Metoder til Modulation og analyse af NF-KB-afhængige Adult Neurogenese

Summary

Fremgangsmåder til manipulation og analyse af NF-KB-afhængige voksne hippocampus neurogenese beskrevet. En detaljeret protokol præsenteres for en dentatgyrus-afhængig adfærdsmæssige test (betegnet den rumlige mønster separation-Barnes labyrint) til undersøgelse af kognitive udfald i mus. Denne teknik bør også bidrage til, at undersøgelser i andre eksperimentelle indstillinger.

Abstract

Hippocampus spiller en central rolle i dannelsen og konsolideringen af ​​episodiske erindringer, og i rumlig orientering. Historisk har den voksne hippocampus blevet set som en meget statisk anatomisk region i pattedyrs hjerne. Imidlertid har de seneste resultater vist, at dentatgyrus af hippocampus er et område af enorm plasticitet hos voksne, der ikke kun ændringer af eksisterende neuronale kredsløb, men også voksne neurogenese. Denne plasticitet reguleres af komplekse transkriptionelle netværk, hvori transskriptionsfaktoren NF-KB spiller en fremtrædende rolle. For at undersøge og manipulere voksen neurogenese en transgen musemodel til forhjerne-specifik neuronal inhibering af NF-KB-aktivitet kan anvendes.

I denne undersøgelse er beskrevne fremgangsmåder til analyse af NF-KB-afhængige neurogenese, herunder de strukturelle aspekter, neuronal apoptose og progenitor proliferation og kognitiv betydning, which specifikt vurderet via en dentatgyrus (DG)-afhængige adfærdsmæssige test, den rumlige mønster separation-Barnes labyrint (SPS-BM). SPS-BM-protokollen kan kun tilpasses til brug med andre transgene dyremodeller designet til at vurdere indflydelsen af ​​bestemte gener på voksen hippocampus neurogenese. Endvidere kunne SPS-BM anvendes i andre eksperimentelle indstillinger med henblik på at undersøge og manipulere DG-afhængig læring, for eksempel ved hjælp farmakologiske midler.

Introduction

Ontologisk, hippocampus er en af ​​de ældste anatomiske hjernens strukturer kendt. Den er ansvarlig for diverse komplekse opgaver, såsom centrale funktioner i reguleringen af ​​langtidshukommelse, rumlig orientering og dannelse og konsolidering af den respektive hukommelse. Anatomisk hippocampus består af pyramideformede cellelag (stratum pyramidale), herunder cornu Ammonis (CA1, CA2, CA3 og CA4) regioner og gyrus dentatus (gyrus dentatus), som indeholder granuleceller og et par neuronale progenitorceller inden for dens subgranular zone . De granulceller rage mod CA3 region via såkaldte mosagtige fibre (axoner af granula celler).

Indtil slutningen af ​​det sidste århundrede blev pattedyrhjernen voksne menes at være en statisk organ mangler cellulære plasticitet og neurogenese. Men i løbet af de sidste to årtier, viser en voksende mængde af beviser voksen neurogenese finder sted i klart mindstto områder af hjernen, den subventricular zone (SVZ) og subgranular zone af hippocampus.

Vores tidligere undersøgelser, og de ​​andre grupper, har vist, at transkriptionsfaktoren NF-KB er en af de afgørende molekylære regulatorer af voksne neurogenese, og at dets dereguleringsforslag resulterer i alvorlige strukturelle hippocampus defekter og kognitive handicap ^1-6. NF-KB er det generiske navn på en inducerbar transskription faktor sammensat af forskellige dimeriske kombinationer af fem DNA-bindende subunits: P50, P52, c-Rel, RelB og p65 (RelA), sidstnævnte hvoraf tre har transaktiveringsassays domæner. I hjernen, den mest udbredte form, findes i cytoplasmaet er en heterodimer af p50 og p65, som er holdt i en inaktiv form af inhibitor af kappa B (IKB)-proteiner.

At studere og direkte manipulere NF-KB-drevne neurogenese, bruger vi transgene musemodeller for at muliggøre enkel hæmning af alt NF-KB-subunsin, specifikt i forhjernen ⁷ (se figur 1). Til dette formål, vi krydsavlet følgende transgene mus linjer, IKB / - og -/tTA. De transgene IKB / - line blev genereret ved hjælp af en trans-dominant negativ mutant af NF-KB-hæmmer IκBa (super-repressor IκBa-AA1) ^8.. I modsætning til vildtype-IκBα, IκBα-AA1 har to serinrester muteret til alaniner (V32 og V36), som hindrer phosphorylering og efterfølgende proteasomalaktivitet nedbrydning af inhibitoren. For forebrain neuron-specifikt udtryk for det IκBa-AA1-transgen, IKB / - blev mus krydset med mus, der huser et calcium-calmodulin kinase IIα (CAMKIIα)-promotor, som kan drives af tetracyclin trans-aktivator (tTA) ^9..

p65-knock-out-mus har en embryonisk letal fænotype skyldes massiv leveren apoptose ^10, så den fremgangsmåde, der er vist her giver en elegant metodefor at undersøge betydningen af ​​NF-KB i postnatal og voksne neurogenese.

Den klassiske adfærdstest at studere rumlig indlæring og hukommelse, blev beskrevet i 1980'erne af Richard Morris, en test kendt som Morris water-labyrint (MWM) ^11. I denne friland vand-labyrint, lære dyrene at flygte fra uigennemsigtig vand på en skjult platform baseret på orientering og ekstra-labyrint signaler. En tør variant af MWM er den såkaldte Barnes labyrint (BM) ^12. Denne test benytter en cirkulær plade med 20 runde huller arrangeret på grænsen af ​​en plade, med en defineret hullet som en flugt kasse og visuelle ekstra labyrint stikord til orientering. Både eksperimentelle paradigmer stole på flyvningen adfærd fremkaldt af en gnaver `s aversion mod vand, eller åbne, stærkt oplyste rum. Begge test tillade en undersøgelse af rumlig orientering, og den relaterede hukommelse ydeevne. Selv hippocampus spiller en generel og væsentlig rolle i den rumlige hukommelse dannelse, hippocampus rEGIONSUDVALGET involverede varierer afhængigt af testen anvendt. Det testede i BM hukommelse opstår neuronal aktivitet mellem enthorinal cortex (EF) og pyramideneuroner placeret i CA1-regionen af hippocampus uden et bidrag fra GD ^13-16. Især den klassiske BM primært afhængig navigation via den monosynaptiske temporo-ammonic vej fra EF III til CA1 til EF V. Vigtigt er det GD afgørende involveret i den såkaldte rumlige mønstergenkendelse ^17, hvilket indebærer ikke blot behandling af visuel og geografisk information, men også omdannelsen af ​​lignende repræsentationer eller minder til Forskelligartede nonoverlapping repræsentationer. Denne opgave kræver en funktionel tri-synaptiske kredsløb fra EF II til GD til CA3 til CA1 og EF-VI, der ikke kan testes i BM ^15.

For at imødegå disse udfordringer, har vi udtænkt SPS-BM som en adfærdsmæssig test til specifikt at teste dentatgyrus-afhængige kognitiv præstation i samarbejdentrol dyr, og IKB / tTA super-repressor model efter NF-KB-inhibering. Vigtigere er det, i modsætning til MWM eller BM kan SPS-BM afslører subtile adfærdsmæssige mangler som følge af forringelse af neurogenese. Da rumlig-mønster-separation er strengt afhængig af en velfungerende kredsløb mellem EF II og GD og CA3 og CA1 og EC VI, denne test er meget følsom over for mulige ændringer i neurogenesis, ændringer af mosbegroet fiber gangsti eller forandringer af vævshomeostase inden for DG.

Teknisk set er det set-up af vores test er baseret på den undersøgelse, som Clelland et al., Hvor den rumlige adskillelse mønster blev testet ved hjælp af en træ 8-arm radialarmssaven labyrint (RAM) ^19. I vores modificeret set-up, blev de otte arme erstattet af syv identiske gule fødevarer huse. Sammenfattende fremgangsmåderne vist her, herunder analyse af doublecortin-udtrykkende (DCX +) celler i hippocampus, den mossy fiber fremspring, neuronal celle death og især SPS-BM præsenteres her, kan anvendes til undersøgelser af andre musemodeller inkorporerer transgener, der har en indvirkning på voksen neurogenese. Yderligere anvendelser kan omfatte undersøgelse af farmakologiske midler og måle deres indvirkning på GD og rumlig mønster adskillelse.

Protocol

Etik erklæring

Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med reglerne i den statslige dyr og pleje brug udvalg LANUV i staten Nordrhein-Westfalen, (Düsseldorf, Tyskland). Alle dyreforsøg blev godkendt af LANUV, Düsseldorf under licensnummer 8.87-51.04.20.09.317 (LANUV, NRW). Blev gjort alle bestræbelser på at minimere angst og antallet af dyr, der kræves til undersøgelsen.

1.. Animal Care og Boligstyrelsen

1. Alle dyr, der anvendes i de protokoller, der er beskrevet heri bør holdes under specifikke patogenfrie betingelser, som defineret af Federation Europæiske Laboratorium Animal Science Association (FELASA).
2. Mus skal holdes i standard bure i en temperatur-og fugt-kontrollerede (22 ° C) rum under døgnets forhold (12 timers lys / mørke-cyklus) med HEPA-filtreret luft.
3. Standardiseret mad og vand bør gives ad libitum. </ Li>
4. Hvis / IKB / tTA og IKB - kontrol mus anvendes, bør PCR-baseret genotypebestemmelse udføres for hvert dyr, som beskrevet i ^{7, 18.}
5. For handyr med en aldersforskel på mindre end fire dage, bør anvendes til at reducere individuel variation.
6. (Valgfrit): For NF-KB reaktivering eksperimenter doxycyclin skal administreres i drikkevandet (2 mg / ml med 2,5% saccharose) i mindst 14 dage.

2. Spatial Mønster Separation-Barnes Maze (SPS-BM)

1. Alle adfærdsmæssige undersøgelser bør udføres i henhold til internationale og lokale retningslinjer.
2. VIGTIGT! Brug kun hanmus med en alder på seks måneder eller derover. Aldersforskellen mellem dyrene i en test-serien bør være mindre end fire dage. Afprøvningen skal udføres af den samme operatør for hver serie. Musene bør modtage en standard kost forud for test for at øge motivationen delvist drevet af såweet mad belønning.
3. Opsæt en hvid cirkulær plade lavet af hård plast (diameter 120 cm, se figur 5A) i en fugtighed-og temperatur-kontrollerede rum (22 ° C), belyst med mindst 4 x 80 W og 3 x 215 W neon lysstofrør . VIGTIGT! Sørg for korrekt belysning er brugt, da motivationen hos mus for at indgå i fødevare huse er delvist drevet af deres aversion mod lyse, udsatte steder.
4. Indstil video-tracking system. Kameraet bør placeres 115 cm over centrum af pladen (se figur 5A).
5. Vedhæft mangefarvede ekstra labyrint signaler (EMC) for en hvid-farvet klud i positioner, let synlige for dyrene, cirka 100 cm fra kanten af pladen (se figur 5A).
6. Rengør omhyggeligt pladen med en hurtig desinfektionsmiddel, der kan fjerne enhver lugt fra den eksperimentelle set-up.
7. Placer syv identiske gule fødevarer huse (12 cm x 7 cm x 8 cm, jf. figur 5A figur 5A).
8. Placer sød mad pellet belønninger (en kvart Kellogs `s Froot Loop / mad huset) indenfor alle fødevarer huse på definerede positioner (se figur 5A) med kun én definerede mad hus bliver frit tilgængelig for dyret (placering F, se figur 5A ). Luk ikke-mål-food huse med gennemsigtig folie.
9. Forud for testen udføre tilvænning (en dag, før du starter en opgave). Gør alle fødevarer huse frit tilgængelige og lade mus for at udforske labyrinten frit og til at hente en fødevare pille belønning (10 min / dyr).
10. Tænd for computeren og kameraet, og starte video-tracking system software.
11. Starte optagelsen.
12. Placer dyr på defineret startpunktet på den cirkulære plade (figur 5A, S: start position) og tillade musene for at søge efter målet fødevarer hus i 10 min.
13. Stop video-tracking.
14. VIGTIGT! Rengør cirkulær plade og fødevarer huse efter hvert forsøg med hurtig desinfektionsmiddel.
15. Gentag testen dagligt i syv på hinanden følgende dage (for hvert dyr).
16. Analysere resultaterne (latency, distance og fejl) ved hjælp af passende statistiske software. Definer fejl som nærmer den forkerte mad hus og / eller kontakt med den rette kasse uden at indtaste og hente maden pellet belønning. For grupperet analyse bruge to-vejs ANOVA med Bonferroni post-hoc test.
17. (Valgfrit) Sacrifice mus og analysere hippocampi som beskrevet nedenfor.

3. BrdU Mærkning

1. Sprøjt intraperitonealt 50 mg / kg ip BrdU én gang dagligt i 3 dage (analyse af differentiering og integration) eller 200 mg / kg ip til en enkelt injektion (analyse af proliferation).
2. Sacrifice dyrene dissekere hippocampus og forberede 40 um snit som beskrevet nedenfor.
3. Denaturate densektioner med 2 M HCI i 10 minutter og inkuberes i 0,1 M borat-buffer i 10 min.
4. Mærk en en-i-tolv serie på 40 um sektioner (240 um mellemrum) fra hvert dyr immunhistokemisk, som beskrevet nedenfor under anvendelse af antistoffer rettet mod BrdU.
5. Kvantificere de mærkede celler ved konfokal mikroskopi analyse hele rostrocaudal omfanget af granula cellelag og subgranular zone. Multiplicer de resulterende tal med 12 for at opnå det skønnede samlede antal BrdU-mærkede celler pr hippocampus og dividere med to for at beregne det samlede antal mærkede celler pr GD.

4.. Fjernelse af hjerne og Udarbejdelse af kryosektioner fra Nonperfused Dyr

1. Overhold lokalt godkendte procedurer for euthanizing dyr. Mus kan være direkte aflivet ved cervikal dislokation.
2. (Ekstraudstyr) Dyr kan bedøves før euthanization henhold til lokale og internationale retningslinjer, fx ved intraperitoneal injeIndsatsen på 0,8 ml Avertin for en 33 g mus (frisk fremstillet ved at blande 150 ml stamopløsning fremstillet af 2,2 mg 2,2,2-tribromethanol i 1 ml isoamylalkohol ethanol med 1,85 ml saltvand eller fysiologisk buffer).
3. Sterilisere hovedet med Betadine (10% povidon-jod) gaze og vatpind efterfølgende med gaze dyppet i 70% ethanol.
4. Halshugge dyret ved hjælp af passende kirurgiske sakse og trække huden til side.
5. (Ekstraudstyr) fiksatorer kan anvendes for at undgå at folde bagsiden af ​​retarderede hud.
6. Lav en midtlinieincision i kraniet og træk kraniet fragmenter omhyggeligt side.
7. Fjern forsigtigt hele hjernen ved hjælp af et passende kirurgisk instrument (f.eks Moria Spoon).
8. Forkøling 25 ml 2-methylbutan i et 50 ml bægerglas (f.eks Schott Duran) til -30 til -40 ° C på tøris.
   Bemærk: fritsvævende farvning af "tyk" sektioner, som er velegnet til konfokal laser scanning mikroskopi, fjerne hjerne, vaske 3gange i puffer og opbevares ved 4 ° C i phosphatpufret 30% saccharose-opløsning i 50 ml rør, indtil hjernen er sunket ned til bunden (typisk natten over).
9. Placer forsigtigt hjernen på et stykke Nescofilm (Parafilm) og tildækkes med rigelig mængde af TissueTek OCT-forbindelse, fryse på Nescofilm i 2-methylbutan, opbevares ved -80 ° C indtil brug.
   Bemærk: Ved langtidsopbevaring ved -20 ° C butik i 9% saccharose, 7 mM _MgCl2, 50 mM fosfatbuffer, 44% glycerol.
10. Skær hjernen til 10-12 um tykke sektioner på passende cryomicrotome.
    Bemærk: tykke, frit svævende sektioner fryse hjerne på cryotome fase af passende cryotome (f.eks Reichert Jung, Frigomobil.) Og skære 40 um vandrette sektioner ved -20 ° til - 25 ° C. Saml afsnit fra kniv med fin pensel og saml det i buffer eller holde lagerløsning (trin 4.9) ved -20 ° C i lang tid opbevaring.
11. Montere forsigtigt to skiver på enkelt objektglas. Den ose af Superfrost UltraPlus slides anbefales stærkt at maksimere vedhæftning af sektionerne.
12. Tør slides for 5 minutter ved stuetemperatur. Slides kan opbevares ved -80 ° C indtil brug.

5.. Udarbejdelse af afsnit fra perfusioneres Dyr

1. Bedøve dyr som beskrevet ovenfor (trin 4.2).
2. Perfuse forsigtigt dyret transcardialt med phosphatbufret saltvand (PBS) indeholdende heparin (0,025 g/100 ml PBS) og procain (0,5 g/100 ml PBS) i 2-4 minutter, efterfulgt af 4% paraformaldehyd i PBS i 10-15 minutter . Perfusion optimalt udføres ved perfusion via den venstre ventrikel og åbning af højre forkammer ved hjælp af et hydrostatisk tryk på ca 1,2-1,4 m eller anvendelse af en peristaltisk pumpe indstillet til cirka 15 ml / min. Optimale perfusion resulterer i en bleg hvid hjerne med ingen røde blodkar bliver synlig.
3. Dissekere og post-fix hjerner i 4% paraformaldehyd ved 4 ° C i 24 timer.
4. Cryobeskytte hjernen i 30% saccharose i PBS ved 4 ° C i mindst 24 timer.
5. Frys hjernerne på cryotome fase.
6. Forbered 40 um vandrette sektioner fra hele forebrains hjælp af en passende cryotome.
7. Objektglassene kan opbevares i kryobeskyttende opløsning (0,1 M phosphatpuffer, 50% glycerol, 0,14% _MgCl2, 8,6% saccharose) ved -20 ° C indtil anvendelse.

6.. Immunohistokemi af Brain Sektioner af Nonperfused Dyr

1. Post-fix kryosektionerne, fremstillet som beskrevet ovenfor under anvendelse af -20 ° C kold methanol i 10 min.
2. Blok med 5% normalt serum indeholdende 0,3% Triton-X (fra de arter, der blev brugt til at hæve det sekundære antistof) natten over ved 4 ° C.
3. Skyl 3 gange med 1x PBS og inkuberes med primære antistoffer natten over ved 4 ° C.
4. Skyl 3 gange med 1x PBS og inkuberes med sekundære antistoffer ved stuetemperatur i en time.
5. Skyl 3 gange med 1x PBS
6. Counterstain sektionen for DNA ved hjælp SYTOX grøn eller DAPI (eller en alternativ DNA farvestof).
7. Skyl 3 gange med 1x PBS
8. Integrer afsnittene i et vandigt indstøbningsmedium.
9. Lad indstøbningsmediet polymerisere i mindst 48 timer.

7.. Immunohistokemi af Brain Sektioner af overgydet Dyr

1. Blok som beskrevet i trin 6.2 og efterfølgende inkuberes de faste hjernen sektioner i primære antistof fortyndet i PBS indeholdende 0,3% Triton-X (fritflydende) natten over ved 4 ° C.
2. Skyl tre gange med 1x PBS og inkuberes i sekundært antistof fortyndet i PBS indeholdende 0,3% Triton-X (fritflydende) ved stuetemperatur i 3 timer.
3. Skyl 3 gange med 1x PBS
4. Kontrastfarve sektionen for DNA ved hjælp SYTOX grøn eller DAPI (eller en alternativ DNA farvestof).
5. Skyl tre gange med 1x PBS
6. Integrer afsnittene i et vandigt indstøbningsmedium.
7. Lad indstøbningsmediet polymerisere i ent mindst 48 timer.

8.. Undersøgelse af Mossy Fiber Fremskrivninger

1. Sacrifice dyrene forberede 40 um kronafsnit som beskrevet ovenfor og plette hippocampus sektion under anvendelse af antistof for neurofilament M.
2. Scan sektioner på den passende bølgelængde under anvendelse af et konfokalt laserscanningmikroskop at visualisere mosbevoksede fibre og kerner. Start scanning ved lav forstørrelse.
3. Brug den lave forstørrelse billeder til orientering og målrette hippocampus med Mossy fiber fremskrivninger.
4. Scan sektioner (z-Sektionering) ved høj opløsning og høj forstørrelse.
5. Analyser den morfologiske udseende og tilslutningsmuligheder af Mossy fibre visualiseret via farvning for NF-M.
6. (Valgfrit) Analyser størrelsen og omfanget af hippocampus vinger. Brug DNA signal til målingerne.

9.. Fluor-Jade C Assay (nervecelledød)

1. Sacrifice dyrene, dissekere hippocAmpus og forberede 12 um snit som beskrevet ovenfor.
2. Lad sektionerne tørre i 30 minutter ved stuetemperatur.
3. Lave afsnit i 4% PFA i 40 minutter ved stuetemperatur.
4. Kortvarigt vaskes sektionerne 3x med Hedeselskabet ₂ O.
5. Inkuber sektioner med 0,06% kaliumpermanganat _(KMnO4) i 10 minutter under konstant, forsigtig omrystning.
6. Vask sektionerne 3x med Hedeselskabet ₂ O.
7. Inkuber sektioner med 0,002% fluor-Jade C opløsning i 20 minutter ved stuetemperatur.
8. (Valgfrit) For samtidige nukleare farvninger, 0,002% Fluor-Jade C løsning kan suppleres med 10 ug / ml DAPI.
9. Kortvarigt vaskes sektionerne 3x med Hedeselskabet ₂ O.
10. Lad sektionerne tørre i 30 minutter ved stuetemperatur.
11. Inkuber sektioner med xylen (1 min)
12. Montere dele med en Xylen baseret montering medium (DPX).

Representative Results

Krydsning af IKB / - og tTA transgene muselinjer fører til betinget inhibering af NF-KB-aktivitet i hippocampus.

For at undersøge ekspressionen af IκBα-AA1-transgenet i den dobbelte transgene mus (figur 1A) blev hjerner isoleret, cryosectioned og farvet under anvendelse af et antistof mod GFP (grønt fluorescerende protein). Konfokal laser scanning mikroskopi viste høj ekspression af transgenet i CA1 og CA3 regioner og GD (fig. 1B).

Den IκBα-AA1-transgen udtrykkes i type 2b stamceller og er aktiv i de mellemliggende umodne stater og i modne granulceller.
For at bestemme den tidligste celletype, der udtrykker CAMKIIα-drevne IκBα-AA1 i hippocampus neurogene region blev snit af hippocampi fra IKB / tTA dyr farvet for doublecortin(DCX) og transgen (GFP). Konfokal analyse afslørede GFP signaler i unge DCX-positive granulceller, hvilket indikerer induktion af ekspression af transgenet ved CAMKIIα-aktivitet (figur 2, pile).

Neuronale NF-KB-hæmning via IκBα-AA1 reducerer mosbegroet fiber fremskrivninger, og tykkelsen og mængden af generaldirektoratet.

Kronafsnit i hippocampus af IKB / tTA og IKB / - mus blev farvet for neurofilament M (NF-M) for at visualisere mossy fiber fremspring, og afslører komplekse og fascicular organisation (figur 3). I IKB / tTA-mus blev mosbegroet fiber fremskrivninger alvorligt svækket. Desuden NF-KB-inhibering førte til en signifikant reduceret suprapyramidal bladtykkelse og en mindre GD volumen (figur 3B).

Neuronal inhibering af NF-KB i IKB / tTA-mus fører til forhøjet neuronal Degenbejde, øget neurogenese, og en forstyrret migration af DCX-udtrykkende stamceller.

At studere de mulige årsager til den dramatiske strukturelle mangler, friske, blev optagne hippocampusskiver fra IKB / tTA mus farvet med fluor-Jade C, som tillader specifik påvisning af neuronal celledød (figur 4A). Her blev der observeret en dramatisk stigning i antallet af degenererende neurites i dobbelt transgene dyr sammenlignet med enkelt transgene kontroller. Desuden var der en betydelig stigning i spaltede caspase-3-positive apoptotiske celler påvist i IKB / tTA mus. Derimod immunhistokemisk farvning mod DCX viste signifikant forøgede mængder af DCX +-celler i hjernen hos IKB / tTA-mus. Desuden blev DCX + celler i IKB / tTA-hippocampi ikke arrangeret udelukkende i subgranular zone, men blev også fundet i de dybere områder af DG (figur 4B), mens DCX +-stamfædre in kontrol dyr blev lokaliseret næsten udelukkende inden for subgranular zone. For at teste om den øgede mængde af DCX-udtrykkende celler er et resultat af modningen af ​​tidligere progenitorceller eller direkte på grund af proliferation af DCX +-celler, blev BrdU injiceret i hippocampi af IKB / tTA mus og kontrolmus, som derefter blev cryosectioned og farvet med DCX og BrdU (Figur 4). Til analyse af proliferation blev BrdU injiceres en gang (se figur 4B ordning), efterfulgt af analyse efter 24 timer. Til analyse af differentiering blev tre injektioner udføres dagligt, efterfulgt af analyse efter syv dage. Efter en enkelt BrdU-injektion blev der ikke observeret nogen signifikante forskelle i det samlede antal af BrdU-positive celler mellem IκB/tTA- og kontroldyr, mens tre serielle injektioner-tilgang afslørede en klart øget mængde BrdU / DCX + celler i GD af IKB / tTA-mus. Dette indikerer, at forstyrret differentiering eller integration af DCX-expresserende celler kan have forårsaget den øgede antal af DCX + celler, og foreslår, at type 3 celler var involveret.

Neuronhæmning af NF-KB resulterer i alvorlige defekter læring, som det fremgår af Spatial Mønster Separation-Barnes Maze test. Specifikt teste opførsel af dobbelt transgene mus i en DG-afhængige opgave, vi brugte SPS-BM, hvor dyrene nødt til at skelne mellem steder med subtile forskelle (se figur 5). I denne adfærdsmæssige test, IKB / - kontroldyr udforskede fødevarer husene serielt på den første dag i forsøget (figur 5). Efter syv dages uddannelse, var dyrene i stand til at finde den åbne mad hus direkte. Derimod fortsatte IKB / tTA dyr at udforske fødevarer huse serielt, selv efter træningen (figur 5B). Observationen af ​​betydelige stigninger i de strækninger og højere ventetid og isROR rater i IKB / tTA dyr, sammenlignet med IKB / - kontrol dyr, tyder på, at disse dyr havde alvorlige defekter læring (figur 5C).

Figur 1. Generering af en betinget forhjerne-specifik inhibering af NF-KB-aktivitet. A. Skematisk tegning af de transgene modeller, der anvendes til at studere rollen af NF-KB i voksen hippocampus neurogenese. Calcium-calmodulin-afhængig kinase IIα (CAMKIIα) promotordrevet tetracyclin transaktivator (tTA) mus blev anvendt til at regulere ekspression af et trans-dominant negativ mutant IκBa (IκBa-AA1 super-repressor i IKB-mus) kombineret med et grønt fluorescerende protein sporstof (GFP). I IKB / tTA-mus, NF-KB opbevares i cytoplasmaet i sin inaktive state af ikke-nedbrydelige IκBa-AA1, som kan påvises via GFP-fluorescens. Hæmningen kan vendes ved doxycyclin, som hæmmer tTA. B. repræsentant transgenekspressionen i forskellige hippocampus regioner i IKB / tTA mus (CA1, CA3 og DG). Kryosnit blev fremstillet fra isolerede hjerner af IKB / - og IKB / tTA-mus, og blev fikseret og farvet ved anvendelse af et antistof mod GFP. Bemærk, at transgen er overudtrykt i generaldirektoratet. De: dendritter, GD: dentatgyrus, ML: molekylær lag; SL: Stratum lucidum. Klik her for at se større billede.

Figur 2. Den IκBa-AA1 transgen udtrykkes i DCX-positive, type-2b progenit ors og er aktiv i flere mellemliggende stater og i modne granulceller. A. Cryosectioned hippocampi af IKB / tTA dyr med doublecortin (DCX) farvning og GFP-ekspression viser ekspression af transgenet i unge DCX-positive granula celler (pile). GD: dentatgyrus, ML: molekylær lag B. Skematisk tegning af transgen ekspression i forskellige udviklingsstadier i løbet granula celle udvikling.. IκBa-AA1-transgenekspressionen blev fundet i DCX-positive, type 2b stamfædre, alle mellemliggende umodne stater og i modne granulceller. Derimod gjorde tidlige type-1 og type-2A progenitorer (mangler DCX-udtryk) ikke udtrykke transgenet, og blev derfor ikke påvirket af NF-KB-hæmning. Modificeret efter Kempermann et al. ²⁰ Klik her for at se større billede.

ays ">
Figur 3. NF-KB-hæmning fører til forringet mosbegroet fiber fremskrivninger og en reduceret GD tykkelse og volumen i IKB / tTA-mus, sammenlignet med enkeltstof transgene kontrol (IKB / -). A. Immunfarvning af cryosectioned hippocampi for neurofilament M (NF-M) til at visualisere mosbegroet fiber fremskrivninger. I kontrolmus (IKB / -), en kompleks og fascicular organisering af mosagtige fibre forbinder granulerede celler til deres mål-celler i CA3 er indlysende, som blev forringet, efter neuronal inhibering af NF-KB i IKB / tTA-mus. Desuden udtryk for super-repressor førte til en væsentligt reduceret suprapyramidal bladtykkelse (sammenlign pil i venstre og højre panel), og en formindsket GD volumen. B. Kvantificering og statistisk analyse af strukturelle fejl, der skyldes NF-KB-hæmning. En ikke-parret t-test, to-halet. Oplysninger taget fra OA-versionen af Imielski et al. ^2. Klik her for at se større billede.

Figur 4.. Inhibering af NF-KB i IKB / tTA-mus fører til øget neuronal celledød, øget neurogenese og en forstyrret trækmønster af DCX-udtrykkende celler. A. Neuron-specifik fluor-Jade C farvning og øget antallet af spaltede caspase-3-positive celler i hippocampus sektioner viser en højere grad af neuronal celledød i IKB / tTA-mus end i IKB / - kontrol. Udarter neurites er markeret med pile, og kerner Asterisk ved. Højre site: kvantificering af kløvet caspase-3-posomme celler i hippocampi foreslår stærkt forøget apoptose i dobbelt transgene dyr. B. Farvning af hippocampus kryosektioner for DCX viser et øget antal DCX-udtrykkende celler i de dobbelte transgene dyr. Bemærk at DCX +-celler i IKB / tTA-hippocampi ikke er arrangeret udelukkende i subgranular zone, men vandrede dybere ind i GD end i IKB / -. Kontrol C. Venstre panel: At teste indflydelsen af transgen om spredning, blev en enkelt BrdU-injektion udført, hvilket resulterede i ingen signifikante forskelle i antallet af BrdU-positive celler mellem IKB / tTA og reguleringer Højre panel:. Statistisk evaluering viste en signifikant stigning i DCX-udtrykkende celler i IKB / tTA dyr efter tre daglige BrdU-injektioner. Analysen blev foretaget syv dage efter den sidste injektion (test af differentiering og integration). En betydelig stigning i BrdU / DCX + blev påvist i GD for jegKB / tTA-mus (n = 3). Oplysninger delvist taget fra OA-versionen af Imielski et al. ² Klik her for at se større billede.

Figur 5. Set-up og typiske resultater af rumlig mønster separation-Barnes labyrint (SPS-BM). A. Venstre: Skematisk tegning af forsøgsopstillingen. Syv identiske fødevarer huse (samme farve, størrelse og form), blev placeret symmetrisk på definerede pletter af en rund, hjemmelavet plade bygget fra hård inaktivt plast (diameter 120 cm) med en fri plet (startpunkt, S). Flerfarvede ekstra labyrint signaler (EMC) er fastgjort foran en hvid-farvet klud i positioner let synlig for dyrene, cirka 100 cm fra brækkefølge af pladen. For at undgå orientering ved lugt, er foderpiller deponeret i hvert hus, men kun én mad hus er tilgængelig (lukning fremstillet af transparent folie). Højre: Video kamera fokuserede på pladen (afstand til plade: 115 cm), og et fotografi af set-up, herunder ekstra-labyrint signaler B. Typisk eksperimentel resultat af en SPS-BM test.. IKB / - kontrol dyr udforsker fødevarer husene serielt på den første dag i test-serien, og den åbne mad huset findes umiddelbart efter syv dages træning. I modsætning hertil IKB / tTA mus afslører dårligere læring, som demonstreret ved seriel udforskning selv efter træningen fase C. Sammenligning af målte parametre i SPS-BM i IKB / -. Og IKB / tTA dyr. Dobbelt transgene mus viser betydelige hukommelse underskud (n = 9) i forhold til kontrolgruppen (n = 8) med hensyn til ventetid, afstand og fejlprocent. to-vejs ANOVA evaluering fejlsøjler: SEM. Data i B ogC blev taget fra OA-versionen af Imielski et al. ^2. Klik her for at se større billede.

Discussion

Voksen neurogenese, og muligheden for manipulation via hæmning af NF-KB i neuroner, og dets senere reaktivering via doxycyclin, giver et fascinerende system for undersøgelser af nyfødte neuroner i den voksne hjerne, samt i neuronal de-og re-generation . Skønheden i dette system er, at NF-KB-signalvejen hæmning i neuroner ikke kun resulterer i ændringer i neuronal celledød, stamfader proliferation og migration, alvorlige strukturelle og anatomiske ændringer, men også på åbenlyse mangler læring. Vigtigere, kan fænotype IKB / tTA dyr eksperimentelt vendes og reddet efter administration af Doxycyclin. Denne tilbageførsel af fænotype omfatter strukturelle aspekter, og kan også føre til en betydelig forbedring i DG-afhængig læring ^2.

For at sikre en fortolkelige resultat for de adfærdsmæssige forsøg, er det afgørende, at kun handyr med en alder Forskelnce på mindre end fire dage anvendes. Desuden bør alle test-serien skal udføres af den samme operatør. Med hensyn til test værelse, anbefaler vi kraftigt at udføre testen i et lydisoleret miljø for at undgå stress og tab af opmærksomhed som følge af eksterne støjkilder. For at forhindre orientering baseret på lugt opdagelse i stedet for ekstra-labyrint signaler, bør de lukkede mad husene ikke være tilgængelige for dyret, og normal luft og lugt cirkulation bør tillades. Desuden bør den plade, der anvendes til testen skal bygges af lugt-neutral og rengøringsmiddel-resistent materiale, og skal rengøres grundigt mellem eksperimenter. En yderligere potentiel kilde til eksperimentel variation er plads belysning. Lyskilden skal være lyse nok til at tillade billede erhvervelse, anerkendelsen af ​​de ekstra-labyrint signaler og til at inducere flyvning adfærd, men bør ikke være af en intensitet til blinde dyret. Desuden foreslår vi udfører test for hvert dyr på samme tidpå dagen for at undgå døgnrytmen variationer.

Mus musculus har en temmelig god vision evne, som er i de naturlige betingelser, blandt andet anvendes til at påvise territoriale grænser på visuelt slående træk (visuelle referencer som træer) (Latham et al., Appl. Animal Behav. Sci. 86 (3-4 ), 261-289, 2004). I et klassisk eksperiment Balkema et al. (J. Neurophysiol. 48 (4), 968-980, 1982) er placeret +6, 0 og -7 dioptri linser foran mus øjne og observeret nogen væsentlige ændringer i receptive felt størrelser i retinal ganglion celle. På grund af denne enorme dybdeskarphed visuelle stimuli (f.eks ekstra maze køer) kan anbringes over et stort område af afstande foran mus og forbliver i fokus. I vores tilgang, afstanden til ekstra-labyrint stikord fra udgangspunktet var 30 cm fra kanten af pladen, hvilket er i overensstemmelse med litteraturen (fx 140 cm i Wong et al. Genes Brain Behav. 5 (5), 389-403, 2006)

Gnavere har tendens til at forblive tæt på væggene i en åben mark. Denne adfærd er defineret som thigmotaxis (Barnett, SH, Rotten: et studie i adfærd, Aldline udgivelse, Chicago, pp 31-32, 1963). En nylig undersøgelse fra O `Leary et al. (Behav. Brain Res. 216 (2), 531-542, 2011) viste, at C57BL/6J-mus viste bedre indlæring i en Barnes Maze i forhold til 12 andre mus stammer. 28% af musene testede anvendt rumlig søgning, mens 64% brugte serielle thigmotactic strategi. Disse data gælder for små labyrint med en diameter på 69 cm med en 15 cm væg omkring. Men mus testet på et stort labyrint uden mure eller intramaze tidskoder, som vores setup (diameter på 120 um) pålideligt har vist tegn for brug af hovedsagelig ekstra-labyrint visuelle referencer (se f.eks Bach et al., Cell. 81 fx forårsaget af mikrostruktur forskelle blev pladen roteres efter hvert forsøg.

De adfærdsmæssige test kan simpelthen tilpasses for at undersøge virkningen af ​​andre transkriptionsfaktorer på voksne hippocampus neurogenese, ved hjælp af passende musemodeller. Men det er først og fremmest designet til at teste DG-afhængig læring (rumlige mønster adskillelse), og kan ikke være passende for undersøgelsen af ​​neurogenesis eller neuronal degeneration i andre hjerneregioner. I denne forbindelse er anvendelsen af ​​SPS-BM yderligere begrænset af dens DG-specificitet (streng afhængighed af et funktionelt kredsløb mellem EF II og GD og CA3 og CA1 og EF-VI), og bør derfor ikke anvendes til at undersøge opgaver, der involverer den monosynaptiske EF III - CA1 - EC V - kredsløb.

Fremtidige anvendelser af metoderne beskrevet heri, kan omfatte undersøgelse af virkningerne af stamceller transplantationer, farmaceutisketiske behandlinger på voksne hippocampus neurogenese og vævshomeostase i hippocampus.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Moria MC17 Perforated Spoon	FST	10370-18	removal of the brains
Dissecting microscope	Carl Zeiss	Stemi SV8	removal of the brains
Surgical scissors	FST	14084-08	removal of the brains
Surgical scissors	FST	14381-43	removal of the brains
Dumont #5 forceps	FST	11254-20	removal of the brains
SuperFrost Slides	Carl Roth	1879	slides for immunohistochemistry
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	fixative
TissueTek OCT compound	Sakura Finetek	1004200018	embedding of the brains
Normal Goat Serum	Jackson Immunolabs	005-000-001	blocking in IHC
Normal Rabbit Serum	Jackson Immunolabs	011-000-001	blocking in IHC
Normal Donkey Serum	Jackson Immunolabs	017-000-001	blocking in IHC
anti-Neurofilament-M antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	2H3	IHC, Dilution 1:200
anti-Doublecortin antibody	sc-8066	Santa Cruz	IHC, Dilution 1:800
anti-GFP antibody	Abcam	ab290	IHC, Dilution 1:2,000
anti-BrdU antibody	OBT0030G	Accurate Chemicals	IHC, Dilution 1:2,000
Fluoro-Jade C	FJ-C	HistoChem	Determination of neuronal cell death
Betadine	Mundipharma	D08AG02	disinfectant
Cryomicrotome	Leica	CM1900	preparation of brain slices
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H3393	perfusion
Circular plate made from hard-plastic (diameter 120 cm)	lab made	none	plate for SPS-BM, diameter 120 cm
Buraton rapid disinfectant	Schülke Mayr	113 911	disinfectant
Video-tracking system TSE VideoMot 2 with Software Package VideoMot2	TSE Systems	302050-SW-KIT	tracking and analysis of SPS-BM
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787	permeabilization/IHC
Cryotome	Reichert Jung/Leica	Frigomobil 1206	preparation of 40 µm brain slices
Mowiol 4-88	Carl Roth	Art.-Nr. 0713	embedding of the slides
SYTOX green	Invitrogen	S7020	Nuclear staining
Food pellets (Kellog`s Froot Loops)	Kellog`s		SPS-BM
Prism, Version 3.0	Graph Pad Software, San Diego, USA		Statistical evaluation of SPS-BM
Zen 2008 or Zen 2011 Software	Carl Zeiss		Software (Confocal microscope)
D.P.X	Sigma-Aldrich	317616	mounting medium for Fluoro-Jade C staining