Metoder för modulering och analys av NF-KB-beroende Vuxen Neurogenes

Summary

Metoder för manipulering och analys av NF-KB-beroende vuxna hippocampus neurogenes beskrivs. Ett detaljerat protokoll presenteras för en gyrus dentatus beroende beteendetest (benämnd den rumsliga mönstret separation-Barnes labyrint) för utredning av kognitiva utfall i möss. Denna teknik bör också bidra till att göra det möjligt för undersökningar i andra experimentella inställningar.

Abstract

Hippocampus spelar en central roll i bildandet och konsolideringen av episodiska minnen, och rumslig orientering. Historiskt sett har den vuxna hippocampus setts som en mycket statisk anatomisk region i däggdjurshjärnan. Dock har de senaste rön visat att gyrus dentatus i hippocampus är ett område med enorma plasticitet hos vuxna, som inte bara modifieringar av befintliga neuronala kretsar, men också vuxna neurogenes. Denna plasticitet regleras av komplexa transkriptions nätverk, där transkriptionsfaktorn NF-kB spelar en framträdande roll. Att studera och manipulera vuxen neurogenes, en transgen musmodell för hjärnan specifik neuronal hämning av NF-kB aktivitet kan användas.

I denna studie, är metoder som beskrivs för analys av NF-kB-beroende neurogenes, inklusive dess strukturella aspekter, neuronal apoptos och stamfader spridning, och kognitiv betydelse, which specifikt bedömts via en gyrus gyrus (GD) beroende beteendetestet, det rumsliga mönstret separation-Barnes labyrint (SPS-BM). SPS-BM-protokoll kan enkelt anpassas för användning med andra transgena djurmodeller som syftar till att bedöma inverkan av vissa gener på vuxna hippocampus neurogenes. Vidare skulle SPS-BM användas i andra experimentella inställningar som syftar till att undersöka och manipulera GD beroende lärande, exempelvis med användning av farmakologiska medel.

Introduction

Ontologiskt är hippocampus ett av de äldsta anatomiska hjärnstrukturer kända. Den ansvarar för olika komplexa uppgifter, såsom centrala funktioner i regleringen av långtidsminnet, rumslig orientering och bildning och konsolidering av respektive minne. Anatomiskt, hippocampus består av pyramidal cellager (stratum pyramidale) inklusive Cornu Ammonis (CA1, CA2, CA3 och CA4) regioner och gyrus dentatus (gyrus dentatus), som innehåller granulat celler och några neuronala stamceller inom sitt subgranular zon . De granulceller projicera mot CA3-regionen via de så kallade mossfibrer (axoner av granulceller).

Fram till slutet av förra århundradet, var den vuxna däggdjurshjärnan som tros vara ett statiskt organ som saknar cellulär plasticitet och neurogenes. Men under de senaste två decennierna, visar vuxen neurogenes sker i en växande mängd bevis klart minsttvå hjärnregioner, subventrikulära zonen (SVZ) och subgranular zon av hippocampus.

Våra tidigare studier, och de av andra grupper, har visat att transkriptionsfaktorn NF-kB är en av de avgörande molekylära regulatorer av vuxen neurogenes, och att dess avreglering leder till allvarliga strukturella hippocampus defekter och kognitiva försämringar ^1-6. NF-kB är samlingsnamnet på en inducerbar transkriptionsfaktor som består av olika dimera kombinationer av fem DNA-bindande subenheter: P50, P52, c-Rel, RelB, och p65 (RelA), de tre sistnämnda som har transaktiveringsdomäner. Inom hjärnan, den vanligast förekommande formen finns i cytoplasman är en heterodimer av p50 och p65, som hålls i inaktiv form genom hämmare av kappa B (iKB)-proteiner.

För att studera och direkt manipulera NF-kB-driven neurogenes använder vi transgena musmodeller för att möjliggöra enkel hämning av alla av NF-KB subunsin, särskilt i framhjärnan ⁷ (se figur 1). För detta ändamål, vi Korsning följande transgen mus linjer, IkB / - och -/tTA. Transgen iKB / - linjegenererades med användning av en negativ transdominant mutant av NF-KB-inhibitor IκBa (super-repressor IκBa-AA1) ^8. I motsats till vildtyp iKBa har iKBa-AA1 två serinrester muterade till alaniner (V32 och V36), som hindrar fosforylering och efterföljande proteasomal nedbrytning av inhibitorn. För framhjärnan neuron-specifikt uttryck för den IκBa-AA1-transgen, iKB / - möss kors uppvuxna med möss som härbärgerar en kalcium-kalmodulinberoende kinas Ila (CAMKIIα)-promotor som kan drivas av tetracyklin trans-aktivator (TTA) ^9.

p65 knock-out-möss har en embryonal letal fenotyp, på grund av omfattande lever apoptos ^10, så det tillvägagångssätt som visas här ger en elegant metodför att undersöka rollen av NF-kB i postnatal och vuxen neurogenes.

Den klassiska beteendetestet för att studera spatial inlärning och minne beskrevs på 1980-talet av Richard Morris, ett test som kallas Morris water-maze (MWM) ^11. I detta öppna fält vatten-labyrint, djur lär sig att fly från ogenomskinligt vatten på en dold plattform som bygger på orientering och extra labyrint ledtrådar. En torr variant av MWM är den så kallade Barnes labyrint (BM) ^12. Detta test använder en cirkulär platta med 20 Cirkulära hål vid gränsen av en platta, med en definierad hål som en flykt rutan och visuella extra labyrint ledtrådar för orientering. Både experimentella paradigm är beroende av flygbeteende som framkallas av en gnagare `s motvilja mot vatten, eller öppna, ljust upplysta utrymmen. Båda testerna möjliggöra en undersökning av rumslig orientering, och den relaterade minnesprestanda. Även hippocampus spelar en allmän och viktig roll i det rumsliga minnesbildande, hippocampus regions inblandade varierar beroende på testet tillämpas. Den testas i BM minnet uppstår nervaktivitet mellan enthorinal cortex (EG) och de pyramidala neuron belägna i CA1-regionen i hippocampus utan ett bidrag från GD ^13-16. I synnerhet den klassiska BM bygger i huvudsak på navigering via monosynaptic temporo-ammonic vägen från EG III till CA1 till EG V. Viktigt är GD avgörande inblandade i den så kallade rumsliga mönsterigenkänning ^17, vilket innebär inte bara behandlingen av visuell och rumslig information, utan även omvandlingen av liknande utfästelser eller minnen i olika, nonoverlapping representationer. Här krävs en funktionell tri-synaptiska krets från EC II till GD till CA3 till CA1 och EG-VI, som inte kan testas i BM ^15.

För att möta dessa utmaningar har vi tagit fram SPS-BM som ett beteendetest för att specifikt testa gyrus dentatus beroende kognitiv prestation i samarbetentrol djur, och i IkB / tTA super-repressor modellen efter NF-kB inhibition. Viktigt är att i motsats till den MWM eller BM, kan SPS-BM avslöja subtila beteendestörningar till följd av försämring av neurogenes. Eftersom spatial-mönster-separationen är helt beroende av en fungerande krets mellan EG II och GD och CA3 och CA1 och EG VI, är mycket känslig för eventuella förändringar i neurogenes, ändringar av den mossiga fibervägen eller ändringar av vävnad homeostas inom detta test GD.

Tekniskt sett är det utformningen av vårt test baserad på studien från Clelland et al., Där den rumsliga separationen mönstret testades med hjälp av ett trä 8-arm radial arm labyrint (RAM) ^19. I vår modifierade set-up, var de åtta armarna ersätts av sju identiska gula mat hus. Sammanfattningsvis, de metoder som visas här, inklusive analys av doublecortin-uttryckande (DCX +) celler i hippocampus, den mossiga fiber projektioner, neuronal cell death och särskilt SPS-BM presenteras här, kan tillämpas på undersökningar av andra musmodeller som innehåller transgener som påverkar den vuxna neurogenes. Ytterligare program kan omfatta studier av farmakologiska medel och mäta deras inverkan på GD och rumsliga mönster separation.

Protocol

Ethics uttalande

Denna studie genomfördes i strikt överensstämmelse med bestämmelserna i den statliga djur-och omsorg användning kommitté, LANUV av staten Nordrhein-Westfalen, (Düsseldorf, Tyskland). Alla djurförsök har godkänts av LANUV, Düsseldorf under licensnummer 8.87-51.04.20.09.317 (LANUV, NRW). Alla ansträngningar gjordes för att minimera lidande och det antal djur som behövs för studien.

1. Djurvård och bostads

1. Alla djur som används i de protokoll som beskrivs här bör hållas under specifika patogenfria förhållanden, enligt definitionen i federationen Europeiska Laboratory Animal Science Association (FELASA).
2. Möss bör hållas i standardburar i en temperatur-och fuktkontrollerade (22 ° C) rum i dagaktiva förhållanden (12 timmar ljus / mörker-cykel) med HEPA-filtrerad luft.
3. Standardiserad mat och vatten bör ges ad libitum. </ Li>
4. Om IkB / tTA och IkB / - kontroll möss används bör PCR-baserad genotypning utföras för varje djur som beskrivs i ^{7, 18.}
5. Hanhundar med en åldersskillnad på mindre än fyra dagar bör användas för att minska individuell variabilitet.
6. (Tillval): För NF-kB reaktiveexperiment, doxycyklin måste administreras i dricksvatten (2 mg / ml med 2,5% sackaros) i minst 14 dagar.

2. Spatial Pattern Separation-Barnes Maze (SPS-BM)

1. Alla beteende testning bör utföras i enlighet med internationella och lokala riktlinjer.
2. VIKTIGT! Använd endast hanmöss med en sex månaders ålder eller äldre. Skillnaden mellan djur av en testserie ålder bör vara mindre än fyra dagar. Provningen ska utföras av samma operatör för varje serie. Mössen bör få en standarddiet innan testning för att ytterligare öka motivationen delvis driven av såweet matbelöning.
3. Inrätta en vit rund platta gjord av hårdplast (diameter 120 cm, se figur 5A) i en fukt-och temperaturreglerade rum (22 ° C), belyst med minst 4 x 80 W och 3 x 215 W neon lysrör . VIKTIGT! Se till att rätt belysning används som motivation för mössen att komma in i livsmedels husen är delvis driven av sin motvilja mot ljusa, utsatta platser.
4. Ställ in video-tracking system. Kameran bör placeras 115 cm ovanför centrum av plattan (se figur 5A).
5. Bifoga mångfärgade extra labyrint ledtrådar (EMC) till ett vitt tyg i lägen väl synliga för djuren, ca 100 cm från kanten av plattan (se Figur 5A).
6. Rengör försiktigt plattan med en snabb desinfektionsmedel som kan ta bort någon lukt från försöksuppställningen.
7. Placera sju identiska gula mat hus (12 cm x 7 cm x 8 cm, se figur 5A figur 5A).
8. Placera söta livsmedel pellets belöningar (en fjärdedel av en Kellogs `s Froot Loop / mat hus) inne alla livsmedels hus på definierade positioner (se figur 5A) med endast en definierad mat hus är fritt tillgänglig för djuret (plats F, se figur 5A ). Stäng nontarget livsmedels hus med genomskinlig folie.
9. Före testet, utföra tillvänjning (en dag innan uppgiften). Gör alla livsmedels hus fritt tillgänglig och låta mössen att utforska en labyrint fritt och hämta ett livsmedel pellets belöning (10 min / djur).
10. Stäng av datorn och kameran och starta video-system för spårning programvara.
11. Starta inspelningen.
12. Placera djuret på den definierade startpunkten på den runda plattan (Figur 5A, S: startposition) och låta mössen att söka efter målet mat hus i 10 min.
13. Stop video-tracking.
14. VIKTIGT! Rengör den runda plattan och maten husen efter varje prövning med snabb desinfektionsmedel.
15. Upprepa testet dagligen under sju på varandra följande dagar (för varje djur).
16. Analysera resultaten (latens, distans och fel) med hjälp av lämpliga statistikprogram. Definiera fel som närmar sig fel mat hus och / eller kontakt med den rätta lådan utan att ange och hämta mat pellets belöning. För grupperade analys använder tvåvägs ANOVA med Bonferroni post hoc test.
17. (TILLVAL) Offra mössen och analysera hippocampi som beskrivs nedan.

3. BrdU-märkning

1. Injicera intraperitonealt 50 mg / kg ip BrdU en gång dagligen i 3 dagar (analys av differentiering och integration) eller 200 mg / kg ip för en enda injektion (analys av proliferation).
2. Offrar djuren, dissekera hippocampus och förbereda 40 ^ m sektioner, såsom beskrivs nedan.
3. Denaturate densektioner med 2 M HCl under 10 min och inkubera i 0,1 M boratbuffert under 10 min.
4. Märk en en-i-tolv serier av 40 | im sektioner (240 | im från varandra) från varje djur immunhistokemiskt, såsom beskrivs nedan med användning av antikroppar riktade mot BrdU.
5. Kvantifiera de märkta cellerna genom konfokalmikroskopi analys hela rostrocaudal omfattningen av granulatcellskiktet och subgranular zonen. Multiplicera de resulterande siffrorna med 12 för att få det uppskattade totala antalet BrdU-märkta celler per hippocampus och dividera med två för att få det totala antalet märkta celler per GD.

4. Borttagning av hjärnorna och Beredning av Kryosnitt från Nonperfused Djur

1. Observera lokalt godkända förfaranden för euthanizing djur. Möss kan avlivas direkt genom cervikal dislokation.
2. (Tillval) Djur kan bedövas före euthanization enligt lokala och internationella riktlinjer, t.ex. genom intraperitoneal injeInsatser av 0,8 ml Avertin för en 33 g mus (nybakade genom att blanda 150 ml stamlösning gjord av 2,2 mg 2,2,2-tribromoethanol i 1 ml isoamyl etanol med 1,85 ml saltlösning eller fysiologisk buffert).
3. Sterilisera huvudet med Betadine (10% povidon-jod)-indränkt gasbinda och kompress därefter med en kompress indränkt i 70% etanol.
4. Halshugg djuret med användning av lämpliga kirurgiska saxar och dra huden åt sidan.
5. (Tillval) fixators kan tillämpas för att undvika att vika tillbaka för den efterblivna hud.
6. Gör en mittlinjen snitt i skallen och dra försiktigt skallen fragmenten åt sidan.
7. Ta försiktigt bort hela hjärnan med hjälp av ett lämpligt kirurgiskt instrument (t.ex. Moria Spoon).
8. Förkyla 25 ml av 2-metylbutan i en 50 ml bägare (t.ex. Schott Duran) till -30 till -40 ° C på torris.
   Obs: För fritt flytande färgning av "tjocka" sektioner som är idealiska för konfokala laserskanning mikroskopi, ta bort hjärnan, tvätta 3gånger i buffert och förvaras vid 4 ° C i fosfatbuffrad 30% sackaros-lösning i 50 ml rör tills hjärnan har sjunkit ned till botten (typiskt över natten).
9. Placera försiktigt hjärna på en bit Nescofilm (Parafilm) och täck med riklig mängd TissueTek oktober förening, frysa på Nescofilm i 2-metylbutan, förvara vid -80 ° C fram till användning.
   Anmärkning: För långtidslagring vid -20 ° C butik i 9% sackaros, 7 mM _MgCl2, 50 mM fosfatbuffert, 44% glycerol.
10. Skär hjärnan i 10-12 ìm tjocka sektioner på lämplig cryomicrotome.
    Obs: För tjock, fritt flytande sektioner, frysa hjärna på cryotome stadium av lämplig cryotome (t.ex. Reichert Jung, Frigomobil.) Och skär 40 ìm horisontella sektioner vid -20 ° till - 25 ° C. Samla delar från kniven med fin pensel och samla i buffert eller hålla i förvaringslösning (steg 4,9) vid -20 ° C för långtidslagring.
11. Försiktigt montera två skivor på enskilda objektglas. Den osse av Superfrost Ultraplus glider rekommenderas att maximera vidhäftningen av avsnitten.
12. Torka glasen för 5 minuter i rumstemperatur. Objektglasen kan förvaras vid -80 ° C fram till användning.

5. Beredning av avsnitten från perfusion Djur

1. Söva djuren som beskrivits ovan (steg 4,2).
2. Noggrant BEGJUTA djuret transkardiellt med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) innehållande heparin (0,025 g per 100 ml PBS) och prokain (0,5 g/100 ml PBS) under 2-4 min, följt av 4% paraformaldehyd i PBS under 10 till 15 min . Perfusion är optimalt utförd genom perfusion via den vänstra ventrikeln och öppning av det högra förmaket med hjälp av ett hydrostatiskt tryck av ca 1,2 till 1,4 m eller med användning av en peristaltisk pump inställd på cirka 15 ml / min. Optimala perfusion ger en blek vit hjärna med inga röda blodkärl blir synlig.
3. Dissekera och efter fixa hjärnorna i 4% paraformaldehyd vid 4 ° C under 24 timmar.
4. Cryoskydda hjärnorna i 30% sackaros i PBS vid 4 ° C under åtminstone 24 timmar.
5. Freeze hjärnorna på cryotome skede.
6. Förbered 40 ìm horisontella sektioner från hela framhjärnorna med lämpligt cryotome.
7. Objektglasen kan förvaras i kryoskyddande lösning (0,1 M fosfatbuffert, 50% glycerol, 0,14% _MgCl2, 8,6% sackaros) vid -20 ° C fram till användning.

6. Immunohistokemi av Brain Delar av Nonperfused Djur

1. Efter fixera kryosnitt, framställda såsom beskrivits ovan, med användning av -20 ° C kall metanol under 10 min.
2. Block med 5% normalt serum innehållande 0,3% Triton-X (från de arter som användes för att lyfta den sekundära antikroppen) över natten vid 4 ° C.
3. Skölj 3x med 1x PBS och inkubera med primära antikroppar över natten vid 4 ° C.
4. Skölj 3x med 1 x PBS och inkubera med sekundära antikroppar vid rumstemperatur under en timme.
5. Skölj 3x med 1x PBS
6. Counterstain sektionen för DNA med hjälp Sytox grön, eller DAPI (eller ett alternativt DNA-färgämne).
7. Skölj 3x med 1x PBS
8. Bädda in sektionerna i ett vatten inbäddningsmedium.
9. Låt inbäddningsmediet polymerisera under åtminstone 48 timmar.

7. Immunohistokemi av Brain Delar av perfusion Djur

1. Block som beskrivs i steg 6,2 och sedan inkubera sektionerna fasta hjärnan i primär antikropp lösning utspädd i PBS innehållande 0,3% Triton-X (fritt flytande) över natten vid 4 ° C.
2. Skölj tre gånger med 1 x PBS och inkubera i sekundär antikropplösning utspädd i PBS innehållande 0,3% Triton-X (fritt flytande) vid rumstemperatur under 3 timmar.
3. Skölj 3x med 1x PBS
4. Motfärga sektionen för DNA med Sytox grön eller DAPI (eller ett alternativt DNA-färgämne).
5. Skölj tre gånger med 1x PBS
6. Bädda in sektionerna i ett vatten inbäddningsmedium.
7. Låt inbäddningsmediet polymerisera under ent minst 48 timmar.

8. Utredning av Mossy Fiber Projektioner

1. Offra djuren, förbereda 40 um koronala sektioner som beskrivs ovan och ge fläckar hippocampus avsnitt med hjälp av antikroppar för neurofilament M.
2. Skanna sektionerna vid lämplig våglängd med hjälp av en konfokala laserskanning mikroskop för att visualisera mossiga fibrer och kärnor. Starta scanning vid låg förstoring.
3. Använd de låga förstoringsbilder för orientering och rikta hippocampus med mossiga fiber projektioner.
4. Skanna sektionerna (z-sektione) med hög upplösning och hög förstoring.
5. Analysera morfologiska utseende och anslutning av de mossiga fibrer visualiseras genom färgning för NF-M.
6. (TILLVAL) Analysera storleken och volymen av hippocampus blad. Använda DNA-signal för mätningarna.

9. Fluor-Jade C Assay (nervcellsdöd)

1. Offra djuren, dissekera hippocAmpus och förbereda 12 um sektioner såsom beskrivits ovan.
2. Låt sektionerna torka under 30 min vid rumstemperatur.
3. Fäst delarna i 4% PFA i 40 minuter vid rumstemperatur.
4. Tvätta snabbt avsnitten 3x med DDH ₂ O.
5. Inkubera sektioner med 0,06% kaliumpermanganat (KMnO ₄₎ under 10 min under kontinuerlig, försiktig skakning.
6. Tvätta avsnitten 3x med DDH ₂ O.
7. Inkubera avsnitt med 0,002% fluor-Jade C lösning under 20 minuter vid rumstemperatur.
8. (VALFRITT) för samtidig nukleära färgningar, 0,002% Fluoro-Jade C lösning kan kompletteras med 10 ug / ml DAPI.
9. Tvätta snabbt avsnitten 3x med DDH ₂ O.
10. Låt sektionerna torka under 30 min vid rumstemperatur.
11. Inkubera sektioner med xylen (1 min)
12. Montera sektionerna med hjälp av en Xylen baserat monteringsmedium (DPX).

Representative Results

Korsning av IkB / - och tTA transgen mus linjer leder till villkorlig hämning av NF-kB aktivitet i hippocampus.

För att undersöka uttrycket av iKBa-AA1-transgen i dubbeltransgena möss (figur 1 A), var hjärnor isolerades, cryosectioned och färgades med användning av en antikropp mot GFP (grönt fluorescerande protein). Confocal laserskanning mikroskopi visade hög expression av transgenen i CA1 och CA3 regioner, och i GD (Figur 1B).

Den iKBa-AA1-transgen uttrycks i typ-2b föregångare, och är verksamt i mellan omogna stater och i mogna granulceller.
För att bestämma den tidigaste celltyp som uttrycker CAMKIIα drivna iKBa-AA1 i hippocampus neurogen regionen, var kryosnitt av hippocampi från IkB / tTA djur färgas för doublecortin(DCX) och transgenen (GFP). Confocal analys visade GFP-signaler i unga DCX-positive granulat celler, vilket tyder på induktion av uttryck av transgenen genom CAMKIIα-aktivitet (fig 2, pilar).

Neuronal NF-kB inhibition via IicBa-AA1 minskar mossiga fiber projektioner, samt tjockleken och volymen av GD.

Koronala sektioner av hippocampus hos IkB / tTA och IkB / - möss färgades för neurofilament M (NF-M) för att visualisera mossiga fiber projektioner, och avslöjar komplexa och fascikulära organisation (Figur 3). I IkB ​​/ tTA möss, de mossiga fiber prognoserna kraftigt nedsatt. Dessutom ledde NF-KB-hämning till en signifikant reducerad suprapyramidal bladtjocklek och en mindre GD volym (figur 3B).

Neuronal hämning av NF-kB i iKB / tTA-möss leder till förhöjd neuronal degenbete, ökad neurogenes, och en störd migration av DCX-uttryckande stamceller.

För att studera de potentiella orsakerna till den dramatiska strukturella brister, färska, var ofixerade hippocampus skivor från IkB / tTA möss färgas med fluor-Jade C, vilket gör den specifik detektion av neuronal celldöd (Figur 4A). Här var ett dramatiskt ökat antal degenererande neuriter observerats i dubbeltransgena djur, jämfört med enstaka transgena kontroller. Dessutom var en signifikant ökning av kluvna kaspas-3-positiva apoptotiska celler upptäcktes i IkB / tTA möss. Däremot immunhistokemisk färgning mot DCX avslöjade signifikant ökade mängder av DCX + celler i hjärnorna av iKB / tTA-möss. Dessutom var DCX + celler i iKB / tTA-hippocampi inte anordnade uteslutande i den subgranular zon, men hittades också i de djupare regionerna av DG (figur 4B), medan de DCX +-progenitorer in kontrolldjuren var lokaliserade nästan uteslutande inom den subgranular zonen. För att testa om den ökade mängden DCX-uttryckande celler är ett resultat av mognad av tidigare stamfäder eller direkt på grund av proliferation av DCX +-celler, var BrdU injiceras i hippocampi av iKB / tTA-möss och kontrollmöss, vilka därefter cryosectioned och färgades med DCX och BrdU (Figur 4). För analys av spridning, var BrdU injiceras en gång (se figur 4B, ordning), följt av analys efter 24 timmar. För analys av differentiering, var tre injektioner utförs dagligen, följt av analys efter sju dagar. Efter en enda BrdU-injektion, var inga signifikanta skillnader i det totala antalet BrdU-positiva celler mellan IκB/tTA- och kontrolldjur observeras, medan de tre serie injektioner-strategi visade en klart ökad mängd BrdU / DCX + celler i GD av IkB / tTA möss. Detta tyder på att störd differentiering eller integration av DCX-expresskroppar kan ha orsakat den ökade antalet DCX +-celler, och antyder att typ-3-celler var inblandade.

Neuronal hämning av NF-kB resultat i svåra inlärningsdefekter, vilket framgår av den Spatial Pattern Separation-Barnes Maze testet. För att specifikt testa beteende dubbelt transgena möss i en GD-beroende uppgiften använde vi SPS-BM, där djuren måste skilja mellan platser med subtila skillnader (Figur 5). I detta beteendetest iKB / - utforskontrolldjur maten husen i serie på den första dagen för experimentet (Figur 5). Efter sju dagars utbildning, djuren kunde hitta den öppna livsmedels huset direkt. Däremot de IkB / tTA djur fortsatte att utforska mat husen i serie, även efter träningen (Figur 5B). Observationen av betydande ökningar av de avstånd som omfattas, och högre latenser och erROR priser i IkB / tTA djur, jämfört med iKB / - kontrolldjur, föreslår att dessa djur hade allvarliga defekter lärande (figur 5C).

Figur 1. Generation av en villkorlig framhjärnan-specifik hämning av NF-kB aktivitet. A. Schematisk bild av de transgena modeller som används för att studera rollen av NF-kB i vuxen hippocampus neurogenes. Kalcium-kalmodulin-beroende kinas Ila (CAMKIIα)-promotor-drivet tetracyklin transaktivator (tTA)-möss användes för att reglera expression av en negativ transdominant mutant IκBa (IκBa-AA1 super-repressor i iKB möss) kombineras med ett grönt fluorescerande protein spårämne (GFP). I IkB ​​/ tTA-möss, är NF-kB förvaras i cytoplasman i sin inaktiva state av icke nedbrytbara IκBa-AA1, som kan upptäckas via GFP-fluorescens. Hämningen kan vändas med doxycyklin, vilket hämmar tTA. B. representant transgen uttryck i olika hippocampus regioner i IkB / tTA möss (CA1, CA3 och DG). Kryosnitt framställdes från isolerade hjärnorna av iKB / - och iKB / tTA-möss och fixerades och färgades med användning av en antikropp mot GFP. Observera att transgenen uttrycks kraftigt inom generaldirektoratet. De: dendriter, DG: gyrus dentatus, ML: molekylära skikt, SL: Stratum lucidum. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 2. Den IκBa-AA1 transgen uttrycks i DCX-positiva, typ-2b progenit orer och är aktiv i ytterligare mellantillstånd och i mogna granulceller. A. Cryosectioned hippocampi av iKB / tTA djur med doublecortin (DCX) färgning och GFP-uttryck visade expression av transgenen i unga DCX-positive granulat celler (pilar). GD: gyrus dentatus, ML: molekylära lagret B. Schematisk bild av transgen uttryck i olika utvecklingsstadier under granulat cellutveckling.. IκBa-AA1-transgen uttryck detekterades i DCX-positiva, typ-2b progenitorceller, alla mellanliggande omogna stater och i mogna granulceller. Däremot gjorde tidiga typ-1 och typ-2a stamceller (saknar DCX-uttryck) inte uttrycka transgenen, och därför inte påverkades av NF-kB inhibition. Modifierad efter Kempermann et al. ²⁰ Klicka här för att visa en större bild.

ays ">
Figur 3. NF-KB-hämning leder till osäkra mossfiberprognoser och att en reducerad GD tjocklek och volym i iKB / tTA-möss, jämfört med enkel transgen kontroll (iKB / -). A. Immunfärgning av cryosectioned hippocampi för neurofilament M (NF-M) för att visualisera mossiga fiber projektioner. Hos kontrollmöss (iKB / -), en komplex och fascikulära organisationen av mossfibrer anslut granulceller till sina målceller i CA3 är uppenbar, som försämrats efter neuronal hämning av NF-kB i iKB / tTA-möss. Vidare uttryck av super-repressor ledde till en kraftigt minskad suprapyramidal bladtjocklek (jämför arrow i vänstra och högra panelen) och en minskad GD volym. B. Kvantifiering och statistisk analys av strukturella defekter till följd av NF-kB-hämning. Oparat t-test, tvåsidigt. Uppgifterna kommer från OA-versionen av Imielski et al. ² Klicka här för att visa en större bild.

Figur 4. Inhibering av NF-kB i iKB / tTA-möss leder till ökad neuronal celldöd, förstärkt neurogenes, och en störd flyttande mönster av DCX-uttryckande celler. A. Neuron specifika Fluoro-Jade C-färgning och ökat antal kluvna caspase-3-positiva celler i hippocampus sektioner visar en högre grad av neuronal celldöd i iKB / tTA-möss än i iKB / - kontroller. Degenererande neuriter är markerade med pilar, och kärnor markeras med asterisk. Höger sida: kvantifiering av kluvna caspase-3-positiv celler i hippocampi föreslår starkt ökad apoptos i dubbeltransgena djur. B. Färgning av hippocampala kryosnitt för DCX avslöjar ett ökat antal DCX-uttryckande celler i de dubbla transgena djur. Observera att DCX + celler i IkB / tTA-hippocampi inte arrangeras enbart i subgranular zonen, men flyttade djupare in i GD än i IkB / -. Kontroll C. Vänster panel: För att testa påverkan av transgenen på spridning, var en enda BrdU-injektion som utförs, vilket resulterade i några signifikanta skillnader i antalet BrdU-positiva celler mellan IkB / tTA och reglage Höger panel:. Statistisk utvärdering visade en signifikant öka i DCX-uttryckande celler i IkB / tTA djur efter tre dagliga BrdU-injektioner. Analysen utfördes sju dagar efter den sista injektionen (test av differentiering och integration). En betydande ökning av BrdU / DCX + upptäcktes i generaldirektoratet för jagkB / tTA-möss (n = 3). Uppgifter delvis tagen från OA-versionen av Imielski et al. ² Klicka här för att visa en större bild.

Figur 5. Set-up och typiska resultat av rumsliga mönster separation-Barnes labyrint (SPS-BM). A. Vänster: Schematisk bild av försöksuppställningen. Sju identiska livsmedel hus (samma färg, storlek och form) placerades symmetriskt på definierade fläckar av en rund, hemmagjord plåt byggs från hård inert plast (diameter 120 cm), med en fri plats (startpunkt, S). Mångfärgade extra labyrint ledtrådar (EMC) är fästa framför en vit-färgad duk i positioner väl synlig för djuren, ca 100 cm från bordning av plattan. För att undvika orientering av lukt, är matpellets deponeras i varje hus, men bara en mat hus är tillgänglig (nedläggning av transparent folie). Höger: Videokamera fokuserade på plattan (avstånd till tallrik: 115 cm), och ett fotografi av set-up med de extra-labyrint ledtrådar B. Typiska experimentella resultat av en SPS-BM-test.. Den IkB / - kontroll djur utforskar de livsmedel husen i serie på den första dagen av testserien, och den öppna livsmedels huset hittas direkt efter sju dagars träning. Däremot IkB / tTA möss avslöjar sämre inlärning, vilket framgår av serie prospektering även efter träningsfasen C. Jämförelse av parametrar som mäts i SPS-BM i iKB / -. Och IkB / tTA djur. Dubbla transgena möss visar betydande minne underskott (n = 9) jämfört med kontroller (n = 8) med avseende på latens, avstånd täcks och felfrekvens. tvåvägs ANOVA utvärdering, felstaplar: SEM. Data i BC togs från OA-versionen av Imielski et al. ² Klicka här för att visa en större bild.

Discussion

Vuxen neurogenes, och möjligheten för dess manipulation via hämning av NF-kB i nervceller, och dess senare reaktive via doxycyklin, erbjuder ett fascinerande system för utredningar av nyfödda nervceller i den vuxna hjärnan, samt i neuronala de-och re-generering . Det fina med detta system är att NF-kB signalväg inhibition i nervceller som inte bara resulterar i förändringar i neuronal celldöd, stamfader proliferation och migration, och allvarliga strukturella och anatomiska förändringar, men även i uppenbara inlärningsdefekter. Viktigt kan fenotypen för de iKB / tTA djuren experimentellt vändas och räddades efter administrering av doxycyklin. Denna återgång av fenotypen omfattar strukturella aspekter, och kan också leda till signifikant förbättring av GD-beroende inlärning ^2.

För att säkerställa en tolkningsbara resultat för beteende-experiment, är det viktigt att endast handjur med en ålder difference på mindre än fyra dagar användas. Dessutom bör alla provserier genomföras av samma operatör. När det gäller tester rum, rekommenderar vi starkt att du utför testet i en akustiskt isolerad miljö för att undvika stress och förlust av uppmärksamhet till följd av externa ljudkällor. För att förhindra läggning baserad på lukt upptäckt istället för extra-labyrint ledtrådar, bör de stängda livsmedels husen inte vara tillgänglig för djuret, och normal luft och lukt cirkulation bör tillåtas. Dessutom bör den platta som användes för testet byggas luktneutrala och detergent beständigt material, och bör rengöras noggrant mellan experimenten. Ytterligare en potentiell källa till experimentell variation är rumsbelysning. Ljuskällan bör vara tillräckligt ljust för att tillåta bildtagning, erkännandet av de extra-labyrint ledtrådar, och att framkalla flygbeteende, men bör inte vara av en intensitet att blinda djuret. Dessutom föreslår vi att utföra proven för varje djur samtidigtpå dagen för att undvika dygnsrytm variationer.

Mus musculus har en ganska bra syn förmåga som i naturliga förhållanden, bland annat används för att upptäcka territoriella gränser på visuellt slående (visuella referenser som träd) (Latham et al., Appl. Animal Behav. Sci. 86 (3-4 ), 261-289, 2004). I ett klassiskt experiment Balkema et al. (J. Neurophysiol. 48 (4), 968-980, 1982) placerade +6, 0, och -7 diopter linser framför mus ögon och observerade inga signifikanta förändringar av receptiva fältstorlekar i retinal ganglion celler. På grund av denna enorma skärpedjup visuella stimuli (t.ex. extra-maze ledtrådar) kan placeras över ett stort område av avstånd framför möss och förbli i fokus. I vår strategi, avståndet till extra labyrint ledtrådar från utgångspunkten var 30 cm från kanten av plattan, vilket är i enlighet med litteraturen (t.ex. 140 cm Wong et al., Genes Brain Behav. 5 (5), 389-403, 2006)

Gnagare har en tendens att ligga nära väggarna i ett öppet fält. Detta beteende definieras som thigmotaxis (Barnett, SH, Råttan: en studie i beteende, Aldline publicering, Chicago, pp 31-32, 1963). En färsk studie från O `Leary et al. (Behav. Brain Res. 216 (2), 531-542, 2011) visade att de C57BL/6J-möss visade bättre lärande i en Barnes Maze jämfört med 12 andra stammar möss. 28% av mössen testade använt rumslig ökning, medan 64% använde serie thigmotactic strategi. Dessa uppgifter gäller för små labyrint med en diameter på 69 cm med en 15 cm vägg-omgivning. Men möss som testats på en stor labyrint utan väggar eller intramaze ledtrådar, som vår inställning (diameter på 120 nm) har tillförlitligt visat bevis för användning av huvudsakligen extra labyrint visuella referenser (se t ex Bach et al., Cell. 81 signaler, t.ex. orsakade av mikrostrukturskillnader, var plattan roteras efter varje experiment.

Den beteendemässiga test kan enkelt anpassas för att undersöka effekterna av andra transkriptionsfaktorer på vuxna hippocampus neurogenes, med hjälp av lämpliga musmodeller. Men det är främst utformat för att testa GD beroende lärande (rumslig mönster separation), och kan vara olämplig för utredning av neurogenes eller neuronal degeneration i andra delar av hjärnan. I detta avseende är användning av SPS-BM begränsas ytterligare av dess DG-specificitet (strikt beroende av en fungerande krets mellan EG II och GD och CA3 och CA1 och EG-VI), och bör därför inte användas för att undersöka uppgifter som innebär den monosynaptic EG III - CA1 - EG-V - krets.

Framtida tillämpningar av de metoder som beskrivs häri kan innefatta att undersöka effekterna av stamcellstransplantationer, läketiska behandlingar vuxna hippocampus neurogenes, och vävnad homeostas i hippocampus.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Moria MC17 Perforated Spoon	FST	10370-18	removal of the brains
Dissecting microscope	Carl Zeiss	Stemi SV8	removal of the brains
Surgical scissors	FST	14084-08	removal of the brains
Surgical scissors	FST	14381-43	removal of the brains
Dumont #5 forceps	FST	11254-20	removal of the brains
SuperFrost Slides	Carl Roth	1879	slides for immunohistochemistry
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	fixative
TissueTek OCT compound	Sakura Finetek	1004200018	embedding of the brains
Normal Goat Serum	Jackson Immunolabs	005-000-001	blocking in IHC
Normal Rabbit Serum	Jackson Immunolabs	011-000-001	blocking in IHC
Normal Donkey Serum	Jackson Immunolabs	017-000-001	blocking in IHC
anti-Neurofilament-M antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	2H3	IHC, Dilution 1:200
anti-Doublecortin antibody	sc-8066	Santa Cruz	IHC, Dilution 1:800
anti-GFP antibody	Abcam	ab290	IHC, Dilution 1:2,000
anti-BrdU antibody	OBT0030G	Accurate Chemicals	IHC, Dilution 1:2,000
Fluoro-Jade C	FJ-C	HistoChem	Determination of neuronal cell death
Betadine	Mundipharma	D08AG02	disinfectant
Cryomicrotome	Leica	CM1900	preparation of brain slices
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H3393	perfusion
Circular plate made from hard-plastic (diameter 120 cm)	lab made	none	plate for SPS-BM, diameter 120 cm
Buraton rapid disinfectant	Schülke Mayr	113 911	disinfectant
Video-tracking system TSE VideoMot 2 with Software Package VideoMot2	TSE Systems	302050-SW-KIT	tracking and analysis of SPS-BM
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787	permeabilization/IHC
Cryotome	Reichert Jung/Leica	Frigomobil 1206	preparation of 40 µm brain slices
Mowiol 4-88	Carl Roth	Art.-Nr. 0713	embedding of the slides
SYTOX green	Invitrogen	S7020	Nuclear staining
Food pellets (Kellog`s Froot Loops)	Kellog`s		SPS-BM
Prism, Version 3.0	Graph Pad Software, San Diego, USA		Statistical evaluation of SPS-BM
Zen 2008 or Zen 2011 Software	Carl Zeiss		Software (Confocal microscope)
D.P.X	Sigma-Aldrich	317616	mounting medium for Fluoro-Jade C staining