ثقافة معزولة الأنسجة الطابق بلور وإنتاج مشروطة متوسطة لتقييم خصائص وظيفية من الطابق إشارات اطلاق سراحهم لوحة

Summary

لوحة الكلمة هو بنية حاسمة من وضع الحبل الشوكي، وتوفير إشارات إنتشاري إلى الأسلاف والتفريق الخلايا العصبية. نحن تصف طريقة لإنتاج لوحة الطابق مكيفة المتوسطة، لتطبيقه على أنسجة الحبل الشوكي الطازجة، وتقييم العواقب على البروتينات من الاهتمام من خلال الكيمياء الحيوية.

Abstract

خلال التنمية، والأسلاف والخلايا العصبية بعد الإنقسامية تلقي إشارات من الأراضي المجاورة التي تنظم مصيرهم. في لوحة الكلمة هو مجموعة من الخلايا الدبقية بطانة القناة البطانة العصبية في موقف بطني. في لوحة تعبر عن الكلمة morphogens الرئيسية المساهمة في الزخرفة الأنساب الخلايا في الحبل الشوكي. في مراحل النمو في وقت لاحق، والكلمة لوحة ينظم الملاحة من محاور عصبية في الحبل الشوكي، التي تعمل كحاجز لمنع عبور المحاور المماثل وعبور خط الوسط السيطرة من قبل المحاور صواري ^1. يتم تحقيق هذه المهام من خلال إفراز العظة التوجيه المختلفة. بعض هذه الإشارات بمثابة جاذبة وطارد للمحاور المتزايد في حين أن آخرين تنظيم مستقبلات التوجيه وإشارات المصب لتعديل حساسية المحاور إلى العظة التوجيه المحلي ^2،3. نحن هنا وصف الأسلوب الذي يسمح بالتحقيق في خصائص الكلمة لوحة إشارات المشتقة في مجموعة متنوعة من ديفيسياقات lopmental، استنادا إلى إنتاج المتوسطة الطابق بلايت مكيفة (FP ^{سم) و 4-6.} نحن بعد ذلك مثالا على استخدام هذا FP ^سم في سياق توجيهات محوار. أولا، يتم عزل الحبل الشوكي من جنين فأر في E12.5 ويتم تشريح لوحة الكلمة من وزراعتها في مصفوفة البلازما الثرومبين (الشكل 1). في وقت لاحق الثانية يومين، يتم تشريح الأنسجة صواري خروج من أجنة E12.5، المسحوقة وتتعرض لFP ^سم. الثالثة، تتم معالجة الأنسجة لتحليل لطخة غربية من علامات صواري.

Introduction

في لوحة الأرض هي مركز الزخرفة المعروفة من الحبل الشوكي النامي، ولعب دورا رئيسيا في تحديد الأسلاف والأنساب خلية تالية للتفتل والسيطرة على محور عصبي الملاحة ^7،8. إجراء التجارب وصفها هنا لإنتاج FP ^سم يسمح للمحققين لتقييم الخصائص الفنية للإشارات المشتقة من الكلمة لوحة في سياقات مختلفة من العمليات التنموية، من الزخرفة الخلية والبقاء على قيد الحياة إلى الخلية والهجرة محور عصبي.

لتوضيح استخدام هذه FP ^سم، يتم تشريح الأنسجة الحبل الشوكي الظهري تحتوي على الخلايا العصبية صواري، dilacerated وحفز مع FP ^سم. ويمكن بعد ذلك معالجة الأنسجة لتحليل لطخة غربية. وهذا يسمح التحقيق أنظمة آلية التوجيه محوار بواسطة الكلمة لوحة إشارات الافراج عنهم. طريقة العلاج من الأنسجة الطازجة dilacerated يحمل ميزة كبيرة للحفاظ على المكروية من الخلايا داخل اله الأنسجة. وبالتالي يتم تقييم الآثار المترتبة على العلاج FP ^سم أو أي نوع من أنواع العلاج بطريقة أكثر من الفسيولوجية في الخلايا وظروف زراعة الأنسجة.

Protocol

DAY 1 1. تشريح الحبل الشوكي الدور لوحة (FP) من E12.5 أجنة الفئران ملاحظة: يتطلب هذا الإجراء بأكمله استخدام ظروف معقمة. فمن الأفضل لإجراء تشريح تحت غطاء تشريح لتجنب التلوث. يجب تنظيف السطح من هو?…

Representative Results

تم علاج الأنسجة صواري من قبل FP سم وتمت معالجة العينات لتحليل مستويات مستقبلات في لطخة غربية. وقد تبين تطبيق FP سم إلى زيادة مستويات مستقبلات التوجيه، PlexinA1، التي تتوسط حساسية المحاور صواري لخط الوسط طارد Semaphorin3B بعد عبور (الشكل 2). وكشف هذا أن الإشار?…

Discussion

إنتاج الأرض وحة مكيفة المتوسطة يوفر وسيلة فعالة وسهلة لتقييم الخصائص البيولوجية لوحة الطابق إشارات الافراج عنهم.

مصفوفة البلازما الثرومبين يوفر حالة ممتازة للبقاء الأنسجة. ومع ذلك، هذه البيئة المخصب قد يكون وجود قيود لبعض أنوا?…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTS REQUIRED
PBS	Invitrogen	14190-094
HBSS, Ca2+/Mg2+– free	Invitrogen	14170-088
Glucose	Sigma	G-7021
Neurobasal	Invitrogen	21103-049
Plasma	Sigma	P-3266	1mg/ml (Reconstitute in H2O and filtrate)
Thrombin	Sigma	T-4648	10mg/ml(Reconstitute in H2O and filtrate)
B27	Invitrogen	17504-044	50X
Hepes (260g/mol)	Sigma	H-7006
EDTA	Sigma	E-5513	0,5M pH8
MgCL2	Euromedex	2189	1M
Glycerol	VWR	24388.295
IGEPAL	Sigma	I-3021
Complete Protease inhibitor Cocktail Tablets	Roche	04 693 116 001
Sodium Orthovanadate (Na3VO4)	Sigma	S-6508
distilled H2O
			Table 1. Reagents required
			TOOLS AND MATERIAL
Surgical scissors	Fine Science Tools	14002-12
Adson forceps	Fine Science Tools	11027-12
Dumont #5 Fine Tips forceps	Fine Science Tools	11254-20
micro knives	Fine Science Tools	10136-14
			Table 2. Tools and material
			Dissection and FP culture Ethanol 70% dissection hood dissection microscope Petri dishes glass coverslips 18mm x 18mm Bunsen gas burner 24 well plate tissue culture incubator (37°C, 5% CO2, humidity controlled) Centrifuge RECIPES FP culture media Neurobasal B27 1/50e dilution from stock HBSS – Thrombin HBSS 1 ml Thrombin 10mg/ml 30 μl Lysis Buffer pH7,4 Hepes (260 g/mol) 25mM EDTA (pH8) 5mM MgCL2 1mM Glycerol 10% IGEPAL (NP40) 0.10% Protease Inhibitor Cocktail 1X Sodium Orthovanadate 0,2M H2O Laemmli Buffer Tris 0,5M, pH 6,8 375 mM SDS 6% Glycerol 60% DTT 0,6M Bromophenol blue H2O