خارج المتاهة من نقطة البداية 30 سم من الحدود من لوحة، وهو ما يتفق مع الأدب (مثلا 140 سم في Wاونج وآخرون، الجينات الدماغ Behav. 5 (5)، 389-403، 2006)
القوارض لديهم ميل للبقاء على مقربة من جدران حقل مفتوح. ويعرف هذا السلوك كما انجذاب بالتماس (بارنيت، SH، والفئران: دراسة في السلوك والنشر Aldline، شيكاغو، ص 31-32، 1963). دراسة حديثة أجرتها O `يري آخرون. (Behav. بحوث الدماغ. 216 (2)، 531-542، 2011) أظهرت أن الفئران C57BL/6J أظهرت التعلم بشكل أفضل في بارنز المتاهة مقارنة ب 12 سلالات الفئران الأخرى. 28٪ من الفئران تم اختبارها تستخدم البحث المكاني، في حين تستخدم 64٪ استراتيجية المسلسل الانجذاب بالتماس. يحمل هذه البيانات الحقيقية للمتاهة الصغيرة التي يبلغ قطرها 69 سم مع 15 سم الجدار المحيطة. ومع ذلك، الفئران اختبارها على متاهة كبيرة دون جدران أو intramaze العظة، والإعداد لدينا (قطر 120 ميكرون) أظهرت أدلة موثوق بها لاستخدام أساسا خارج المتاهة الإشارات البصرية (انظر على سبيل المثال باخ وآخرون، خلية 81 مثل التي تسببها الخلافات المجهرية، وتناوب لوحة بعد كل تجربة.
اختبار السلوكية يمكن تكييفها لمجرد التحقيق في تأثير عوامل النسخ الأخرى على تكوين الخلايا العصبية الحصين الكبار، وذلك باستخدام نماذج الماوس المناسبة. ومع ذلك، أنها مصممة أساسا لاختبار التعلم DG-تعتمد (الفصل النمط المكاني)، وربما لا يكون مناسبا للتحقيق في تكوين الخلايا العصبية أو تنكس الخلايا العصبية في مناطق الدماغ الأخرى. في هذا الصدد، واستخدام SPS-BM يقتصر مزيدا من لها خصوصية DG-(الاعتماد الصارم على الدوائر الوظيفية بين EC II وDG وCA3 وCA1 وEC السادس)، وبالتالي لا ينبغي تطبيقها للتحقيق المهام التي تنطوي والأحادي المشبك EC الثالث - CA1 - EC V - الدائرة.
ويمكن أن تشمل التطبيقات المستقبلية من الطرق الموضحة في هذه الوثيقة التحقيق في آثار زرع الخلايا الجذعية، pharmaceuالعلاجات تلك الواقعة على الدولة في تكوين الخلايا العصبية الحصين الكبار، وتوازن الأنسجة داخل الحصين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أن لديهم أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر أنجيلا Kralemann-كولر للدعم التقني ممتازة. تم تنفيذ العمل التجريبي الموصوفة هنا في مختبرنا وكان مدعوما من المنح من مجلس البحوث الألمانية (DFG) لCK وBK ومنحة من وزارة البيئة الألمانية للبحوث والتعليم (BMBF) إلى BK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Moria MC17 Perforated Spoon | FST | 10370-18 | removal of the brains |
| Dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi SV8 | removal of the brains |
| Surgical scissors | FST | 14084-08 | removal of the brains |
| Surgical scissors | FST | 14381-43 | removal of the brains |
| Dumont #5 forceps | FST | 11254-20 | removal of the brains |
| SuperFrost Slides | Carl Roth | 1879 | slides for immunohistochemistry |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | fixative |
| TissueTek OCT compound | Sakura Finetek | 1004200018 | embedding of the brains |
| Normal Goat Serum | Jackson Immunolabs | 005-000-001 | blocking in IHC |
| Normal Rabbit Serum | Jackson Immunolabs | 011-000-001 | blocking in IHC |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immunolabs | 017-000-001 | blocking in IHC |
| anti-Neurofilament-M antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 2H3 | IHC, Dilution 1:200 |
| anti-Doublecortin antibody | sc-8066 | Santa Cruz | IHC, Dilution 1:800 |
| anti-GFP antibody | Abcam | ab290 | IHC, Dilution 1:2,000 |
| anti-BrdU antibody | OBT0030G | Accurate Chemicals | IHC, Dilution 1:2,000 |
| Fluoro-Jade C | FJ-C | HistoChem | Determination of neuronal cell death |
| Betadine | Mundipharma | D08AG02 | disinfectant |
| Cryomicrotome | Leica | CM1900 | preparation of brain slices |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393 | perfusion |
| Circular plate made from hard-plastic (diameter 120 cm) | lab made | none | plate for SPS-BM, diameter 120 cm |
| Buraton rapid disinfectant | Schülke Mayr | 113 911 | disinfectant |
| Video-tracking system TSE VideoMot 2 with Software Package VideoMot2 | TSE Systems | 302050-SW-KIT | tracking and analysis of SPS-BM |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | permeabilization/IHC |
| Cryotome | Reichert Jung/Leica | Frigomobil 1206 | preparation of 40 µm brain slices |
| Mowiol 4-88 | Carl Roth | Art.-Nr. 0713 | embedding of the slides |
| SYTOX green | Invitrogen | S7020 | Nuclear staining |
| Food pellets (Kellog`s Froot Loops) | Kellog`s | SPS-BM | |
| Prism, Version 3.0 | Graph Pad Software, San Diego, USA | Statistical evaluation of SPS-BM | |
| Zen 2008 or Zen 2011 Software | Carl Zeiss | Software (Confocal microscope) | |
| D.P.X | Sigma-Aldrich | 317616 | mounting medium for Fluoro-Jade C staining |
References
- Gutierrez, H., Davies, A. M. Regulation of neural process growth, elaboration and structural plasticity by NF-kappaB. Trends Neurosci. 34, 316-325 (2011).
- Imielski, Y., et al. Regrowing the adult brain: NF-kappaB controls functional circuit formation and tissue homeostasis in the dentate gyrus. PLoS One. 7, (2012).
- Zheng, M., et al. Intrahippocampal injection of A beta(1-42) inhibits neurogenesis and down-regulates IFN-gamma and NF-kappaB expression in hippocampus of adult mouse brain. Amyloid. 20 (1-42), 13-20 (2013).
- Denis-Donini, S., et al. Impaired adult neurogenesis associated with short-term memory defects in NF-kappaB p50-deficient mice. J. Neurosci. 28, 3911-3919 (2008).
- Bracchi-Ricard, V., et al. Astroglial nuclear factor-kappaB regulates learning and memory and synaptic plasticity in female mice. J, Neurochem. 104, 611-623 (2008).
- Koo, J. W., Russo, S. J., Ferguson, D., Nestler, E. J., Duman, R. S. Nuclear factor-kappaB is a critical mediator of stress-impaired neurogenesis and depressive behavior. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 2669-2674 (2010).
- Fridmacher, V., et al. Forebrain-specific neuronal inhibition of nuclear factor-kappaB activity leads to loss of neuroprotection. J. Neurosci. 23, 9403-9408 (2003).
- Whiteside, S. T., et al. C-terminal sequences control degradation of MAD3/I kappa B alpha in response to inducers of NF-kappa. B activity. Mol. Cell. Biol. 15, 5339-5345 (1995).
- Mayford, M., et al. Control of memory formation through regulated expression of a CaMKII transgene. Science. 274, 1678-1683 (1996).
- Rosenfeld, M. E., Prichard, L., Shiojiri, N., Fausto, N. Prevention of hepatic apoptosis and embryonic lethality in RelA/TNFR-1 double knockout mice. Am. J. Pathol. 156, 997-1007 (2000).
- Morris, R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J Neurosci. Methods. 11, 47-60 (1984).
- Barnes, C. A. Memory deficits associated with senescence: a neurophysiological and behavioral study in the rat. J. Compar. Physiol. Psychol. 93, 74-104 (1979).
- Brun, V. H., et al. Place cells and place recognition maintained by direct entorhinal-hippocampal circuitry. Science. 296, 2243-2246 (2002).
- Meshi, D., et al. Hippocampal neurogenesis is not required for behavioral effects of environmental enrichment. Nat. Neurosci. 9, 729-731 (2006).
- Bakker, A., Kirwan, C. B., Miller, M., Stark, C. E. Pattern separation in the human hippocampal CA3 and dentate gyrus. Science. 319, 1640-1642 (2008).
- Dupret, D., et al. Spatial relational memory requires hippocampal adult neurogenesis. PLoS One. 3, (2008).
- Leutgeb, J. K., Leutgeb, S., Moser, M. B., Moser, E. I. Pattern separation in the dentate gyrus and CA3 of the hippocampus. Science. 315. , 961-966 (2007).
- Kaltschmidt, B., et al. NF-kappaB regulates spatial memory formation and synaptic plasticity through protein kinase A/CREB signaling. Mol. Cell. Biol. 26, 2936-2946 (2006).
- Clelland, C. D., et al. A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation. Science. 325, 210-213 (2009).
- Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).
