תרבות של רקמות מבודדות פלייט מקיר לקיר וייצור בינוני אוויר כדי להעריך את התכונות פונקציונליות של איתותים שפורסם פלייט מקיר לקיר

Summary

צלחת הרצפה היא מבנה חיוני של תאי העצב מתפתח בעמוד השדרה, ומספקים אותות diffusible לאבות ומבדל. אנו מתארים שיטה להפקה בינונית מותנים בקומת צלחת, כדי להחיל אותו על רקמת חוט השדרה טרי, ועל מנת להעריך את ההשלכות על חלבונים של עניין על ידי ביוכימיה.

Abstract

במהלך פיתוח, אבות ונוירונים לאחר mitotic לקבל אותות משטחים סמוכים המסדירים את גורלם. רצפת הצלחת היא קבוצה של תאים המצפה את תעלת גליה ependymal בעמדת הגחון. רצפת הצלחת מבטאת morphogens מפתח תורם לדפוסים של שושלות תאים בחוט השדרה. בשלבי התפתחותיים מאוחרים יותר, בקומת הצלחת מסדירה את הניווט של אקסונים בחוט השדרה, הפועל כמחסום כדי למנוע את מעבר של אקסונים ipsilateral וחציית קו האמצע שליטה על ידי אקסונים commissural ^1. פונקציות אלה מושגות באמצעות הפרשת אותות הנחיה שונות. חלק מרמזים אלה לפעול כמשיכה ודוחים לאקסונים גדל בעוד שאחרים להסדיר קולטנים הדרכה ואיתות במורד הזרם כדי לווסת את הרגישות של האקסונים לאותות הנחיה המקומיים ^2,3. כאן אנו מתארים שיטה המאפשרת לחקור את תכונותיהם של אותות הנגזרים מהרצפה צלחת במגוון deveהקשרי lopmental, המבוססים על הייצור של מדיום לקיר-פלייט מותנה ^{(סנטימטר} FP) ^4-6. לאחר מכן, אנו מדגימים את השימוש ^{בסנטימטר} FP זה בהקשר של הדרכה האקסון. ראשית, בחוט השדרה מבודד מעובר של העכבר בE12.5 ורצפת הצלחת גזור החוצה וטיפחה במטריצת הפלזמה תרומבין (איור 1). שני ימים שני לאחר מכן, רקמות commissural הם גזורים החוצה מעוברי E12.5, triturated ונחשפו ^{לסנטימטר} FP. שלישית, הרקמה מעובדות לניתוח כתם מערבי של סמני commissural.

Introduction

רצפת הצלחת היא מרכז דפוסים ידוע של חוט השדרה המתפתח, ממלא תפקידי מפתח במפרט של אבות ושושלות תאי postmitotic ושליטה ניווט האקסון ^7,8. הליך הניסוי שתואר כאן כדי לייצר ^{סנטימטר} FP מאפשר לחוקרים להעריך את המאפיינים הפונקציונליים של אותות המופק מצלחת רצפה בהקשרים שונים של תהליכים התפתחותיים, מדפוסי תא והישרדות לתא וההגירה האקסון.

כדי להדגים את השימוש ^{בסנטימטר} FP כגון, רקמות חוט השדרה הגבי מכילות נוירונים commissural הם גזורים, dilacerated ומגורה עם ^{סנטימטר} FP. הרקמות אז יכולות להיות מעובד לניתוח כתם מערבי. זה מאפשר לחקור את התקנות של מכונות האקסון הדרכה על ידי אותות שוחררו מהרצפה צלחת. שיטת הטיפול של רקמה טרי dilacerated מחזיקה את היתרון הגדול של שימור microenvironment של תאים בתוך הדואר רקמות. לכן ההשלכות של הטיפול על ידי ^{סנטימטר} FP או כל סוגים של טיפול מוערכים באופן פיסיולוגי יותר מאשר בתא ותנאים בתרבית רקמה.

Protocol

יום 1

1. Dissection של פלייט בחוט השדרה מקיר לקיר (FP) מE12.5 עוברי עכברים

הערה: כל ההליך מחייב השימוש בתנאים סטריליים. עדיף לבצע את הנתיחה מתחת למכסת מנוע לנתיחה, כדי למנוע זיהום. פני השטח של מכסה המנוע יש לנקות עם אתנול. כל מכשירי הנתיחה חייבים להיות מעוקרים והמשיכו בצלחת פטרי סטרילית. הנוזלים (מדיום, מדיום לנתיחה) חייבים להיות כל הזמן סגור ולשים באמבט קרח. כל עובר צריך להיות שנאסף בירידה טרי בודדת. זה חשוב לשימור רקמות. הנתיחה מתבצעת עם דומון # 5 מלקחיים. כדי להעביר את העוברים בין מנות, אחיזת חבל הטבור או הראש ללא כל נזק למוח האחורי. זה קריטי שלא לפגוע בחוט השדרה על מנת להשלים את הנתיחה בהצלחה. הכן קר בופר פוספט (PBS), תמיסת מלח מאוזנת של האנק הקר (HBSS) -גלוקוז 6.5% ובינוניים neurobasal טמפרטורת חדר.

1.1 נתיחת חוט השדרה

מטופלים בעלי חיים על פי הנחיות הטיפול בבעלי החיים של המרכז הלאומי de la משוכלל ונדיר Scientifique הבאים הנחיות אירופאיות. השיטה של ​​המתת חסד היא נקע בצוואר הרחם, היא מורכבת מהפעלה לחץ על הצוואר ונקע את עמוד השדרה מהמוח. שיטה זו מומלצת למודלים של בעלי החיים עכבר, והוא יכול להתבצע באופן מהיר ויעיל.

1. להרדים עכבר בהריון בE12.5 של הריון (E0.5 = שטיחים ליום ראשון הבאים). הנח את צד הגחון העכבר כלפי מעלה.
2. משרים את הבטן עם 70% אתנול. לצבוט את העור של הבטן עם מלקחיים Adson ולחתוך דרך העור ושכבות הצפק עם מספריים כירורגיות. עושה חתך ולהשתמש בו כדי לחתוך משני צידי העכבר כדי לחשוף את חלל הבטן.
3. מחרוזת של עוברים נמצאת בצד אחד של העכבר. לתפוס צופר אחד אוטהrus ברקמה בין שני עוברים ולנתח את זה מתחיל מהחלק החיצוני. העבר את הרחם בשלמותה בצלחת פטרי 100 מ"מ עם PBS הקר על קרח.
4. חלץ את העוברים מרקמות חוץ עובריים. אחוז ברקמת השליה (באדום כהה) עם שני זוגות מלקחיים ולמשוך בעדינות לקרוע את הרקמות ולהסיר את העוברים מהשק ברחם.

הערה: לשימור טוב יותר, לאסוף את העוברים מהשק ברחם שלהם האחד אחד.

5. בשלבים הבאים נעשים תחת זכוכית מגדלת משקפת ומכסה מנוע לנתיחה. הנח עובר אחד בירידה של גלוקוז HBSS-6.5% הקרים.
6. בעזרת מלקחיים, לערוף את העובר.

הערה: חותכים בין הלסת והמוח האחורי התחתונות, החלק האחורי של המוח האחורי הוא חשוב לשלבים הבאים.

7. הנח את הגחון העובר למטה עם החלק הקדמי מול הנסיין.
8. לצבוט את העורשל העובר עם זוג אחד של מלקחיים ועם הזוג האחר למשוך את העור.

הערה: בשלב זה יש צורך לחזור עד לעור הוסר לחלוטין מהחלק הקדמי של העובר.

9. הפעל את הצד קדמי עובר בצד השמאל. עם אחד מלקחיים "להצמיד" את העובר בחלק הקדמי. עם המלקחיים האחרים לתפוס את העור ולמשוך לכיוון הצד מקורי של העובר. חוט השדרה הוא אז נגיש.
10. השתמש בצד אחד של המלקחיים לחתוך את קרומי המוח שעדיין עוטף את חוט השדרה. חוט השדרה הוא פתוח עכשיו.
11. הפעל את הצד קדמי עובר בצד הימין.
12. לנתק את הרקמה מחוט השדרה מתחיל מהצד של צוואר הרחם של העובר. החלק את המלקחיים תחת חוט השדרה (המלקחיים צריכים לתת דין ונסגרו כדי למנוע נזק בחוט השדרה). המלקחיים צריכים להיות גלוי מתחת לחוט השדרה. תנועות סבובי קטנות מתחת לחוט השדרה יש בם כדי לנתק אתרקמה הסובבת וגרעינים הגבי שורש (DRG).

הערה: רקמה שמסביב מצורף השארת להוסיף משקל לחוט השדרה, ובכך להגדיל את ההסתברות של לשבור אותו בשלב הבא.

13. מניחים את חוט השדרה המבודד בירידה טרי של גלוקוז HBSS-6.5% הקרים.
14. מניחים את חוט השדרה במצב שטוח, קרומי המוח בצד העליון וקדמי מן הנסיין.
15. "להצמיד" את חוט השדרה באמצעות המוח האחורי שנותר עם מלקחיים, ועם המלקחיים שני לתפוס את קרומי המוח. לקלף את קרומי המוח מתחילים מהצד מקורי של חוט השדרה.

הערה: התנועה צריכה להיות איטית ומתמדת, כדי למנוע כל שבירה של חוט השדרה. תנועות רטט יכולות להקל על הניתוק של קרומי המוח.

1.2 נתיחת FP

1. לצבוט את המוח האחורי עם מלקחיים.
2. FP הוא טרה המרכזיתחלק nsparent של הרקמה. באמצעות אזמל לחתוך את צלחת הרצפה.

הערה: כדי לחתוך את שני הצדדים באותה האיכות, להתחיל מהצד מקורי ולחלופין לחתוך את צד ימין וצד השמאל של צלחת הרצפה.

3. לשמר את FP גזור במדיום Neurobasal בטמפרטורת חדר.

2. FP תרבות

שימו לב: יש לבצע את כל השלבים בתנאים סטריליים במנדף בתרבית רקמה. השתמש בינוני טריים ותוספי מזון וחומרים כימיים מופשרים טרי. הכן את coverslips סטרילי זכוכית, neurobasal החם + B27, פלזמה, וHBSS-תרומבין.

2.1 תרבות FP

1. הנח כמה coverslips סטרילי בצלחת פטרי 100 מ"מ ופיפטה 20 פלזמה μl במרכזו של כל coverslip.
2. העבר 03:58 FP בכל טיפת פלזמה ולהוסיף 20 μl HBSS-תרומבין לצד הירידה בפלזמה ומערבבים בזהירות. שמור את coverslipsעבור מינימום של עשר דקות בטמפרטורת חדר כדי לאפשר קרישה של הפלזמה.

הערה: העברת שני FPS במקרה של נתיחה מלאה ויותר במקרה של נתיחה חלקית. מערבבים לאט עם קצה פיפטה ולהימנע ממגע עם explants FP.

קריש הפלזמה חזר בו כמה מיקרומטר כסימן לקרישה. הקרישה אסור הפסיקה בטרם עת, כדי למנוע ניתוק של קריש הפלזמה.

3. העבר את כל coverslip בצלחת 24 היטב ולהוסיף 500 μl של Neurobasal + B27. דגירה 48 שעות על 37 ° C.

יום 3

3. קצירה בינונית FP אוויר ^{(סנטימטר} FP)

הערה: קצירה צריכה להתבצע בתנאים סטריליים במנדף בתרבית רקמה. אם את supernatant מזוהם או אם צלחות רצפה צפות (כלומר הם עלולים למות במהלך פרי התרבותOD) אז לא למסוק ^{סנטימטר} FP מזה היטב.

קצירת ^{סנטימטר} 3.1 FP

1. למסוק בזהירות בינונית מכל טוב.

הערה: אל פיפטה את תערובת הפלזמה תרומבין polymerized או כל שברי FP.

2. אחסן 100 aliquots μl ב -80 ° C.

יום 4

4. Dissection של חוט השדרה Commissural נוירונים מE12.5 עוברי עכברים

הערה: הכנה זו אינה צריכה להתבצע בתנאים סטריליים. בצע את ההליך המתואר לעיל כדי לאסוף את העוברים. הקר PBS להכין, גלוקוז הקר HBSS-6.5% וneurobasal הקר.

4.1 נתיחת חוט השדרה

1. בעזרת מלקחיים, לערוף את העובר.

הערה: חותכים בין הלסת והמוח האחורי התחתונות, החלק האחורי של המוח האחורי הוא חשוב עבורהשלבים הבאים.

2. הנח את הגחון העובר למטה בירידה טרי עם החלק הקדמי מול הנסיין.
3. לצבוט את העור של העובר עם מלקחיים ובשנייה אחת למשוך את העור.

הערה: בשלב זה יש צורך לחזור עד לעור הוסר לחלוטין מהחלק הקדמי של העובר.

4. הפעל את הצד קדמי עובר בצד השמאל. עם אחד מלקחיים "להצמיד" את העובר בחלק הקדמי. עם מלקחיים האחרים, לתפוס את העור ולמשוך לכיוון הצד מקורי של העובר, כדי לחשוף את חוט השדרה.
5. השתמש בצד אחד של המלקחיים לחתוך את קרומי המוח שעדיין עוטף את חוט השדרה. חוט השדרה הוא כעת נחשף ופתוח.
6. מקם את הצד הקדמי העובר בצד הימין.
7. לנתק את הרקמה מחוט השדרה מתחיל מהצד של צוואר הרחם של העובר. החלק את המלקחיים תחת חוט השדרה (לשמור המלקחיים סגורים). עבורפטריות לבנות חייבות גלויות מתחת לחוט השדרה. תנועות סבובי קטנות מתחת לחוט השדרה יש בם כדי לנתק את הרקמות הסמוכות וגרעינים הגבי שורש (DRG).
8. העבר את חוט השדרה המבודד בירידה חדשה של גלוקוז HBSS-6.5% הקרים.
9. מניחים את חוט השדרה במצב שטוח, קרומי המוח בצד העליון וקדמי מן הנסיין.
10. "להצמיד" את חוט השדרה באמצעות המוח האחורי שנותר עם מלקחיים, עם המלקחיים שני לתפוס את קרומי המוח. לקלף את קרומי המוח מתחילים מהצד מקורי של חוט השדרה.

4.2 נתיחת Commissural Neuron

1. לצבוט את המוח האחורי עם מלקחיים.
2. נוירונים Commissural ממוקמים בחלקו לרוחב ביותר של חוט השדרה (צד הגב). לגזור חלק לרוחב זה עם אזמל דק.

הערה: החלק הגבי של חוט השדרה ניתן להבחין בין חלק הגחון על ידי הבדל של ד התאensity, חלק הגחון להיות אטום יותר.

הערה: כדי לחתוך את שני הצדדים באותה האיכות, להתחיל מהצד מקורי ולחלופין לחתוך אורך קטן של צד ימין ושל צד השמאל.

3. לשמר את הרקמה גזור במדיום Neurobasal על קרח לשימוש מיידי.

5. טיפול ברקמות Commissural עם ^{סנטימטר} FP

הערה: הליך זה אינו דורש תנאים סטריליים. הרקמות צריכה להיות שנאספו ב1.5 מיליליטר צינורות בודדים. יש להשתמש ^{בסנטימטר} FP הקפוא רק פעם אחת. הימנע refreezing מרובה. הכן ^{סנטימטר} FP חם (37 מעלות צלזיוס).

5.1 טיפולים של נוירונים commissural

1. Dilacerate רקמת commissural עם מספריים קטנים.

הערה: חותכים את הרקמה הקטנה ככל האפשר, כדי להגביר את הנגישות של התאים.

2. הפץ למדי הרקמה בין הטיפול שונה הניסיוני שליטת תנאים וטיפול ^{סנטימטר} FP.
3. צנטריפוגה שברי הרקמה בXG 800 דקות 1 ב 4 ° C.
4. בדוק את המחיצות בין צינורות.

הערה: אם יש צורך להפיץ מחדש ו צנטריפוגות שוב עד שברים מופצים באופן שווה.

5. הסר את supernatant.
6. הוסף את טיפולי ^{סנטימטר} ושליטה FP החמים לרקמות.

הערה: הנפח חייב להיות מותאם לכמות של גלולה וצריך להיות לפחות פי שניים מהנפח של גלולה.

7. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.

הערה: נער בעדינות בכל דקות 10-15

8. צנטריפוגה ב XG 800 דקות 1 ולהסיר את הטיפול.
9. מוסיף את מאגר תמוגה

הערה: הנפח חייב להיות מותאם להר של גלולה וצריך להיות לפחות פי שניים מהנפח של גלולה.

10. פיפטה מעלה ומטה כדי resuspend את הכדור.

שים לב: גם מערבולת יכולה לשמש.

11. דגירה 15 דקות על קרח.
12. צנטריפוגה ב XG 14,000 במשך 15 דקות ב 4 ° C.
13. שמור את supernatant ולמדוד את כמות החלבון עם assay ברדפורד ^9.
14. הוספת 6x Laemmli הצפת.
15. לדגור על C ° 95 במשך 5 דקות כדי לפגל תכולת החלבון.

הערה: ניתן להשתמש בדוגמאות באופן מיידי או שניתן לאחסן ב -80 ° C.

16. להעריך את ההשפעות של הטיפול על ידי כתם מערבי ^10.

הערה: לפחות 50 מיקרוגרם של חלבונים בסך הכל צריכים להיות טעונים לנתיב אחד.

Representative Results

טופלו רקמות Commissural ידי ^{סנטימטר} FP והדגימות עובדו לניתוח של רמות הקולטן בכתם מערבי. יישום של ^{סנטימטר} FP הוצג כדי להגדיל את הרמות של הקולטן הדרכה, PlexinA1, אשר מתווך את הרגישות של האקסונים commissural לSemaphorin3B דוחה קו האמצע לאחר החצייה (איור 2). זה גילה כי אותות שפורסמו על ידי FP לווסת את רמות PlexinA1 ^4,6.

איור 1. ערכות של הליך הנתיחה כדי לבודד את הצלחת מקיר לקיר. השלבים השונים של הנתיחה והליך התרבות מומחשות. 1) לחתוך את ראש עובר; 2-3) להסיר את העור; 4) לפתוח את קרומי המוח; 5-6) להסיר את חוט השדרה של העובר; 7) להסיר את הגבריםinges; 8-9) לנתח את צלחת הרצפה; 10) להוסיף את תרומבין לתערובת FP-הפלזמה ולחכות 10-15 דקות בטמפרטורת חדר לפני שמוסיף את המדיום לתרבות. 11-12) לנתח את תאי העצב הגבי; 13) dilacerate הרקמות. : מוט קדמי של העובר. P: קוטב אחורי של העובר. החצים מתארים את כיוון התנועה. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

איור 2. תוצאת נציג. א) רקמות בעמוד השדרה הגבי נאספו, dilacerated ומגורה עם המדיום מותנה צלחת מקיר לקיר ובינוני שליטה. דגימות lysed ומעובד לכתם מערבי. חלבונים נבדקו עם נוגדנים נגד PlexinA1, וβ-אקטין. עמ 'hoto ממחיש את העלייה של רמות PlexinA1 במדגם מגורה עם רצפת צלחת מזגן בינוני. ב ') כתם הנקודה מראה את הביטוי של GDNF בFP ^{סנטימטר} בהשוואה למדיום שליטתו של זה.

Discussion

הייצור של מדיום מותנה בקומת צלחת מספק דרך יעילה וקלה להערכת המאפיינים הביולוגיים של אותות שוחררו צלחת רצפה.

מטריקס הפלזמה תרומבין מספק מצב מצוין להישרדות רקמות. עם זאת, סביבה מועשרת זה עשויה להיות מגבלה עבור סוגים מסוימים של ניסויים. לפיכך, רקמת צלחת רצפה יכולה גם להיות מעובד במטריצת agarose. האיכות של המדיום המותנה צלחת רצפה ניתן להעריך על ידי זיהוי של אותות ידועים בקומת צלחת שוחררו, כגון GDNF (איור 2), ששש ^ו11 Netrin. הנוכחות שלהם במדיום המותנה ניתן להעריך על ידי כתם מערבי או כתם נקודה.

בהליך זה תאים נלמדים בmicroenvironment האם שלהם. זה מונע מידע נוסף על הסוג של תאים ברקמה המגיבות לטיפול. כצלחת הרצפה היא לא מבנה הומוגני, הריכוז של מעשהרכיבי ive כגון Wnts עשויים להיות שונים בין התרבויות בהתאם לאזור גזור לאורך ציר rostro-הזנב.

ביוכימיה על רקמת dilacerated טרי מחזיקה את היתרון ללמוד תאים בmicroenvironment האם שלהם. לפיכך, התנהגויות תא נחקרות בתנאים שיסכמו ככל האפשר ההקשר המקורי שלהם ^12. חוט השדרה הגבי אינו מכיל תאי עצב commissural רק כך את ההשפעות של ^{סנטימטר} FP יכולות גם להיות מוערכות בנוירונים commissural בתרבית.

הבינוני יכול להיות מיושם על סוגים שונים של תרביות תאים ורקמות. מגוון גדול של פרמטרים ניתן להעריך, מהזהות תא, הישרדות תא, מוות של תאים, והתמיינות תאים. דוגמאות יכולות להיות מעובד לפרוטאומיקה.

פרמטר חשוב בהכנה של הרקמה טרי dilacerated הוא חלוקה מחודשת של הרקמות לשליטה ולטיפולים ניסיוניים. זה יבואנמלה לאסוף את הרקמות ראשונה בצינור יחיד וdilacerate הרקמה לפני קולקטיבי להפריד את הדגימות. זה מגביל את ההבדל של ריכוז החלבון זוהה לאחר תמוגה בין דגימות.

שים לב שHBSS-גלוקוז יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס עד לחודש אחד. יכול גם להיות כל הזמן neurobasal לחודש אחד ב 4 ° C. ניתן לאחסן aliquots B27 ב-20 ° C לטווח ארוך ועל 4 מעלות צלזיוס למשך שבוע עד אחת. aliquots פלזמה צריכים להיות חנות ב -20 מעלות צלזיוס, וניתן refrozen לאחר שימוש. יכולים גם להיות מאוחסנים aliquots תרומבין ב -20 מעלות צלזיוס ולא ניתן refrozen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents Required
PBS	Invitrogen	14190-094
HBSS, Ca2+/Mg2+- free	Invitrogen	14170-088
Glucose	Sigma	G-7021
Neurobasal	Invitrogen	21103-049
Plasma	Sigma	P-3266	1 mg/ml (Reconstitute in H2O and filtrate)
Thrombin	Sigma	T-4648	10 mg/ml(Reconstitute in H2O and filtrate)
B27	Invitrogen	17504-044	50x
HEPES (260 g/mol)	Sigma	H-7006
EDTA	Sigma	E-5513	0.5 M, pH 8
MgCl2	Euromedex	2189	1M
Glycerol	VWR	24388.295
IGEPAL	Sigma	I-3021
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets	Roche	04 693 116 001
Sodium Orthovanadate (Na3VO4)	Sigma	S-6508
Distilled H2O
Table 1.Reagents required.
Tools and Materials
Surgical scissors	Fine Science Tools	14002-12
Adson forceps	Fine Science Tools	11027-12
Dumont #5 Fine Tips forceps	Fine Science Tools	11254-20
Microknives	Fine Science Tools	10136-14
Table 2. Tools and materials.
Dissection and FP culture Ethanol 70% dissection hood dissection microscope Petri dishes glass coverslips 18 mm x 18 mm Bunsen gas burner 24-well plate tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2, humidity controlled) Centrifuge Recipes FP culture media Neurobasal B27 1/50e dilution from stock HBSS-thrombin HBSS 1 ml Thrombin 10 mg/ml 30 μl Lysis Buffer pH 7,4 HEPES (260 g/mol) 25 mM EDTA (pH 8) 5 mM MgCl2 1 mM Glycerol 10% IGEPAL (NP40) 0.10% Protease Inhibitor Cocktail 1x Sodium Orthovanadate 0.2 M H2O Laemmli Buffer Tris 0.5 M, pH 6,8 375 mM SDS 6% Glycerol 60% DTT 0.6 M Bromophenol blue H2O