Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Методы модуляции и анализа NF-kB-зависимой нейрогенез

Published: February 13, 2014 doi: 10.3791/50870
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 1, 2
1Cell Biology, University of Bielefeld, 2Molecular Neurobiology, University of Bielefeld

Summary

Методы манипуляции и анализа NF-kB-зависимой взрослых гиппокампа нейрогенеза описаны. Подробный протокол представлен на зубчатой ​​извилине зависит от поведения теста (называется пространственной структуры разделения-Barnes лабиринт) для исследования когнитивного тестирования на мышах. Эта техника также должна помочь разрешить исследования в других экспериментальных установок.

Abstract

Гиппокамп играет ключевую роль в формировании и консолидации эпизодических воспоминаний, и в пространственной ориентации. Исторически сложилось, что взрослый гиппокамп был просмотрен как очень статического анатомической области мозга млекопитающих. Тем не менее, последние данные показали, что зубчатая извилина гиппокампа является областью огромной пластичности у взрослых, с участием не только модификации существующих нейронных цепей, но и нейрогенез. Эта пластичность регулируется сложных транскрипционных сетей, в которых фактор транскрипции NF-kB играет важную роль. Для изучения и манипулировать нейрогенез, трансгенного модель мыши для переднего мозга конкретных нейронов ингибирования NF-kB деятельности могут быть использованы.

В этом исследовании, способы описаны для анализа NF-kB-зависимой нейрогенеза, в том числе его структурных аспектов, нейронов апоптоза и пролиферации предшественников и познавательного значения, whicч была специально установлена ​​с помощью зубчатой ​​извилине (DG)-зависимого теста поведенческой, пространственная модель сепарации-Барнс лабиринт (SPS-БМ). Протокол SPS-БМ может быть просто адаптированы для использования с другими трансгенных животных моделях, предназначенных для оценки влияния определенных генов на взрослого гиппокампа нейрогенеза. Кроме того, SPS-BM могут быть использованы в других экспериментальных условиях, направленных на изучение и манипулирования DG-зависимую обучения, например, с использованием фармакологических агентов.

Introduction

Онтологически, гиппокамп является одним из старейших анатомических структур мозга известных. Он отвечает за различные сложных задач, таких как ключевых функций в регулировании долговременной памяти, пространственной ориентации, а также формирования и консолидации соответствующей памяти. Анатомически, гиппокампа состоит из пирамидальных слоев клеток (слой pyramidale), включая Корню Ammonis (СА1, СА2, СА3 и CA4) регионов и зубчатой ​​извилине (извилина Dentatus), который содержит гранулы клетки и несколько нейронных клеток-предшественников в пределах своей субгранулярной зоне . ЗК проецировать к области СА3 через так называемые моховых волокон (аксонов гранулярных клеток).

До конца прошлого века, взрослый мозг млекопитающих не считается статический орган не хватает сотовой пластичность и нейрогенез. Тем не менее, в течение последних двух десятилетий, все большее количество доказательств ясно демонстрирует нейрогенез, происходящие в по крайней мере,две области мозга, субвентрикулярной зоне (СВЗ) и зернистым зона гиппокампа.

Наши предыдущие исследования, и других групп, показали, что транскрипционный фактор NF-kB является одним из важнейших регуляторов молекулярной взрослого нейрогенеза, и что его результаты де-регулирования в тяжелых структурных гиппокампа дефектов и когнитивных нарушений 1-6. NF-kB является общее название индуцибельного фактора транскрипции состоит из различных димерных комбинаций пяти ДНК-связывающих субъединиц: p50, p52, с-Rel, RelB и p65 (RelA), последние три из которых имеют трансактивацию домены. В мозге, наиболее распространенная форма находится в цитоплазме является гетеродимером р50 и р65, которая хранится в неактивной форме на ингибитора каппа В (IκB)-белков.

Для изучения и непосредственно управлять NF-kB-приводом нейрогенез, мы используем трансгенных модели мыши для того, чтобы простой ингибирование все subun NF-kBего, в частности, в переднем мозге 7 (см. рисунок 1). Для этой цели, мы пересекаем воспитанный следующие трансгенных линий мышей, IκB / - и -/tTA. Трансгенное IκB / - линия была сгенерирована с использованием транс-доминирующее негативное мутант NF-kB-ингибитора IκBa (супер-репрессор IκBa-AA1) 8. В отличие от дикого типа IκBα, IκBα-AA1 имеет два серина мутировал в аланинов (V32 и V36), которые препятствуют фосфорилирования и последующей протеасомной деградации ингибитора. Для переднего мозга нейрон-специфической экспрессии в IκBa-AA1-трансгена, IκB / - мышей скрещены с мышей укрывательство кальций-кальмодулин-зависимой киназы IIα (CAMKIIα)-промотор, который может управляться тетрациклина транс-активатора (TTA) 9.

p65 нокаут-мыши имеют эмбриональную смертельную фенотип, в связи с массовым апоптоза печени 10, поэтому подход показано здесь обеспечивает элегантный методдля исследования роли NF-kB в послеродовом и взрослого нейрогенеза.

Классический поведенческий тест изучать пространственное обучение и память была описана в 1980 году Richard Morris, испытании, известном как вода-лабиринте Морриса (MWM) 11. В этом открытом поле водяной лабиринт, животные узнать вырваться из непрозрачного воды на скрытой платформе, основанной на ориентации и экстра-лабиринт киев. Сухой вариант MWM является так называемый Barnes лабиринт (BM) 12. Этот тест использует круглую пластину с 20 круглых отверстий, расположенных на границе пластины, с одной определенной отверстие как бегство окне, и визуальные подсказки экстра-лабиринт для ориентации. Обе экспериментальные парадигмы полагаться на поведение полета индуцированного отвращения грызунов `ы к воде, или открытых, ярко освещенных пространств. Оба теста позволяют расследование пространственной ориентации, и связанное с этим производительность памяти. Хотя гиппокамп играет общее и существенную роль в формировании пространственной памяти, гиппокампа гegions участвующие отличаться в зависимости от теста применяется. Память испытания в BM возникает из нейронной активности между enthorinal коры (ЕС) и пирамидальных нейронов, расположенных в СА1-области гиппокампа без вклада DG 13-16. В частности, классический BM главным образом зависит от возможности навигации с помощью моносинаптического височно-аммиачной пути от EC III в СА1 к ЕС V. Важно отметить, что DG является решающим, участвующих в так называемой пространственной распознавания образов 17, что подразумевает не только обработку визуальное и пространственное информация, но и превращение подобных представлений или воспоминаний в разнородных, непересекающихся представлений. Эта задача требует функциональный три-синаптическую цепь от ЕС II к ГД в СА3 к СА1 и ЕС VI, которые не могут быть проверены в BM 15.

Для решения этих задач, мы разработали SPS-BM в качестве теста поведенческой специально проверить зубчатой ​​извилине зависит от познавательное представление в сотрудничествеуправляете животные, а в IκB / TTA супер-репрессора модели следующем NF-kB торможения. Важно отметить, что в отличие от MWM или BM, СПС-БМ может выявить тонкие поведенческие дефициты в результате обесценения нейрогенеза. С пространственно-шаблон-разделение строго зависит от функциональной цепи между ЕС II и ГД и СА3 и СА1 и ЕС VI, этот тест очень чувствителен к возможным изменениям в нейрогенеза, модификаций моховой волокна пути или изменение тканевого гомеостаза в пределах DG.

Технически, установка нашего теста основан на исследовании Clelland и соавт., В котором пространственная структура разделения был протестирован с помощью деревянного 8-руки радиально лабиринт (RAM) 19. В нашем модифицированной установки, восемь руки были заменены семь одинаковых желтых пищевых домов. Таким образом, методы показано здесь, в том числе анализ doublecortin-выражения (DCX +) клеток в гиппокампе, прогнозы моховой волокно, нервных клеток деATH и, в частности СПС-БМ, представленные здесь, могут быть применены к исследованию других мышиных моделях, включающих трансгены, которые оказывают влияние на взрослого нейрогенеза. Дальнейшие приложения могут включать в себя изучение фармакологических средств и оценке их влияния на ГД и пространственного разделения образов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Заявление Этика

Это исследование было проведено в строгом соответствии с нормативно-правовыми актами правительства животного и аккуратно обращайтесь комитета, LANUV государственной Северный Рейн-Вестфалия, (Дюссельдорф, Германия). Все эксперименты на животных были утверждены LANUV, Дюссельдорф, номер лицензии 8.87-51.04.20.09.317 (LANUV, NRW). Все усилия были предприняты, чтобы минимизировать стресс и количество животных, необходимых для исследования.

1. Уход животных и жилищного

  1. Все животные, используемые в протоколах, описанных здесь, должны находиться под конкретного патогена условиях, как определено Европейским лабораторных животных Ассоциации науки РФ (FELASA).
  2. Мыши должны храниться в стандартных клетках в температуре и влажности контролируемой (22 ° C) помещении, в суточных условиях (12 ч свет / темнота цикла) с HEPA фильтрованный воздух.
  3. Унифицированная пищи и воды должны быть обеспечены без ограничений. </ Li>
  4. Если IκB / TTA и IκB / - мышей управления используются, на основе ПЦР генотипирование должна быть выполнена для каждого животного, как описано в 7, 18.
  5. Кобели с разнице в возрасте менее четырех дней должны быть использованы для уменьшения индивидуальной вариабельности.
  6. (По выбору): Для NF-kB реактивации экспериментов, доксициклин должны быть введены в питьевой воде (2 мг / мл 2,5% сахарозы) в течение не менее 14 дней.

2. Пространственная структура Разделение-Барнс Лабиринт (СПС-BM)

  1. Все поведенческие испытания должны проводиться в соответствии с международными и местными руководящими принципами.
  2. ВАЖНО! Используйте только самцов мышей с шестимесячного возраста и старше. Разница в возрасте между животными одного серии испытаний должно быть не менее четырех дней. Тестирование должно выполняться одним и тем же оператором для каждой серии. Мыши должны получать стандартную диету до тестирования для дальнейшего увеличения мотивации частично приводимый в качествеWeet пищевой наградой.
  3. Настройка белый круглую пластину из твердого пластика (диаметр 120 см, см. рисунок 5А) в влажности и температуры контролируемой комнате (22 ° C), с подсветкой, по крайней мере 4 х 80 Вт и 3 х 215 Вт неоновых люминесцентных ламп . ВАЖНО! Убедитесь, что правильно освещение используется, как мотивация мышей ввести продовольственные домов частично обусловлено их отвращение к ярких, открытых местах.
  4. Настройте систему видео-слежения. Камера должна быть помещена 115 см выше центра пластины (см. фиг.5А).
  5. Прикрепите разноцветные экстра-лабиринт сигналы (ЭМС) к белому тканью в позициях легко видимых для животных, около 100 см от границы пластины (см. рисунок 5а).
  6. Тщательно очистите пластину с быстрым дезинфицирующим, что может удалить любой запах от экспериментальной установки.
  7. Поместите семь одинаковых желтых пищевых домов (12 см х 7 см х 8 см, см. рис 5а рисунок 5А).
  8. Наведите сладкой пищи гранул награды (четверть Froot Loop / пищевой дома Kellogs `ы) внутри всех пищевых домов на определенные позиции (см. рисунок 5А) только с одним определены дома еды быть в свободном доступе для животных (места нахождения F, см. Рисунок 5a ). Закройте нецелевых пищевые дома с прозрачной пленкой.
  9. Перед испытанием, выполните привыкание (за один день до начала выполнения задачи). Сделать все пищевые дома в свободном доступе и позволит мыши исследовать лабиринт свободно и получить награду пищи гранул (10 мин / животное).
  10. Переключите компьютер и камеру и начать системную видео-слежения программного обеспечения.
  11. Начните запись.
  12. Место животное на определенной начальной точки на круглой пластины (фиг. 5A, S: начальное положение) и позволить мыши для поиска пищевой дом целевого течение 10 мин.
  13. Стор видео-слежения.
  14. ВАЖНО! Очистите круглую пластину, и еда дома после каждого испытания с быстрым дезинфицирующим средством.
  15. Повторите тест в день в течение семи дней подряд (для каждого животного).
  16. Проанализируйте результаты (Задержка, пройденное расстояние и ошибки), используя соответствующие статистические программного обеспечения. Определите ошибки по мере приближения неправильное питание дом и / или контакта с правильной коробке без ввода и извлечения пищевого подкрепления гранул. Для сгруппированных анализа использовать двустороннюю ANOVA с Бонферрони после специальной теста.
  17. (По выбору) Жертвоприношение мышей и анализировать гиппокампа, как описано ниже.

3. BrdU маркировки

  1. Введите внутрибрюшинно 50 мг / кг внутрибрюшинно BrdU один раз в день в течение 3 дней (анализ дифференциации и интеграции) или 200 мг / кг внутрибрюшинно для одной инъекции (анализ пролиферации).
  2. Жертвоприношение животных, препарировать гиппокамп и подготовить 40 мкм разделы, как описано ниже.
  3. Денатурациисекций с 2 ​​М HCl в течение 10 мин и инкубируют в 0,1 М боратного буфера в течение 10 мин.
  4. Этикетка серию один к двенадцати 40 мкм секций (240 мкм друг от друга) от каждого животного иммуногистохимическое, как описано ниже с использованием антител, направленных против BrdU.
  5. Количественно меченых клеток с помощью конфокальной микроскопии анализа по всему ростро-каудальной степени слоя гранулярных клеток и зернистым зоне. Умножение полученные числа на 12, чтобы получить оценочную общее количество BrdU-меченых клеток в гиппокамп и разделить на два, чтобы получить общее количество меченых клеток на DG.

4. Удаление интеллектов и подготовка криосрезы из Nonperfused Животные

  1. Соблюдайте локально утвержденные процедуры для эвтаназии животных. Мыши могут быть непосредственно подвергнуты эвтаназии путем смещени шейных позвонков.
  2. (Опционально) Животные могут быть под наркозом перед euthanization в соответствии с местными и международными рекомендациями, например, путем внутрибрюшинного Injeводств 0,8 мл Avertin для 33 г мыши (свежеприготовленный путем смешивания 150 мл маточного раствора, сделанный из 2,2 мг 2,2,2-tribromoethanol в 1 мл изоамилового этанола с 1,85 мл физиологического раствора или физиологическом буфере).
  3. Стерилизовать голову Бетадин (10% повидон-йода) пропитанной марли и тампон впоследствии марлей, смоченной в 70% этанола.
  4. Обезглавить животное с использованием соответствующих хирургические ножницы и потяните кожу в сторону.
  5. (Опционально) Фиксаторы могут быть применены, чтобы избежать спинка заднего запаздывающей кожи.
  6. Сделайте срединный разрез в черепе и осторожно вытащите фрагменты черепа в сторону.
  7. Осторожно снимите весь мозг с помощью соответствующего хирургический инструмент (например Мория Spoon).
  8. Предварительного охлаждения 25 мл 2-метилбутана в 50 мл химический стакан (например Schott Duran) до -30 до -40 ° С в сухом льду.
    Примечание: Для свободно плавающего окрашивания "толстых" секций, которые идеально подходят для конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, удалить мозг, мыть 3раз в буфере и хранят при температуре 4 ° С в забуференном фосфатом 30% раствора сахарозы в 50 мл пробирку, пока мозг не запал вниз (как правило, на ночь).
  9. Аккуратно положите мозг на части Nescofilm (Parafilm) и накрыть достаточное количество TissueTek октября соединения, заморозить на Nescofilm в 2-метилбутан, хранить при температуре -80 ° С до использования.
    Примечание: Для длительного хранения при температуре -20 ° C магазине в 9% сахарозы, 7 мм MgCl 2, 50 мМ фосфатного буфера, 44% глицерина.
  10. Разрежьте мозг в 10-12 мкм толстых секций по соответствующим cryomicrotome.
    Примечание: Для толстых, свободно плавающих секций, заморозить мозг на замораживающий микротом этапе соответствующей замораживающий микротом (например Райхерта Юнг, Frigomobil.) И сократить 40 мкм горизонтальные участки на -20 ° до - 25 ° С. Сбор разделы из ножа с тонкой кистью и собирать в буфере или держать в растворе для хранения (шаг 4,9) при температуре -20 ° С в течение длительного хранения.
  11. Осторожно установите два ломтика на отдельных слайдов микроскопа. Наме Superfrost Ultraplus слайдов настоятельно рекомендуется, чтобы максимизировать сцепление секциях.
  12. Высушите слайды в течение 5 мин при комнатной температуре. Слайды можно хранить при -80 ° С до использования.

5. Подготовка разделов из перфузии животных

  1. Обезболить животных, как описано выше (шаг 4.2).
  2. Осторожно заливать животное транскардиально забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS), содержащим гепарин (0,025 г/100 мл PBS) и прокаина (0,5 г/100 мл PBS) в течение 2-4 мин, а затем 4% параформальдегида в PBS в течение 10-15 мин . Перфузии оптимально выполнены перфузии через левый желудочек и открытия правого предсердия с использованием гидростатическое давление приблизительно 1,2-1,4 м или с использованием перистальтического насоса установлен в примерно 15 мл / мин. Оптимальные результаты перфузии в бледно-белой мозга с не будучи видимым не красные кровяные сосуды.
  3. Проанализируйте и после исправить мозги в 4% параформальдегида при 4 ° С в течение 24 часов.
  4. Криогенныйзащитить мозг в 30% сахарозы в PBS при 4 ° С в течение не менее 24 часов.
  5. Замораживание мозги на сцене замораживающий микротом.
  6. Подготовка 40 мкм горизонтальных участков из целых переднего мозга с помощью соответствующего замораживающий микротом.
  7. Слайды можно хранить в криопротекторов раствора (0,1 М фосфатный буфер, 50% глицерина, 0,14% MgCl 2, 8,6% сахарозы) при -20 ° С до использования.

6. Иммуногистохимия срезах мозга Nonperfused Животные

  1. После фиксации криосрезов, полученный как описано выше, с использованием -20 ° C холодным метанолом в течение 10 мин.
  2. Блок 5% нормальной сыворотки, содержащей 0,3% Triton-X (от вида, который был использован для повышения вторичного антитела) в течение ночи при 4 ° С.
  3. Промыть 3 раза с 1x PBS и инкубируют с первичными антителами в течение ночи при 4 ° С.
  4. Промыть 3 раза с 1x PBS и инкубировали с вторичными антителами при комнатной температуре в течение одного часа.
  5. Промыть 3 раза с 1x PBS
  6. Кулоновскогоnterstain разделе для ДНК с использованием Sytox зеленый, или DAPI (или альтернативный краситель ДНК).
  7. Промыть 3 раза с 1x PBS
  8. Вставить разделы в водной вложение среды.
  9. Пусть вложение среднего полимеризации, по крайней мере 48 часов.

7. Иммуногистохимия срезах мозга перфузии животных

  1. Блок как описано на стадии 6.2, и затем инкубируют фиксированные срезы головного мозга в растворе первичного антитела, разведенного в PBS, содержащий 0,3% Triton-X (свободно плавающих) в течение ночи при 4 ° С.
  2. Промыть три раза 1x PBS и инкубируют в растворе вторичного антитела, разведенного в PBS, содержащем 0,3% Тритон-X (свободно плавающих) при комнатной температуре в течение 3 часов.
  3. Промыть 3 раза с 1x PBS
  4. Контрастирующая раздел для ДНК с использованием Sytox зеленый или DAPI (или альтернативный краситель ДНК).
  5. Промыть три раза 1x PBS
  6. Вставить разделы в водной вложение среды.
  7. Пусть вложение среднего полимеризации длят мере 48 ч.

8. Исследование прогнозам Мшистые Fiber

  1. Жертвоприношение животных, подготовить 40 мкм корональные разделы, как описано выше, и окрашивает гиппокампа раздел использованием антитела для нейрофиламентов М.
  2. Сканирование разделы на соответствующей длине волны с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии для визуализации замшелые волокна и ядра. Запустите сканирование при малом увеличении.
  3. Используйте изображения низкой кратности для ориентации и целевой гиппокамп с прогнозами моховой волокна.
  4. Сканирование разделы (Z-секционирования) с высоким разрешением и большим увеличением.
  5. Анализ морфологического внешний вид и связность мшистых волокон визуализированных с помощью окрашивания для NF-М.
  6. (По выбору) Проанализируйте размер и объем гиппокампа лопастей. Используйте сигнал ДНК для измерения.

9. Фтор-Джейд C Анализ (нервных клеток Смерть)

  1. Жертвоприношение животных, рассекают hippocAmpus и подготовить 12 мкм секций, как описано выше.
  2. Пусть секции высохнуть в течение 30 мин при комнатной температуре.
  3. Fix разделы в 4% PFA в течение 40 мин при комнатной температуре.
  4. Кратко мыть секции 3x с DDH 2 O.
  5. Инкубируйте разделы с 0,06% перманганата калия (KMnO 4) в течение 10 мин при непрерывном, осторожном встряхивании.
  6. Вымойте разделы 3x с DDH 2 O.
  7. Инкубируйте разделы с 0,002% Фтор-Джейд С раствору в течение 20 мин при комнатной температуре.
  8. (По выбору) для одновременного ядерных окрашивания, решение 0,002% Фтор-Джейд С можно с добавлением 10 мкг / мл DAPI.
  9. Кратко мыть секции 3x с DDH 2 O.
  10. Пусть секции высохнуть в течение 30 мин при комнатной температуре.
  11. Инкубируйте секций с ксилолом (1 мин)
  12. Установите секции с использованием ксилола основе монтажное среды (DPX).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Скрещивание из IκB / - и TTA трансгенных линий мышей приводит к условной ингибирования NF-kB активности в гиппокампе.

Чтобы исследовать экспрессию IκBα-AA1-трансгена в двойной трансгенной мыши (фиг.1А), мозги были изолированы, cryosectioned и окрашивали с использованием антитела против GFP (зеленый флуоресцентный белок). Конфокальной лазерной сканирующей микроскопии показало высокую экспрессию трансгена в СА1 и СА3 регионах и в ГД (фиг.1В).

IκBα-AA1-трансген выражается в тип-2b предшественников, и принимает активное участие в промежуточных незрелых государств и в зрелых зернистых клеток.
Чтобы определить самую раннюю тип клеток, выражающую CAMKIIα-приводом IκBα-AA1 в гиппокампа нейрогенной области, криосрезы из гиппокампа от IκB / TTA животных окрашивали на doublecortin(DCX) и трансген (GFP). Конфокальной анализ показал GFP-сигналы у молодых DCX-положительных зернистых клеток, указывая индукцию экспрессии трансгена по CAMKIIα-активности (рис. 2, стрелки).

Нейронов NF-kB ингибирование через IκBα-AA1 снижает замшелые прогнозы волокна, а толщина и объем ГД.

Корональные разделы гиппокампе IκB / TTA и IκB / - мышей окрашивали на нейрофиламентов М (NF-M) для визуализации замшелые прогнозы волокна, и раскрыть сложную и пучковой организацию (рис. 3). У мышей IκB / TTA, прогнозы моховой волокна были сильно поражены. Кроме того, NF-kB ингибирование привело к значительному снижению suprapyramidal толщины лезвия и меньшего объема DG (фиг.3В).

Нейронов ингибирование NF-kB в мышах IκB / TTA приводит к повышенной нейронной вырождениярации, увеличение нейрогенез, и нарушается миграция DCX-выражающих предшественников.

Чтобы изучить потенциальные причины драматических структурных дефектов, свежие, нефиксированные срезы гиппокампа мышей IκB / TTA окрашивали фтор-Jade С, что позволяет конкретную обнаружение гибели нейронов (рис. 4а). Здесь резко возросло число вырождающихся нейритах наблюдались в двойных трансгенных животных, по сравнению с одиночными трансгенных управления. Кроме того, значительное увеличение расщепленных каспазы-3-положительных апоптотических клеток был обнаружен у мышей IκB / TTA. Напротив, иммуногистохимического окрашивания против DCX показали значительно увеличилось количество DCX + клеток в мозге мышей IκB / TTA. Кроме того, DCX + клеток в IκB / TTA-гиппокампе не были расположены исключительно в зоне под зернистым, но были также найдены в более глубоких областей DG (фиг.4В), тогда как DCX +-предшественники ян контрольные животные были локализованы почти исключительно в субгранулярной зоне. Чтобы проверить, если повышенное количество DCX-экспрессирующих клеток является результатом созревания ранних предшественников или непосредственно в связи с распространением DCX + клеток, BrdU вводили в гиппокампе из IκB / TTA и контрольных мышей, которые затем были cryosectioned и окрашивали DCX и BrdU (рис. 4). Для анализа пролиферации, вводили BrdU раз (см. фиг.4В, схему), с последующим анализом после 24 часов. Для анализа дифференциации, три инъекции проводились ежедневно, с последующим анализом после семи дней. После однократного BrdU-инъекции, никаких существенных различий в общем количестве BrdU-положительных клеток между IκB/tTA- и контрольных животных не наблюдалось, тогда как три последовательные инъекции-подход показал ясно повышенное количество BrdU / DCX + клеток в ГД мышей IκB / TTA. Это означает, что нарушается дифференциация или интеграция DCX-EXактуальные клетки, возможно, вызвало повышенные количества DCX + клеток, и предполагает, что тип-3 клетки были вовлечены.

Нейронов ингибирование результатов NF-kB в тяжелых обучения дефектов, о чем свидетельствует Разделение-Барнс Maze теста пространственной картины. Чтобы специально протестировать поведение двойной трансгенных мышей в DG-зависимой задачи мы использовали SPS-BM, в результате чего животные должны различать местах с тонкими различиями (рис. 5). В этом поведенческой испытании, IκB / - контрольные животные исследовали пищевые домов серийно в первый день эксперимента (рис. 5). После семи дней обучения, животные были в состоянии найти открытую продовольственной дом непосредственно. В противоположность этому, IκB / TTA животные продолжали исследовать продовольствие домов последовательно, даже после обучения (фиг.5В). Наблюдение значительным увеличением расстояния, пройденного и высокими задержками и эрROR ставки в IκB / TTA животных, по сравнению с IκB / - контрольных животных, предполагает, что эти животные были серьезные дефекты обучения (рис. 5, в).

Рисунок 1
Рисунок 1. Генерация условного переднего мозга конкретных ингибирования NF-kB деятельности. А. Схематическое изображение трансгенных моделей, используемых для изучения роли NF-kB в взрослого гиппокампа нейрогенеза. Кальций-кальмодулин-зависимой киназы IIα (CAMKIIα) промоутер управляемой тетрациклин трансактиватор (TTA) мышей используется для регулирования экспрессии транс-доминирующего негативного мутанта IκBa (IκBa-AA1 супер-репрессор в IκB мышей) в сочетании с зеленого флуоресцентного белка трассирующей (GFP). У мышей IκB / TTA, NF-kB хранится в цитоплазме в неактивном станцийт. е. по разрушается IκBa-AA1, которые могут быть обнаружены с помощью GFP-флуоресценции. Торможение может быть обращено доксициклин, который ингибирует TTA выражение Б. Представительство трансгена. В разных гиппокампа регионах мышей IκB / TTA (АК1, СА3 и DG). Криосрезов были получены из изолированных мозге IκB / - и IκB / TTA мышей, и фиксировали и окрашивали с использованием антитела против GFP. Обратите внимание, что трансген экспрессируется на высоком уровне в ГД. Де: Дендриты, Д. Г.: зубчатой ​​извилине, М. Л.: молекулярная слой; SL: Слой лукидум. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 2
Рисунок 2. IκBa-AA1 трансген выражается в DCX-положительных, тип-2b progenit ПРС и принимает активное участие в дальнейших промежуточных состояний и в зрелых зернистых клеток. А. Cryosectioned Гиппокамп из IκB / TTA животных с doublecortin (DCX) окрашивания и выражения GFP выявить экспрессию трансгена в молодых DCX-положительных зернистых клеток (стрелки). Д.Г.: зубчатой ​​извилине, М. Л.: молекулярная слой Б. Схематическое изображение трансгенной экспрессии в разных стадиях развития в процессе разработки гранул клеток.. IκBa-AA1-трансген выражение был обнаружен в DCX-положительных, Тип-2b предшественников, всех промежуточных незрелых государств и в зрелых зернистых клеток. Напротив, ранние типа 1 и типа 2а предшественники (лишенные DCX-выражение) не выразил трансген, и поэтому были не влияет на NF-kB торможения. Изменения после Kempermann др.. 20 Нажмите здесь, чтобы загрузить увеличенное изображение.

н я "> Рисунок 3
Рисунок 3. NF-kB торможение приводит к обесцененным проекций мшистых волокон и уменьшенной толщиной DG и объема у мышей IκB / TTA, по сравнению с одной трансгенной контроля (IκB / -). А. Иммуноокрашивание cryosectioned гиппокампе для нейрофиламентов М (NF-M) для визуализации замшелые прогнозы волокна. У контрольных мышей (IκB / -), сложная и пучковой организация замшелых волокон, соединяющих зернистых клеток их клеток-мишеней в СА3 очевидно, что была нарушена после нейронов ингибирования NF-kB в мышей IκB / TTA. Более того, экспрессия супер-репрессор привело к значительному снижению suprapyramidal толщиной лезвия (ср. стрелка на левой и правой панели) и уменьшенным объемом DG. Б. Количественное и статистического анализа структурных дефектов в результате NF-kB торможения. Непарное Т-тест, двухсторонний. Данные взяты из ОА-версии Imielski др.. 2 Щелкните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 4
Рисунок 4. Ингибирование NF-kB в мышах IκB / TTA приводит к увеличению гибели нейронов, усиливается нейрогенез, и нарушенный миграционную картину DCX-экспрессирующих клеток. А. Neuron конкретных фтор-нефрит C окрашивание и увеличение числа расщепленных каспазы-3-позитивных клеток гиппокампа в секциях показывает более высокий уровень гибели нейронов у мышей IκB / TTA, чем в IκB / - Управление. Вырождающейся нейриты обозначены стрелками, и ядра помечены звездочками. Право на сайте: количественная оценка скола каспазы-3-роsitive клетки в гиппокампе предлагает существенно увеличена апоптоз в двойных трансгенных животных. B. Окрашивание гиппокампа криосрезов для DCX показывает увеличенное количество DCX-экспрессирующих клеток в двойных трансгенных животных. Обратите внимание, что DCX + клеток в IκB / TTA-гиппокампе не расположены исключительно в субгранулярной зоне, но мигрировали вглубь ГД чем в IκB / -. Контроль C. Левая панель: Для проверки влияния трансгена на пролиферацию, один BrdU впрыском была выполнена, в результате которой без существенных различий в количестве BrdU-позитивных клеток между IκB / TTA и управления правой панели:. Статистическая оценка показала значительное увеличение DCX-экспрессирующих клеток в IκB / TTA животных после трех ежедневных BrdU-инъекций. Анализ проводился семь дней после последней инъекции (тест дифференциации и интеграции). Значительное увеличение BrdU / DCX + был обнаружен в ГД Iмышей κB / TTA (п = 3). Данные частично взяты из ОА-версии Imielski др.. 2 Щелкните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 5
Рисунок 5. Установка и типичные результаты пространственной структуры разделения-Barnes лабиринт (SPS-BM). А. Слева: Схематическое изображение экспериментальной установки. Семь одинаковых пищевых дома (одного цвета, размера и формы) были размещены симметрично на определенных точках круглого, домашний пластины построен с жесткого инертного пластика (диаметр 120 см), с одним свободным месте (начиная точки, S). Разноцветные экстра-лабиринт сигналы (ЭМС) крепятся перед белому тканью в позициях легко видимого к животным, примерно 100 см от бПорядок пластины. Чтобы избежать ориентации по запаху, пищевые гранулы откладываются в каждом доме, но только один пищевой Дом доступны (закрытие сделаны из прозрачной пленки). Справа: Видеокамера сосредоточены на тарелке (расстояние до тарелки: 115 см), и фотографией набору параметров, включая экстра-лабиринт киев Б. Типичные экспериментальные результатов теста SPS-БМ.. IκB / - контроль животных исследует пищевые домов серийно в первый день серии испытаний, и открытая еда дом находится сразу после семи дней обучения. Напротив, мыши, IκB / TTA выявить хуже обучения, о чем свидетельствует серийного освоения даже после этапа обучения С. Сравнение параметров, измеренных в SPS-BM в IκB / -., И IκB / TTA животных. Двойные трансгенных мышей показывают существенные нарушения памяти (N = 9) по сравнению с контрольной группой (п = 8) по отношению к латентности, пройденное расстояние и частота ошибок. оценка ANOVA двусторонняя; планки погрешностей: SEM. Данные в B иС были взяты из ОА-версии Imielski соавт. 2 Щелкните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Взрослый нейрогенез, а также возможность его манипуляции через ингибирование NF-kB в нейронах, и его последующего возобновления через доксициклин, предлагает увлекательные систему для расследования новорожденных нейронов в головном мозге взрослых, а также в нейронной де-и повторного поколения . Красота этой системы является то, что NF-kB сигнальный путь торможения в нейронах приводит не только к изменениям в гибели нейронов, пролиферации предшественников и миграции, и серьезными структурными и анатомических изменений, но и в очевидных дефектов обучения. Важно отметить, что фенотип IκB / TTA животных может быть экспериментально отменено, и спас после введения доксициклином. Это возвращение фенотипа включает структурные аспекты, а также может привести к значительному улучшению DG-зависимых обучения 2.

Для обеспечения интерпретируемые исход для поведенческих экспериментов, очень важно, чтобы только самцов с возрастом Differeсть менее четырех дней будут использоваться. Кроме того, все серии испытаний должны быть выполнены одним и тем же оператором. Что касается комнату тестирования, мы настоятельно рекомендуем выполнять испытание в акустически изолированной среде, чтобы избежать стресса и потери внимания в результате внешних источников шума. Для предотвращения ориентацию, основанный на обнаружении запаха вместо экстра-лабиринт киев, закрытые пищевые дома не должны быть доступны для животного, и обычный воздух и запах циркуляции должно быть разрешено. Кроме того, пластина, используемая для испытания должны быть построены из нейтральным запахом и моющих средств-стойкого материала, и должны быть тщательно очищены от эксперимента к эксперименту. Другим потенциальным источником экспериментальной вариации освещенности комнаты. В качестве источника света должно быть достаточно ярким, чтобы позволить приобретение изображения, признание экстра-лабиринт киев, и, чтобы вызвать поведение полета, но они не должны быть интенсивностью, чтобы ослепить животное. Кроме того, мы предлагаем, проводящая испытания для каждого животного в то же времясуток, чтобы избежать циркадные вариации.

Mus Musculus имеет довольно хорошую способность видения, которое, в естественных условиях, в частности, используются для обнаружения территориальные границы на визуально поразительных особенностей (визуальные подсказки, как деревья) (Латам и соавт., И ее применения. Животных Behav. Научно. 86 (3-4 ), 261-289, 2004). В классическом эксперименте Balkema соавт. (Дж. Neurophysiol. 48 (4), 968-980, 1982) помещены 6, 0, и -7 диоптрический линзы в глазах мыши и не наблюдали значительных изменений восприимчивых размеров поля в сетчатке ганглиозных клеток. Из-за этой огромной глубины резкости визуальных стимулов (например, экстра-лабиринт сигналы) могут быть размещены в большом диапазоне расстояний перед мышей и остаются в фокусе. В нашем подходе, расстояние экстра-лабиринт сигналы от отправной точки был 30 см от границы пластины, которая в соответствии с литературе (например, 140 см в WOng соавт., Genes Brain Behav. 5 (5), 389-403, 2006)

Грызуны имеют тенденцию оставаться близко к стенам открытом поле. Такое поведение определяется как thigmotaxis (Barnett, SH, крыса: исследование в поведении, Aldline издательство, Чикаго, стр. 31-32, 1963). Недавнее исследование, проведенное О `Лири и др.. (Behav. Brain Res. 216 (2), 531-542, 2011) продемонстрировали, что C57BL/6J мыши показали лучшее обучение в лабиринте Barnes по сравнению с другими штаммами 12 мышей. 28% подвергаемых испытанию мышей использовали пространственного поиска, тогда как 64% использовали серийный-thigmotactic стратегии. Эти данные справедливо для небольшого лабиринта с диаметром 69 см с 15 см от стены окружающих. Однако мыши, протестирован на большой лабиринт без стен или intramaze сигналы, как наша установка (диаметр 120 мкм) были надежно показано доказательств для использования в основном экстра-лабиринт визуальные подсказки (см., например, Бах и др.., Сотовый. +81 вызванные, например, МС различий, пластина была повернута после каждого эксперимента.

Поведенческий тест может быть просто адаптирован для исследования влияния других факторов транскрипции на взрослого гиппокампа нейрогенеза, используя соответствующие модели мыши. Тем не менее, он в основном предназначен для проверки DG-зависимую обучения (разделение пространственная структура), и может не подходить для исследования нейрогенеза или дегенерации нейронов в других областях мозга. В этом отношении, использование SPS-BM далее ограничивается его DG-специфичностью (строгой зависимости от функционального цепи между ЕС II и ГД и СА3 и СА1 и ЕС VI), и поэтому не следует применять для исследования задач, связанных с моносинаптического ЕС III - АК1 - EC V - замыкание.

Будущие применения способов, описанных здесь, могут включать изучения влияния трансплантации стволовых клеток, фармацевтическимиTical лечения на взрослого гиппокампа нейрогенеза и тканевого гомеостаза в гиппокампе.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют никакого конфликта интересов.

Acknowledgments

Мы благодарим Ангела Kralemann-Келера за отличную техническую поддержку. Экспериментальная работа описано здесь проводили в нашей лаборатории и была поддержана грантами немецкого исследовательского совета (DFG) в СК и ВК и гранта немецкого Министерства науки и образования (BMBF) в БК.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Moria MC17 Perforated Spoon  FST 10370-18 removal of the brains
Dissecting microscope Carl Zeiss Stemi SV8 removal of the brains
Surgical scissors  FST 14084-08 removal of the brains
Surgical scissors  FST 14381-43 removal of the brains
Dumont #5 forceps FST 11254-20 removal of the brains
SuperFrost Slides Carl Roth 1879 slides for immunohistochemistry
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 fixative
TissueTek OCT compound Sakura Finetek 1004200018 embedding of the brains
Normal Goat Serum Jackson Immunolabs 005-000-001 blocking in IHC
Normal Rabbit Serum Jackson Immunolabs 011-000-001 blocking in IHC
Normal Donkey Serum Jackson Immunolabs 017-000-001 blocking in IHC
anti-Neurofilament-M antibody Developmental Studies Hybridoma Bank 2H3 IHC, Dilution 1:200
anti-Doublecortin antibody sc-8066 Santa Cruz IHC, Dilution 1:800
anti-GFP antibody Abcam ab290 IHC, Dilution 1:2,000
anti-BrdU antibody OBT0030G Accurate Chemicals IHC, Dilution 1:2,000 
Fluoro-Jade C FJ-C HistoChem Determination of neuronal cell death
Betadine Mundipharma D08AG02 disinfectant
Cryomicrotome Leica CM1900 preparation of brain slices
Heparin sodium salt Sigma-Aldrich H3393 perfusion
Circular plate made from hard-plastic (diameter 120 cm) lab made none plate for SPS-BM, diameter 120 cm
Buraton rapid disinfectant  Schülke Mayr 113 911 disinfectant
Video-tracking system TSE VideoMot 2 with Software Package VideoMot2 TSE Systems 302050-SW-KIT tracking and analysis of SPS-BM
Triton X-100  Sigma Aldrich T8787 permeabilization/IHC
Cryotome Reichert Jung/Leica Frigomobil 1206 preparation of 40 µm brain slices
Mowiol 4-88 Carl Roth Art.-Nr. 0713 embedding of the slides
SYTOX green Invitrogen S7020 Nuclear staining
Food pellets (Kellog`s Froot Loops) Kellog`s SPS-BM
Prism, Version 3.0 Graph Pad Software, San Diego, USA Statistical evaluation of SPS-BM
Zen 2008 or Zen 2011 Software Carl Zeiss Software (Confocal microscope)
D.P.X Sigma-Aldrich 317616 mounting medium for Fluoro-Jade C staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gutierrez, H., Davies, A. M. Regulation of neural process growth, elaboration and structural plasticity by NF-kappaB. Trends Neurosci. 34, 316-325 (2011).
  2. Imielski, Y., et al. Regrowing the adult brain: NF-kappaB controls functional circuit formation and tissue homeostasis in the dentate gyrus. PLoS One. 7, (2012).
  3. Zheng, M., et al. Intrahippocampal injection of A beta(1-42) inhibits neurogenesis and down-regulates IFN-gamma and NF-kappaB expression in hippocampus of adult mouse brain. Amyloid. 20 (1-42), 13-20 (2013).
  4. Denis-Donini, S., et al. Impaired adult neurogenesis associated with short-term memory defects in NF-kappaB p50-deficient mice. J. Neurosci. 28, 3911-3919 (2008).
  5. Bracchi-Ricard, V., et al. Astroglial nuclear factor-kappaB regulates learning and memory and synaptic plasticity in female mice. J, Neurochem. 104, 611-623 (2008).
  6. Koo, J. W., Russo, S. J., Ferguson, D., Nestler, E. J., Duman, R. S. Nuclear factor-kappaB is a critical mediator of stress-impaired neurogenesis and depressive behavior. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 2669-2674 (2010).
  7. Fridmacher, V., et al. Forebrain-specific neuronal inhibition of nuclear factor-kappaB activity leads to loss of neuroprotection. J. Neurosci. 23, 9403-9408 (2003).
  8. Whiteside, S. T., et al. C-terminal sequences control degradation of MAD3/I kappa B alpha in response to inducers of NF-kappa. B activity. Mol. Cell. Biol. 15, 5339-5345 (1995).
  9. Mayford, M., et al. Control of memory formation through regulated expression of a CaMKII transgene. Science. 274, 1678-1683 (1996).
  10. Rosenfeld, M. E., Prichard, L., Shiojiri, N., Fausto, N. Prevention of hepatic apoptosis and embryonic lethality in RelA/TNFR-1 double knockout mice. Am. J. Pathol. 156, 997-1007 (2000).
  11. Morris, R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J Neurosci. Methods. 11, 47-60 (1984).
  12. Barnes, C. A. Memory deficits associated with senescence: a neurophysiological and behavioral study in the rat. J. Compar. Physiol. Psychol. 93, 74-104 (1979).
  13. Brun, V. H., et al. Place cells and place recognition maintained by direct entorhinal-hippocampal circuitry. Science. 296, 2243-2246 (2002).
  14. Meshi, D., et al. Hippocampal neurogenesis is not required for behavioral effects of environmental enrichment. Nat. Neurosci. 9, 729-731 (2006).
  15. Bakker, A., Kirwan, C. B., Miller, M., Stark, C. E. Pattern separation in the human hippocampal CA3 and dentate gyrus. Science. 319, 1640-1642 (2008).
  16. Dupret, D., et al. Spatial relational memory requires hippocampal adult neurogenesis. PLoS One. 3, (2008).
  17. Leutgeb, J. K., Leutgeb, S., Moser, M. B., Moser, E. I. Pattern separation in the dentate gyrus and CA3 of the hippocampus. Science. 315. , 961-966 (2007).
  18. Kaltschmidt, B., et al. NF-kappaB regulates spatial memory formation and synaptic plasticity through protein kinase A/CREB signaling. Mol. Cell. Biol. 26, 2936-2946 (2006).
  19. Clelland, C. D., et al. A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation. Science. 325, 210-213 (2009).
  20. Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).

Tags

Neuroscience выпуск 84 NF-kB гиппокамп нейрогенез пространственная структура разделения-Барнс лабиринт зубчатой ​​извилине p65 нокаут-мышей
Методы модуляции и анализа NF-kB-зависимой нейрогенез
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Widera, D., Müller, J.,… More

Widera, D., Müller, J., Imielski, Y., Heimann, P., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B. Methods for the Modulation and Analysis of NF-κB-dependent Adult Neurogenesis. J. Vis. Exp. (84), e50870, doi:10.3791/50870 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter