Os métodos para a modulação e Análise de NF-kB-dependente Adulto Neurogenesis

Summary

Os métodos para a manipulação e análise de NF-kB-dependente neurogenesis adulto hipocampo são descritos. Um protocolo detalhado é apresentado para o teste de comportamento dependente do giro dentado (denominado o padrão de separação espacial-Barnes labirinto) para a investigação dos resultados cognitivos em ratos. Esta técnica também deve ajudar a permitir investigações em outras configurações experimentais.

Abstract

O hipocampo desempenha um papel fundamental na formação e consolidação de memórias episódicas, e na orientação espacial. Historicamente, o hipocampo adulto foi visto como uma região anatómica muito estático do cérebro de mamíferos. No entanto, resultados recentes demonstraram que o giro denteado do hipocampo é uma área de grande plasticidade em adultos, que envolva não apenas modificações de circuitos neuronais existentes, mas também a neurogénese adulto. Esta plasticidade é regulada por redes complexas de transcrição, em que o factor de transcrição NF-kB desempenha um papel proeminente. Para estudar e manipular neurogenesis adulto, um modelo de ratinho transgénico para-específica do cérebro anterior inibição neuronal da actividade de NF-kB pode ser usado.

Neste estudo, são descritos métodos para a análise da neurogénese NF-kB-dependentes, incluindo os seus aspectos estruturais, apoptose neuronal e a proliferação de células progenitoras, e significância cognitiva, which foi especificamente avaliada através de um giro denteado (DG) dependente teste comportamental, o padrão de separação espacial-Barnes labirinto (SPS-BM). O protocolo SPS-BM poderia ser simplesmente adaptados para uso com outros modelos animais transgênicos destinados a avaliar a influência de genes específicos em neurogênese adulta. Além disso, o SPS-BM poderia ser usado em outras configurações experimentais com vista a investigar e manipular aprendizagem DG-dependentes, por exemplo, por meio de agentes farmacológicos.

Introduction

Ontologicamente, o hipocampo é um dos mais antigos estruturas anatómicas cerebrais conhecidos. Ele é responsável por diversas tarefas complexas, tais como funções fundamentais na regulação da memória de longo prazo, a orientação espacial ea formação e consolidação da respectiva memória. Anatomicamente, o hipocampo é constituído por camadas de células piramidais (estrato piramidal), incluindo o cornu Ammonis (CA1, CA2, CA3, e CA4) e regiões do giro dentado (gyrus dentatus), que contém as células granulares e alguns progenitores neuronais dentro da sua zona subgranular . As células granulares projectar em direcção à região CA3 através das ditas fibras musgosas (axónios de células granulares).

Até o final do século passado, cérebro de mamíferos adultos se acreditava ser um órgão estático falta plasticidade celular e neurogênese. No entanto, durante as duas últimas décadas, uma quantidade crescente de evidências demonstra claramente a neurogênese adulta ocorrendo em pelo menosduas regiões do cérebro, da zona subventricular (SVZ) e a zona subgranular do hipocampo.

Nossos estudos anteriores, e das de outros grupos, têm mostrado que o fator de transcrição NF-kB é um dos reguladores moleculares cruciais da neurogênese adulta, e que os seus resultados de-regulação em defeitos estruturais do hipocampo graves e deficiências cognitivas ^1-6. NF-B é o nome genérico de um factor de transcrição indutível composto por diferentes combinações diméricos de cinco subunidades de ligação ao ADN: p50, p52, c-Rel, RelB, e p65 (RelA), o último dos quais tem três domínios de transactivação. Dentro do cérebro, a forma mais abundante encontrada no citoplasma é um heterodímero de p50 e p65, que é mantido sob uma forma inactiva, por inibidor de kappa B (IkB)-proteínas.

Para estudar e manipular diretamente neurogênese NF-kB-driven, usamos modelos de camundongos transgênicos para permitir simples inibição de toda a subun NF-kBsua, especificamente no cérebro anterior ⁷ (ver Figura 1). Para este fim, nós Cruzado as seguintes linhas camundongo transgênico, IkB / - e -/tTA. O transgênico IkB / - linha foi gerada usando um mutante negativo trans-dominante do NF-kB-inibidor IκBa (super-repressor IκBa-AA1) ^8. Em contraste com o do tipo selvagem IκBα, IκBα-AA1 tem dois resíduos de serina mutados para alaninas (V32 e V36), os quais impedem a fosforilação e subsequente degradação proteosomal do inibidor. Para prosencéfalo expressão específica do neurônio do IκBa-AA1-transgene, IkB / - ratos foram cruzadas com ratos abrigar uma quinase cálcio-calmodulina-dependente IIα (CAMKIIα)-promotor que pode ser conduzido por tetraciclina trans-ativador (ATT) ^9.

p65 camundongos knock-out ter um fenótipo letal embrionário, devido à maciça apoptose hepática ^10, então a abordagem mostrada aqui fornece um método elegantepara investigar o papel do NF-kB em pós-natal e neurogênese adulta.

O teste comportamental clássica para estudar a aprendizagem espacial ea memória foi descrita em 1980 por Richard Morris, um teste conhecido como a água-labirinto Morris (MWM) ^11. Neste campo aberto água-labirinto, os animais aprendem a escapar da água opaca sobre uma plataforma escondida com base na orientação e extra-labirinto pistas. Uma variante de seco da MWM é o chamado labirinto Barnes (BM) ^12. Este teste utiliza uma placa circular com 20 orifícios circulares dispostas na fronteira de uma placa com um furo definida como uma caixa de fuga, e visuais pistas extra-labirinto de orientação. Ambos os paradigmas experimentais dependem do comportamento de fuga induzido por um roedor `s aversão à água, ou espaços abertos, brilhantemente iluminados. Ambos os testes permitem que uma investigação de orientação espacial, eo desempenho da memória relacionada. Embora o hipocampo desempenha um papel em geral e fundamental na formação da memória espacial, o hipocampo rEGIÕES envolvidos diferem dependendo do teste aplicado. A memória testada em BM surge da atividade neuronal entre o córtex enthorinal (CE) e os neurônios piramidais localizados no CA1-região do hipocampo, sem uma contribuição da DG ^13-16. Em particular, o clássico BM depende principalmente da sua navegação através da via temporo-ammonic monossináptico de CE III CA1 para CE V. Mais importante, o DG é crucialmente envolvido no chamado reconhecimento do padrão espacial ^17, o que implica não só o tratamento de informação visual e espacial, mas também a transformação das representações ou memórias semelhantes em diferentes representações, não sobrepostas. Esta tarefa exige um circuito tri-sináptico funcional do CE II DG para CA3 para CA1 e CE VI, que não podem ser testados na BM ^15.

Para enfrentar esses desafios, nós planejamos SPS-BM como um teste comportamental para testar especificamente o desempenho cognitivo denteado dependente de giro em control animais, e no modelo de super-repressora de IkB / tTA a inibição do NF-kB. Importante, em contraste com a MWM ou o BM, o SPS-BM pode revelar déficits comportamentais sutis resultantes da diminuição da neurogênese. Desde espacial-padrão de separação é estritamente dependentes de um circuito funcional entre EC II e DG e CA3 e CA1 e CE VI, este teste é altamente sensível a mudanças potenciais na neurogênese, modificações da via fibra de musgo ou alterações de homeostase do tecido dentro do DG.

Tecnicamente, a configuração do nosso teste baseia-se no estudo de Clelland et al., Em que o padrão de separação espacial foi testado utilizando uma madeira de 8 braços do labirinto radial do braço (RAM) ^19. Em nossa modificado set-up, os oito braços foram substituídos por sete casas amarelas idênticas alimentos. Em resumo, os métodos mostrados aqui, incluindo a análise de células que expressam doublecortin (DCX +) dentro do hipocampo, as projeções de fibras musgosas, neuronal de células deatletas e, particularmente, o SPS-BM apresentado aqui, pode ser aplicado a investigações de outros modelos de mouse incorporando transgenes que têm um impacto sobre a neurogênese adulta. Outras aplicações podem incluir o estudo de agentes farmacológicos e medir o seu impacto sobre a separação padrão DG e espacial.

Protocol

Declaração de Ética

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com os regulamentos do animal e uso de cuidados comitê governamental, LANUV do estado Renânia do Norte-Vestfália, (Düsseldorf, Alemanha). Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo LANUV, Düsseldorf sob o número de licença 8.87-51.04.20.09.317 (LANUV, NRW). Foram feitos todos os esforços para minimizar o sofrimento e o número de animais necessários para o estudo.

1. Animal Care e Habitação

1. Todos os animais utilizados nos protocolos aqui descritos devem ser mantidos em condições livres de patógenos específicos, conforme definido pela Associação Federação Europeia Laboratory Animal Science (FELASA).
2. Os ratos devem ser mantidos em gaiolas padrão numa sala de temperatura e humidade controladas (22 ° C) sob condições diurnas (12 horas de luz / escuridão) com ar filtrado HEPA.
3. Comida padronizada e água devem ser fornecidas ad libitum. </ Li>
4. Se IkB / tTA e IkB / - murganhos de controlo são utilizados, genotipagem baseada em PCR deve ser efectuada para cada animal, tal como descrito em ^{7, 18.}
5. Animais do sexo masculino com uma diferença de idade de menos de quatro dias devem ser usadas para reduzir a variabilidade individual.
6. (Opcional): Para as experiências de reactivação de NF-kB, a doxiciclina pode ser administrado na água de beber (2 mg / ml com 2,5% de sacarose) durante pelo menos 14 dias.

2. Padrão espacial Separação-Barnes Maze (SPS-BM)

1. Todos os testes de comportamento deve ser realizada de acordo com as diretrizes internacionais e locais.
2. IMPORTANTE! Use apenas camundongos machos com idade de seis meses ou mais. A diferença de idade entre os animais de uma série de testes deve ser inferior a quatro dias. O teste deve ser realizado pelo mesmo operador para cada uma das séries. Os ratos devem receber uma dieta padrão antes do teste para aumentar ainda mais a motivação parcialmente conduzido por quantorecompensa alimentar weet.
3. Defina-se uma placa circular branco feito de plástico duro (120 centímetros de diâmetro, ver Figura 5A) em um e humidade ambiente com temperatura controlada (22 ° C), iluminado com pelo menos 4 x 80 W e 3 x 215 lâmpadas fluorescentes W néon . IMPORTANTE! Garantir a iluminação correta é usado, como a motivação dos ratos para entrar nas casas dos alimentos é parcialmente impulsionado por sua aversão a brilhantes, locais expostos.
4. Configure o sistema de vídeo-monitoramento. A câmara deve ser colocado 115 centimetros acima do centro da placa (ver Figura 5A).
5. Anexar multicoloridas pistas extra-labirinto (CEM) em um pano de cor branca em posições facilmente visíveis para os animais, cerca de 100 cm da borda da placa (ver Figura 5A).
6. Limpe cuidadosamente a placa com um desinfectante rápido que pode remover qualquer odor do experimental set-up.
7. Coloque sete casas idênticas amarelas de alimentos (12 cm x 7 cm x 8 cm, ver Figura 5A Figura 5A).
8. Coloque doces recompensas da pelota de alimentos (um quarto de uma casa Froot Curva / comida Kellogs `s) dentro de todas as casas de comida em posições definidas (ver Figura 5A), com apenas uma casa comida definido ser de livre acesso ao animal (localização F, ver figura 5A ). Feche as casas de alimentos não-alvo com folha transparente.
9. Antes do ensaio, realizar habituação (um dia antes de iniciar o trabalho). Fazer todos os estabelecimentos de comida livremente acessível e permitir que os ratinhos a explorar livremente o labirinto e para recuperar uma recompensa alimentar pelete (10 min / animal).
10. Ligue o computador ea câmara e iniciar o software do sistema de vídeo-monitoramento.
11. Inicie a gravação.
12. Colocar o animal no ponto inicial definida na placa circular (Figura 5A, S: a posição de partida) e permitir que os ratinhos procurar a casa comida alvo durante 10 min.
13. Stop-tracking o vídeo.
14. IMPORTANTE! Limpe a placa circular e as casas de comida depois de cada ensaio com desinfectante rápido.
15. Repetir o teste diariamente durante sete dias consecutivos (por cada animal).
16. Analisar os resultados (latência, distância percorrida e erros) usando o software estatísticas apropriadas. Definir erros como se aproximar da casa comida errada e / ou contato com a caixa adequada, sem entrar e recuperar a recompensa pellet alimentos. Para a análise agrupada usar two-way ANOVA com teste post-hoc de Bonferroni.
17. (OPCIONAL) Sacrifício dos ratinhos e analisar o hipocampo, como descrito abaixo.

3. BrdU Labeling

1. Injectar por via intraperitoneal de 50 mg / kg ip de BrdU uma vez por dia durante 3 dias (análise de diferenciação e integração) ou ip de 200 mg / kg para uma única injecção (análise de proliferação).
2. Sacrifício dos animais, dissecar o hipocampo e preparar 40 mM secções, conforme descrito abaixo.
3. Desnaturar asecções com 2 M de HCl durante 10 minutos e incubar em tampão de borato 0,1 M durante 10 min.
4. Rotular uma série de um em doze dos 40 mM secções (240 uM) para além de cada animal imuno-histoquímica, tal como descrito a seguir, utilizando anticorpos dirigidos contra a BrdU.
5. Quantificar as células marcadas por análise de microscopia confocal em toda a extensão do rostro-caudal da camada de células granulares e zona subgranular. Multiplica os números resultantes por 12 para obter o número total estimado de células marcadas com BrdU por hipocampo e dividir por dois, para obter o número total de células marcadas por DG.

4. Remoção dos cérebros e Preparação de Cortes congelados de Nonperfused Animais

1. Observe os procedimentos aprovados localmente para eutanásia de animais. Os ratinhos podem ser directamente submetidos à eutanásia por deslocamento cervical.
2. (Opcional) Os animais podem ser anestesiados antes de eutanásia de acordo com as diretrizes nacionais e internacionais, por exemplo, inje intraperitonealcção de 0,8 ml Avertin para um 33 g de rato (feito recentemente pela mistura de 150 ml de solução estoque feito de 2,2 mg de 2,2,2-tribromoetanol em 1 ml de etanol isoamyl com 1,85 ml de tampão de soro fisiológico ou).
3. Esterilizar a cabeça com Betadine (10% iodopovidona)-gaze embebida e cotonete posteriormente com gaze embebida em álcool 70%.
4. Decapitar o animal usando uma tesoura cirúrgica apropriados e puxar a pele de lado.
5. (Opcional) Fixadores pode ser aplicada para evitar a dobragem para trás da pele retardado.
6. Faça uma incisão na linha média no crânio e puxe cuidadosamente os fragmentos do crânio de lado.
7. Retire cuidadosamente todo o cérebro através de um instrumento cirúrgico apropriado (por exemplo, Moria Colher).
8. Precool 25 ml de 2-metilbutano numa proveta de 50 ml (por exemplo, Duran de Schott) a -30 a -40 ° C em gelo seco.
   Nota: Para a coloração de livre flutuação das seções "grossas", que são ideais para a microscopia confocal a laser, remova cérebro, lavar 3vezes, em tampão e armazenar a 4 ° C em tampão fosfato solução de sacarose a 30% em 50 ml tubo até cérebro afundado para baixo (tipicamente durante a noite).
9. Com cuidado, coloque cérebro em um pedaço de Nescofilm (Parafilm) e cubra com uma ampla quantidade de composto TissueTek outubro, congelar em Nescofilm em 2-metilbutano, armazenar a -80 ° C até o uso.
   Nota: Para o armazenamento de longo prazo a -20 ° C em armazenamento de 9% de sacarose, 7 mM de _MgCl2, 50 mM de tampão fosfato, 44% de glicerol.
10. Corte o cérebro em 10-12 mm de espessura sobre cryomicrotome apropriado.
    Nota: Para, seções flutuantes grossas, congelar cérebro em cryotome fase de cryotome apropriado (por exemplo Reichert Jung, Frigomobil.) E corte 40 mM seções horizontais a -20 ° e - 25 ° C. Colete seções de faca com pincel fino e recolher em tampão ou manter em solução de armazenamento (passo 4.9) a -20 ° C para armazenamento de longo prazo.
11. Monte cuidadosamente duas fatias em lâminas de microscópio simples. A nóse de lâminas Superfrost Ultraplus é altamente recomendado para maximizar a adesão das seções.
12. Secam-se as lâminas durante 5 min à temperatura ambiente. As lâminas podem ser armazenadas a -80 ° C até à sua utilização.

5. Preparação das Seções de perfusão Animais

1. Anestesiar os animais como descrito acima (passo 4.2).
2. Aspergir cuidadosamente o animal transcardialmente com tampão fosfato salino (PBS) contendo heparina (0,025 g/100 ml de PBS) e procaína (0,5 g/100 ml de PBS) durante 2-4 min, seguido por paraformaldeído a 4% em PBS durante 10-15 min . A perfusão é optimamente realizada irrigando através do ventrículo esquerdo e abertura do átrio direito com uma pressão hidrostática de cerca de 1,2-1,4 m ou utilizando uma bomba peristáltica definido para aproximadamente 15 ml / min. Resultados de perfusão ideal em um cérebro branco pálido, sem vasos sanguíneos vermelhos sendo visível.
3. Dissecar e pós-corrigir os cérebros em paraformaldeído a 4% a 4 ° C durante 24 hr.
4. Cryoproteger os cérebros em 30% de sacarose em PBS a 4 ° C durante pelo menos 24 horas.
5. Congelar os cérebros no palco cryotome.
6. Prepare 40 mM seções horizontais de forebrains inteiras usando uma cryotome apropriado.
7. As lâminas podem ser armazenadas em solução de crioprotector (tampão fosfato 0,1 M, 50% glicerol, 0,14% de MgCl _2, 8,6% de sacarose), a -20 ° C até à sua utilização.

6. Imunohistoquímica de seções do cérebro de Nonperfused Animais

1. Pós-corrigir os criocortes, preparadas como descrito acima, usando -20 ° C metanol frio durante 10 min.
2. Bloco com 5% de soro normal contendo 0,3% de Triton-X (a partir das espécies que foram utilizados para aumentar o anticorpo secundário) durante a noite a 4 ° C.
3. Lavar 3x com PBS 1x e incubar com anticorpos primários durante a noite a 4 ° C.
4. Lavar 3x com PBS 1x e incubar com anticorpos secundários, à temperatura ambiente durante uma hora.
5. Lavar 3x com PBS 1x
6. Counterstain seção de DNA usando SYTOX verde, ou DAPI (ou um corante DNA alternativa).
7. Lavar 3x com PBS 1x
8. Incorporar as seções em um meio aquoso a incorporação.
9. Deixe o meio incorporar polimerizar por pelo menos 48 horas.

7. Imunohistoquímica de seções do cérebro de animais perfundidos

1. Bloco tal como descrito no passo 6.2 e subsequentemente incuba-se as secções de cérebro fixadas em solução de anticorpo primário diluído em PBS contendo 0,3% de Triton-X (flutuante) durante a noite a 4 ° C.
2. Lavar três vezes com PBS 1x e incubar em solução de anticorpo secundário diluído em PBS contendo 0,3% de Triton-X (livre flutuante) à temperatura ambiente durante 3 hr.
3. Lavar 3x com PBS 1x
4. Contracorante seção de DNA usando SYTOX verde ou DAPI (ou um corante DNA alternativa).
5. Lavar três vezes com PBS 1x
6. Incorporar as seções em um meio aquoso a incorporação.
7. Deixe o meio de fixação para polimerizar umt menos de 48 horas.

8. Investigação de Projeções Mossy Fibra

1. Sacrifício dos animais, preparar 40 mM secções coronais como descritos acima e manchar a secção de hipocampo utilizando o anticorpo para neurofilamento M.
2. Digitalizar as seções no comprimento de onda apropriado, usando um microscópio de varredura a laser confocal para visualizar fibras musgosas e núcleos. Inicie a digitalização em baixa ampliação.
3. Utilize as imagens de baixa ampliação para orientação e atingir o hipocampo com as projeções de fibras musgosas.
4. Digitalize as seções (z-seccionamento) em alta resolução e alta ampliação.
5. Analisar o aspecto morfológico e conectividade das fibras musgosas visualizadas através de coloração para NF-M.
6. (OPCIONAL) Analisar o tamanho e volume de lâminas do hipocampo. Usar o sinal de ADN para as medições.

9. Fluoro-Jade C Assay (Neuronal morte celular)

1. Sacrificar os animais, dissecar o hippocAmpus, e preparar 12 mM secções como descritos acima.
2. Deixe as secções de secar durante 30 minutos à temperatura ambiente.
3. Corrigir as seções em PFA 4% por 40 min em temperatura ambiente.
4. Lava-se rapidamente as secções 3 vezes com ddH ₂ O.
5. Incubar as seções com 0,06% de permanganato de potássio (KMnO ₄₎ por 10 min sob contínua agitação suave.
6. Lavar as seções 3x com DDH ₂ O.
7. Incubar as secções com 0,002% Fluoro-Jade solução C, durante 20 minutos à temperatura ambiente.
8. (Opcional) para colorações nucleares simultâneas, uma solução de 0,002% Fluoro-Jade C pode ser suplementado com 10 ug / ml de DAPI.
9. Lava-se rapidamente as secções 3 vezes com ddH ₂ O.
10. Deixe as secções de secar durante 30 minutos à temperatura ambiente.
11. Incubar as seções com xileno (1 min)
12. Monte as seções usando um meio de montagem com base em xileno (DPX).

Representative Results

-Cruzamento das IkB / - linhas de camundongo transgênico e tTA leva à inibição condicional da atividade de NF-kB no hipocampo.

Para investigar a expressão de a-AA1-IκBα transgene no ratinho transgénico duplo (Figura 1A), os cérebros foram isolados, cryosectioned e coradas utilizando um anticorpo contra a GFP (proteína fluorescente verde). A microscopia de varrimento de laser confocal revelou elevada expressão do transgene nas regiões CA1 e CA3, e no GD (Figura 1B).

O IκBα-AA1-transgene é expresso em progenitores-2b tipo, e é ativa em estados imaturos intermediários e em células granulares maduros.
Para determinar o tipo de célula mais antiga expressando a CAMKIIα-driven IκBα-AA1 na região do hipocampo neurogênica, criosecções de hipocampos de animais IkB / ATT foram coradas para doublecortin(DCX) e o transgene (GFP). Análise confocal revelou-GFP em células de grânulos de sinais DCX-positivos jovens, indicando a indução da expressão do transgene por CAMKIIα-actividade (Figura 2, as setas).

Inibição neuronal do NF-kB via IκBα-AA1 reduz projecções de fibras musgosas, e a espessura e o volume da DG.

Secções coronais de hipocampo de IkB / tTA e IkB / - ratos foram coradas para neurofilamento M (NF-M) para visualizar as projecções de fibras musgosas, e revelam organização complexa e fascicular (Figura 3). Em camundongos IkB / ATT, as projeções de fibras musgosas foram severamente prejudicada. Além disso, a inibição do NF-kB levou a uma redução significativa da espessura da lâmina suprapyramidal e um volume menor GD (Figura 3B).

Inibição neuronal de NF-kB em ratinhos IkB / tTA leva à degeneração neuronal elevadação, o aumento da neurogênese, e uma migração perturbado de DCX-expressando progenitores.

Para estudar as razões potenciais para os defeitos estruturais dramáticos, frescos, fatias de hipocampo de ratos não corrigidos IkB / ATT foram corados com Fluoro-Jade C, que permite a detecção específica de morte celular neuronal (Figura 4A). Aqui, foram observados um aumentou dramaticamente o número de neurites degeneração em animais transgênicos dobro, em comparação com os controles transgênicos individuais. Além disso, foi detectado um aumento significativo de células apoptóticas caspase-3-positivo clivadas em ratinhos IkB / tTA. Por outro lado, coloração imuno-histoquímica contra DCX revelou significativamente aumento da quantidade de células DCX + nos cérebros de camundongos IkB / ATT. Além disso, as células de DCX + em IkB / tTA-hipocampos não foram dispostas exclusivamente na zona subgranular, mas também foram encontradas nas regiões mais profundas do GD (Figura 4B), enquanto que os progenitores de DCX +-in os animais do grupo controle foram localizados quase exclusivamente dentro da zona subgranular. Para testar se o aumento da quantidade de células DCX-expressam é um resultado da maturação de células progenitoras iniciais ou directamente, devido à proliferação de células de DCX +, BrdU foi injectado no hipocampo de ratos de IkB / tTA e de controlo, que foram então cryosectioned e coradas com DCX e BrdU (Figura 4). Para a análise de proliferação de BrdU foi injectado uma vez (ver Figura 4B, esquema), seguido de análise após 24 hr. Para a análise de diferenciação, três injecções foram feitas diariamente, seguido por análise após sete dias. Após uma única BrdU-injeção, não se observaram diferenças significativas no número total de células BrdU-positivas entre IκB/tTA- e animais de controle, enquanto que a série injeções abordagem três revelaram uma clara aumento da quantidade de células BrdU / DCX + no DG de camundongos IkB / ATT. Isto indica que a diferenciação ou a integração de DCX-ex perturbadocélulas prementes pode ter causado o aumento do número de células DCX +, e sugere que tipo-3 células foram envolvidos.

Inibição neuronal dos resultados de NF-kB em defeitos graves de aprendizagem, como demonstra o padrão espacial Separação-Barnes Labirinto teste. Para testar especificamente o comportamento dos camundongos transgênicos dupla em uma tarefa DG-dependente, foi utilizado o SPS-BM, em que os animais têm de diferenciar entre locais com diferenças subtis (Figura 5). Neste teste comportamental, os / IkB - animais de controlo exploraram os estabelecimentos de comida em série, no primeiro dia da experiência (Figura 5). Após sete dias de treinamento, os animais foram capazes de encontrar a casa de alimentos aberto diretamente. Em contraste, os animais IkB / tTA continuou a explorar os estabelecimentos de comida em série, mesmo após a formação (figura 5B). A observação de um aumento significativo nas distâncias percorridas, e latências mais altas e ertaxas ror nos animais IkB / ATT, em comparação com os / IkB - animais de controle, sugere que esses animais tinham defeitos graves de aprendizagem (Figura 5C).

Figura 1. Geração de uma inibição específica do cérebro anterior condicional de actividade de NF-kB. A. desenho esquemático dos modelos transgénicos utilizados para o estudo do papel do NF-kB em neurogênese adulta. O cálcio-dependentes de calmodulina cinase IIα (CAMKIIα) conduzido pelo promotor de tetraciclina transactivador (tTA) os ratos foram usados ​​para regular a expressão de um mutante dominante negativo de trans-IκBa (IκBa-AA1 super-repressora de IkB ratinhos) combinado com uma proteína fluorescente verde marcador (GFP). Em ratinhos IkB / tTA, o NF-kB é mantido no citoplasma, na sua estação inactivate por não degradável IκBa-AA1, que pode ser detectado através de GFP-fluorescência. A inibição pode ser revertida pela doxiciclina, que inibe a tTA. B. representativas expressão do transgene em diferentes regiões do hipocampo de ratos IkB / tTA (CA1, CA3 e DG). Criocortes foram preparadas a partir de cérebro isoladas de IkB / - murganhos e IkB / tTA, e foram fixadas e coradas utilizando um anticorpo contra GFP. Note que o transgene é altamente expresso no âmbito da DG. De: dendrites, DG: giro denteado, ML: camada molecular; SL: estrato lúcido. Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura 2. O transgene IκBa-AA1 é expressa em DCX-positivos, progenit-2b Tipo RUP e está presente em mais estados intermediários e em células granulares maduros. Hipocampos A. Cryosectioned de animais IkB / tTA com duplacortina (DCX), a coloração e a expressão da GFP revelam a expressão do transgene em células de grânulos de DCX-positivos jovens (setas). DG: giro denteado, ML: camada molecular desenho B. Esquema de expressão do transgene em diversos estágios de desenvolvimento durante o desenvolvimento de células granulares.. IκBa-AA1-expressão do transgene foi detectada nas DCX-positivos, progenitores-2b tipo, todos os estados intermédios imaturos e em células de grânulos maduros. Por outro lado, progenitores tipo 1 e tipo-2a primeiros (faltam DCX-expressão) não expressou o transgene, e, portanto, não foram afetadas pela inibição de NF-kB. Modificado após Kempermann et al. ²⁰ Clique aqui para ver imagem ampliada.

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Figura 3. Inibição de NF-kB leva a projeções de fibras musgosas deficiência e uma espessura DG reduzido eo volume em ratos IkB / ATT, em relação ao controle único transgênico (IkB / -). A. imunocoloração de hipocampos cryosectioned para neurofilament M (NF-M) para visualizar projeções de fibras musgosas. Em camundongos controle (IkB / -), uma organização complexa e fascicular das fibras musgosas que ligam células granulares para suas células-alvo em CA3 é evidente, que foi alterado após a inibição neuronal de NF-kB em ratos IkB / ATT. Além disso, a expressão de a super-repressor levou a uma redução significativa da espessura da lâmina suprapyramidal (comparar seta no painel esquerdo e direito) e um volume DG diminuída. B. Quantificação e análise estatística de defeitos estruturais resultantes da inibição de NF-kB. Teste t não pareado, bicaudal. Dados obtidos a partir da versão OA de Imielski et al. ² Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura 4. Inibição de NF-kB em ratinhos IkB / tTA leva a aumento da morte celular neuronal, reforçada neurogénese, e um padrão de migração de células perturbadas DCX-expressam. Coloração específica A. Neuron-Fluoro-Jade C e aumento do número de células de caspase-3 clivada positivo em secções de hipocampo, revela um maior grau de morte celular neuronal em ratos IkB / tTA do que nos controlos IkB / -. Neurites degenerando são marcados por flechas, e os núcleos são indicadas por asteriscos. Local certo: quantificação da caspase-3 clivada-pocélulas veis no hipocampos altamente sugere um aumento da apoptose em animais transgénicos duplos. B. Coloração de criocortes hipocampo para DCX revela um aumento do número de células expressando DCX-nos animais transgénicos duplos. Note-se que as células DCX + em IkB / ATT-hipocampos não são organizadas exclusivamente na zona subgranular, mas migraram mais fundo na DG do que no IkB / -. Controle C. Painel esquerdo: Para testar a influência do transgene em proliferação, uma única injecção de BrdU foi realizada, o que resultou em nenhuma diferença significativa no número de células BrdU-positivas entre IkB / tTA e controlos Painel direito:. Avaliação estatística revelou uma significativa aumentar em DCX-expressando células em animais IkB / tTA após três BrdU-injecções diárias. A análise foi efectuada sete dias após a última injecção (teste de diferenciação e integração). Foi detectado um aumento significativo de BrdU / DCX + no DG de Iratinhos kB / tTA (n = 3). Dados parcialmente a partir da versão OA de Imielski et al. ² Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura 5. Set-up e os resultados típicos de separação espacial padrão-Barnes labirinto (SPS-BM). A. Esquerda: Desenho esquemático do conjunto experimental. Sete casas de alimentos idênticos (mesma cor, tamanho e forma) foram colocados simetricamente em pontos definidos de um prato redondo, feito em casa construída a partir de plástico inerte rígido (diâmetro de 120 cm), com um ponto livre (ponto de partida, S). Multicoloridos pistas extra-labirinto (EMC) encontram-se em frente de um pano de cor branca em posições facilmente visível para os animais, cerca de 100 cm da bfim de a placa. Para evitar a orientação pelo odor, pelotas do alimento são depositados em todas as casas, mas apenas uma casa comida é acessível (fechamento feitos de folha transparente). Direita: câmera de vídeo com foco na placa (distância ao prato: 115 cm), e uma foto do set-up, incluindo as pistas extra-labirinto B. resultado experimental típica de um teste SPS-BM.. O IkB / - animais controle explora as casas de comida em série no primeiro dia da série de testes, ea casa comida aberto é encontrado imediatamente após sete dias de treinamento. Em contraste, os ratos IkB / ATT revelar aprendizagem mais pobres, como demonstrado pela exploração de série, mesmo após a fase de treinamento C. Comparação dos parâmetros medidos no SPS-BM em IkB / -. E IkB / ATT animais. Ratinhos transgénicos duplos mostram défices de memória significativa (n = 9), em comparação com os controlos (n = 8) com respeito à latência, distância percorrida e a taxa de erro. avaliação ANOVA de duas vias; barras de erro: SEM. Dados em B eC foram retirados da versão OA de Imielski et al. ² Clique aqui para ver imagem ampliada.

Discussion

Neurogênese adulta, ea possibilidade de sua manipulação através da inibição do NF-kB nos neurônios, e sua reativação posterior através doxiciclina, oferece um sistema fascinante para as investigações sobre os neurônios recém-nascidos no cérebro adulto, bem como em neuronal de-e re-geração . A beleza desse sistema é que a inibição de NF-kB via de sinalização nos neurônios não só resulta em mudanças na morte neuronal, proliferação e migração de células progenitoras, e as mudanças estruturais e anatômicas graves, mas também em defeitos de aprendizagem óbvias. Mais importante, o fenótipo dos animais IkB / tTA pode ser experimentalmente invertida e resgatados após administração de doxiciclina. Esta reversão do fenótipo inclui aspectos estruturais, e também podem conduzir a uma melhoria significativa na aprendizagem ^DG-2 dependente.

Para assegurar um resultado interpretável para as experiências de comportamento, é fundamental que apenas os animais do sexo masculino com uma idade diference de menos de quatro dias ser utilizado. Além disso, todas as séries de ensaio devem ser realizadas pelo mesmo operador. No que diz respeito à sala de teste, recomendamos realizar o teste em um ambiente acusticamente isolado para evitar o estresse e perda de atenção resultante de fontes de ruído externo. Para evitar que a orientação com base na detecção de odores em vez de pistas extra-labirinto, as casas fechadas alimentos não devem ser acessíveis para o animal, e circulação de ar e odor normal deve ser permitida. Além disso, a placa usada para o teste deveria ser construído de material de odor neutro e detergente-resistentes, e deve ser cuidadosamente limpo entre experiências. Uma outra fonte potencial de variação experimental é a iluminação ambiente. A fonte de luz deve ser suficientemente brilhante para permitir que a aquisição de imagem, o reconhecimento das pistas extra-labirinto, e para induzir o comportamento de voo, mas não deve ser de uma intensidade cegar o animal. Além disso, sugerimos a realização dos testes para cada animal, ao mesmo tempode dia para evitar variações circadianas.

Mus musculus tem uma boa capacidade de visão que é, em condições naturais, entre outros utilizados para detectar os limites territoriais de características visuais marcantes (pistas visuais como árvores) (Latham et al., Appl. Animal Behav. Sci. 86 (3-4 ), 261-289, 2004). Em um experimento clássico Balkema et al. (J. Neurophysiol. 48 (4), 968-980, 1982) colocados 6, 0, e -7 lentes de dioptria em frente de rato olhos e não observaram alterações significativas de tamanhos de campo receptivas em células ganglionares da retina. Devido a este grande profundidade de campo estímulos visuais (por exemplo, tacos extra-labirinto) pode ser colocado sobre uma grande gama de distâncias em frente de ratinhos e permanecem em foco. Em nossa abordagem, a distância de pistas extra-labirinto do ponto de partida foi de 30 cm da borda da placa, que está de acordo com a literatura (por exemplo, 140 cm de WOng et al. Genes Behav cerebral 5. (5), 389-403, 2006)

Roedores têm a tendência a manter-se próximo às paredes de um campo aberto. Este comportamento é definido como thigmotaxis (Barnett, SH, O rato: um estudo de comportamento, publicação Aldline, Chicago, pp 31-32, 1963). Um estudo recente da O `Leary et al. (Behav. Brain Res.. 216 (2), 531-542, 2011) demonstrou que os ratinhos C57BL/6J mostrou melhor aprendizagem num Barnes labirinto em comparação com outras 12 estirpes de ratos. 28% dos ratos testados usado pesquisa espacial, enquanto 64% usaram estratégia serial-thigmotactic. Isto é verdadeiro para os dados labirinto pequeno com um diâmetro de 69 cm, com uma 15 centímetros parede circundante. No entanto, os ratos testados num grande labirinto sem paredes ou intramaze estímulos, como a configuração (diâmetro de 120 mm) mostraram evidência de forma fiável para a utilização de, principalmente, extra-labirinto pistas visuais (por exemplo, ver Bach et ai., Cell. 81 por exemplo, causadas por diferenças de microestrutura, a placa foi rodado depois de cada experimento.

O teste comportamental pode ser simplesmente adaptado para investigar o impacto de outros fatores de transcrição na neurogênese adulta, utilizando modelos de mouse apropriados. No entanto, ele é projetado principalmente para testar o aprendizado DG-dependente (separação padrão espacial), e pode não ser adequado para a investigação de neurogênese ou degeneração neuronal em outras regiões do cérebro. Nesse sentido, o uso de SPS-BM é ainda limitada pela sua DG-especificidade (estrita dependência de um circuito funcional entre EC II e DG e CA3 e CA1 e CE VI), e não deve, portanto, ser aplicado para investigar as tarefas que envolvem o monossináptico CE III - CA1 - CE V - circuito.

As aplicações futuras dos métodos descritos neste documento podem incluir a investigar os efeitos de transplantes de células-tronco, pharmaceutratamentos Tical sobre neurogênese adulta, e homeostase do tecido dentro do hipocampo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Moria MC17 Perforated Spoon	FST	10370-18	removal of the brains
Dissecting microscope	Carl Zeiss	Stemi SV8	removal of the brains
Surgical scissors	FST	14084-08	removal of the brains
Surgical scissors	FST	14381-43	removal of the brains
Dumont #5 forceps	FST	11254-20	removal of the brains
SuperFrost Slides	Carl Roth	1879	slides for immunohistochemistry
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	fixative
TissueTek OCT compound	Sakura Finetek	1004200018	embedding of the brains
Normal Goat Serum	Jackson Immunolabs	005-000-001	blocking in IHC
Normal Rabbit Serum	Jackson Immunolabs	011-000-001	blocking in IHC
Normal Donkey Serum	Jackson Immunolabs	017-000-001	blocking in IHC
anti-Neurofilament-M antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	2H3	IHC, Dilution 1:200
anti-Doublecortin antibody	sc-8066	Santa Cruz	IHC, Dilution 1:800
anti-GFP antibody	Abcam	ab290	IHC, Dilution 1:2,000
anti-BrdU antibody	OBT0030G	Accurate Chemicals	IHC, Dilution 1:2,000
Fluoro-Jade C	FJ-C	HistoChem	Determination of neuronal cell death
Betadine	Mundipharma	D08AG02	disinfectant
Cryomicrotome	Leica	CM1900	preparation of brain slices
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H3393	perfusion
Circular plate made from hard-plastic (diameter 120 cm)	lab made	none	plate for SPS-BM, diameter 120 cm
Buraton rapid disinfectant	Schülke Mayr	113 911	disinfectant
Video-tracking system TSE VideoMot 2 with Software Package VideoMot2	TSE Systems	302050-SW-KIT	tracking and analysis of SPS-BM
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787	permeabilization/IHC
Cryotome	Reichert Jung/Leica	Frigomobil 1206	preparation of 40 µm brain slices
Mowiol 4-88	Carl Roth	Art.-Nr. 0713	embedding of the slides
SYTOX green	Invitrogen	S7020	Nuclear staining
Food pellets (Kellog`s Froot Loops)	Kellog`s		SPS-BM
Prism, Version 3.0	Graph Pad Software, San Diego, USA		Statistical evaluation of SPS-BM
Zen 2008 or Zen 2011 Software	Carl Zeiss		Software (Confocal microscope)
D.P.X	Sigma-Aldrich	317616	mounting medium for Fluoro-Jade C staining