Summary
La placa de piso es una estructura fundamental de las neuronas en desarrollo de la médula espinal, que proporcionan señales difusibles a progenitores y diferenciadoras. Se describe un método para producir suelo-placa de medio condicionado, para aplicarlo al tejido de la médula espinal fresco, y para evaluar las consecuencias de las proteínas de interés por la bioquímica.
Abstract
Durante el desarrollo, los progenitores y neuronas post-mitóticas reciben señales de los territorios adyacentes que regulan su destino. La placa de suelo-es un grupo de células gliales que revisten el canal ependimal en la posición ventral. La placa de suelo-expresa morfógenos clave que contribuyen al patrón de linajes de células en la médula espinal. En etapas posteriores del desarrollo, la placa de suelo regula la navegación de los axones en la médula espinal, actuando como una barrera para prevenir el cruce de los axones ipsilaterales y cruzando la línea media de control por los axones comisurales 1. Estas funciones se logran a través de la secreción de varias señales de orientación. Algunas de estas señales actúan como atrayentes y repelentes para los axones en crecimiento, mientras que otros regulan los receptores de orientación y de señalización aguas abajo para modular la sensibilidad de los axones a las señales de orientación locales 2,3. Aquí se describe un método que permite la investigación de las propiedades de las señales derivadas piso de placa en una variedad de desacontextos lopmental, basadas en la producción de medio piso-Plate acondicionado (FP cm) 4-6. A continuación, ejemplifican el uso de esta FP cm en el contexto de la guía de axones. En primer lugar, la médula espinal está aislada de embrión de ratón en E12.5 y la placa de piso se diseccionó y se cultiva en una matriz de plasma-trombina (Figura 1). Segunda dos días más tarde, el tejido comisural se disecan a cabo a partir de embriones E12.5, trituró y se expone a la cm FP. En tercer lugar, el tejido se procesan para el análisis de transferencia de Western de marcadores comisurales.
Introduction
La placa de piso es un centro patrón bien conocido de la médula espinal en desarrollo, juega un papel clave en la especificación de los progenitores y los linajes de células postnatales y el control de navegación de los axones 7,8. El procedimiento experimental descrito aquí para producir FP cm permite a los investigadores para evaluar las propiedades funcionales de las señales de derivados de chapa piso en un diversos contextos de los procesos de desarrollo, a partir del patrón celular y la supervivencia celular y la migración a axón.
Para ilustrar el uso de tales FP cm, los tejidos de la médula espinal dorsal que contienen neuronas comisurales se diseccionan, dilacerada y se estimularon con el CM FP. Los tejidos se pueden procesar para el análisis de transferencia de Western. Esto permite que la investigación de las regulaciones de la maquinaria de guiado de los axones por las señales liberadas piso de placa. El método de tratamiento de tejido fresco dilacerada tiene la gran ventaja de conservar el microambiente de las células dentro ªe tejido. Así, las consecuencias del tratamiento por FP cm o cualquier tipo de tratamiento se evalúan de una manera más fisiológica que en células y condiciones de cultivo de tejidos.
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Protocol
DÍA 1
1. La disección de la médula espinal Placa del piso (FP) de E12.5 embriones de ratón
Nota: Todo el procedimiento requiere el uso de condiciones estériles. Es preferible llevar a cabo la disección bajo una campana de disección para evitar la contaminación. La superficie de la campana debe ser limpiada con etanol. Todos los instrumentos de disección deben ser esterilizados y se mantienen en una placa de Petri estéril. Los líquidos (media, mediana disección) deben mantenerse cerradas y poner en un baño de hielo. Cada embrión se debe recoger en fresco gota individual. Esto es importante para la conservación de tejidos. La disección se realiza con Dumont # 5 fórceps. Para transferir los embriones de platos, agarrar el cordón umbilical o de la cabeza y sin ningún daño en el cerebro posterior. Es crítico de no dañar la médula espinal para completar con éxito la disección. Preparar frío tampón fosfato salino (PBS), solución salina equilibrada de Hank fría (HBSS) -6,5% de glucosa y habitación mediana neurobasal temperatura.
1,1 disección de la médula espinal
Los animales son tratados de acuerdo con las directrices de cuidado animal del Centre National de la Recherche Scientifique siguientes directivas europeas. El método de la eutanasia es dislocación cervical, que consiste en la aplicación de presión al cuello y dislocación de la columna vertebral desde el cerebro. Este método se recomienda para modelos animales de ratón, y se puede realizar de una manera rápida y eficiente.
- La eutanasia a un ratón embarazada en E12.5 de la gestación (E0.5 = primer día siguiente esteras). Coloque el ratón la parte ventral.
- Remoje el abdomen con etanol al 70%. Pellizcar la piel del abdomen con fórceps Adson y cortar a través de la piel y las capas peritoneales con tijeras quirúrgicas. Hacer una incisión y lo utilizan para cortar en ambos lados del ratón para exponer la cavidad abdominal.
- Una cadena de embriones está presente en cada lado del ratón. Agarre uno de los cuernos del uterus en el tejido entre dos embriones y diseccionar hacia fuera a partir de la parte exterior. Transferir el útero intacto a un 100 mm placa de Petri con PBS frío en hielo.
- Extraer los embriones procedentes de tejidos extra-embrionarios. Sujete el tejido de la placenta (en rojo oscuro), con dos pares de pinzas y tire suavemente para desgarrar los tejidos y eliminar los embriones desde el saco uterino.
Nota: Para una mejor conservación, recoger los embriones de su saco uterino uno por uno.
- Los siguientes pasos se realizan bajo la lupa binocular y el capó disección. Coloque un embrión en una gota de frío HBSS-6.5% de glucosa.
- Con unas pinzas, decapitar al embrión.
Nota: Corte entre la mandíbula inferior y la parte posterior del cerebro, la parte posterior de la parte posterior del cerebro es importante para los próximos pasos.
- Coloque la cara ventral del embrión hacia abajo con la parte anterior hacia el experimentador.
- Apriete la pieldel embrión con un par de fórceps y con el otro par alejarse de la piel.
Nota: Este paso tiene que ser repetido hasta que la piel se elimina completamente de la parte anterior del embrión.
- Girar el lado anterior del embrión a la izquierda. Con un fórceps "precisar" el embrión en la parte anterior. Con las otras pinzas agarran la piel y tire hacia el lado rostral del embrión. La médula espinal es entonces accesible.
- Utilice uno de los lados de las pinzas para cortar las meninges que aún envuelven la médula espinal. La médula espinal está abierto.
- Girar el lado anterior del embrión a la derecha.
- Separar el tejido de la médula espinal a partir de la parte cervical de la embrión. Deslice la pinza debajo de la médula espinal (las pinzas deben mantenerse cerradas para evitar el daño de la médula espinal). Las pinzas tienen que ser visible bajo la médula espinal. Movimientos rotatorios pequeños menores de la médula espinal son suficientes para separar lael tejido circundante y los ganglios de la raíz dorsal (DRG).
Nota: Dejando tejido circundante adjunta añadir peso a la médula espinal, aumentando así la probabilidad de romper que durante el paso siguiente.
- Coloque la médula espinal aislada en una fresca gota de frío HBSS-6.5% de glucosa.
- Coloque la médula espinal en una posición plana, las meninges en el lado superior y anterior de distancia desde el experimentador.
- "Precisar" la médula espinal con el cerebro posterior restante con una pinzas, y con las segundas pinzas agarran las meninges. Despegar las meninges a partir de la parte rostral de la médula espinal.
Nota: El movimiento debe ser lenta y constante para evitar cualquier rotura de la médula espinal. Movimientos vibratorios pueden facilitar el desprendimiento de las meninges.
1.2 disección FP
- Apriete la parte posterior del cerebro con una pinza.
- La FP es el centro de transparent parte del tejido. Con un escalpelo cortó la placa de piso.
Nota: Para cortar ambos lados con la misma calidad, comenzando por la parte rostral y alternativamente cortar el lado derecho y el lado izquierdo de la placa de piso.
- Conserve la FP diseccionado en medio Neurobasal a temperatura ambiente.
2. FP Cultura
Nota: Todos los pasos deben realizarse en condiciones estériles en una campana de cultivo de tejidos. Utilice un medio fresco y suplementos recién descongeladas y reactivos. Preparar cubreobjetos estériles de vidrio, neurobasal caliente + B27, plasma y HBSS-trombina.
2.1 cultura FP
- Coloque varios cubreobjetos estériles en una placa de Petri de 100 mm y la pipeta 20 l de plasma en el centro de cada cubreobjetos.
- Traslado tres y cincuenta y ocho FP en cada gota de plasma y añadir 20 l HBSS-trombina junto a la caída de plasma y mezclar con cuidado. Mantenga los cubreobjetospara un mínimo de diez minutos a temperatura ambiente para permitir la coagulación del plasma.
Nota: Transferencia de dos programas marco en el caso de la disección completa y más en el caso de la disección parcial. Mezclar lentamente con una punta de pipeta y evitar el contacto con los explantes de PF.
El coágulo de plasma se retrae una pocas micras como un signo de la coagulación. La coagulación no debe ser detenida antes de tiempo, para evitar el desprendimiento del coágulo de plasma.
- Transfiera cada cubreobjetos en una placa de 24 pocillos y añadir 500 l de Neurobasal + B27. Incubar 48 horas a 37 ° C.
DÍA 3
3. FP medio condicionado (FP cm) Cosecha
Nota: La recolección debe realizarse en condiciones estériles en una campana de cultivo de tejidos. Si el sobrenadante está contaminado o si las placas de piso están flotando (lo que significa que podría haber muerto durante los peri culturaod) entonces no cosechar el cm FP de este pozo.
3.1 FP cm recolección
- Recoger cuidadosamente el medio de cada pocillo.
Nota: No pipetear la mezcla de plasma-trombina polimerizado o cualquier fragmento de PF.
- Almacene 100 ml de alícuotas a -80 ° C.
DIA 4
4. La disección de la médula espinal comisural neuronas de E12.5 embriones de ratón
Nota: Esta preparación no necesita ser realizado en condiciones estériles. Siga el procedimiento descrito anteriormente para recoger los embriones. Preparar PBS frío, frío HBSS-6.5% de glucosa y neurobasal frío.
4,1 disección de la médula espinal
- Con unas pinzas, decapitar al embrión.
Nota: Corte entre la mandíbula inferior y la parte posterior del cerebro, la parte posterior de la parte posterior del cerebro es importante para lapróximos pasos.
- Coloque la cara ventral del embrión en una gota fresca con la parte anterior hacia el experimentador.
- Apriete la piel del embrión con una pinzas y con la otra tire lejos de la piel.
Nota: Este paso tiene que ser repetido hasta que la piel se elimina completamente de la parte anterior del embrión.
- Girar el lado anterior del embrión a la izquierda. Con un fórceps "precisar" el embrión en la parte anterior. Con las otras pinzas, agarre y tire de la piel hacia el lado rostral del embrión, para exponer la médula espinal.
- Utilice uno de los lados de las pinzas para cortar las meninges que aún envuelven la médula espinal. La médula espinal está ahora expuesta y abierta.
- Coloque el lado anterior del embrión a la derecha.
- Separar el tejido de la médula espinal a partir de la parte cervical de la embrión. Deslice la pinza debajo de la médula espinal (mantener el fórceps cerrado). ParaCEPS debe visible bajo la médula espinal. Movimientos rotatorios pequeños menores de la médula espinal son suficientes para separar el tejido adyacente y los ganglios de la raíz dorsal (DRG).
- Transfiera la médula espinal aislada en una nueva gota de frío HBSS-6.5% de glucosa.
- Coloque la médula espinal en una posición plana, las meninges en el lado superior y anterior de distancia desde el experimentador.
- "Precisar" la médula espinal con el cerebro posterior restante con una pinzas, con las segundas pinzas agarran las meninges. Despegar las meninges a partir de la parte rostral de la médula espinal.
4.2 disección comisural Neurona
- Apriete la parte posterior del cerebro con una pinza.
- Las neuronas comisurales se encuentran en la parte más lateral de la médula espinal (el lado dorsal). Recorte esta parte lateral con un fino bisturí.
Nota: La parte dorsal de la médula espinal se puede distinguir de la parte ventral por diferencia de la celda density, la parte ventral ser más opaca.
Nota: Para cortar ambos lados con la misma calidad, comenzando por la parte rostral y alternativamente cortar una pequeña longitud del lado derecho y del lado izquierdo.
- Conserve el tejido diseccionado en medio Neurobasal en hielo para su uso inmediato.
5. Tratamiento del tejido con el comisural cm FP
Nota: Este procedimiento no requiere condiciones estériles. El tejido debe recogerse en los distintos tubos de 1,5 ml. El congelado FP cm debe utilizarse sólo una vez. Evite volver a congelar múltiple. Preparar cálida FP cm (37 ° C).
5.1 Tratamiento de las neuronas comisurales
- Dilacerate el tejido comisural con unas tijeras pequeñas.
Nota: cortar el tejido lo más pequeño posible, para potenciar la accesibilidad de las células.
- Distribuir equitativamente el tejido entre la diferencia de trato condiciones de control experimental y FP cm tratamiento.
- Centrifugar los fragmentos de tejido a 800 xg durante 1 min a 4 ° C.
- Compruebe el reparto entre los tubos.
Nota: Si es necesario redistribuir y centrifugar de nuevo hasta que los fragmentos se distribuyen por igual.
- Eliminar el sobrenadante.
- Agregue los cm y control de tratamientos calientes PF a los tejidos.
Nota: El volumen se ajusta a la cantidad de la pastilla y debe ser al menos dos veces el volumen del sedimento.
- Incubar a 37 ° C durante 30 min.
Nota: Agite suavemente cada 10-15 min
- Centrifugar a 800 xg durante 1 min y retirar el tratamiento.
- Añadir el tampón de lisis
Nota: El volumen se ajusta a la de unmontaje de la pastilla y debe ser al menos dos veces el volumen del sedimento.
- Pipetear hacia arriba y hacia abajo para volver a suspender el sedimento.
Nota: Un vórtice también se puede utilizar.
- Incubar 15 minutos en hielo.
- Se centrifuga a 14.000 xg durante 15 min a 4 ° C.
- Mantenga el sobrenadante y medir la cantidad de proteína con un ensayo de Bradford 9.
- Añadir 6x Laemmli buffer.
- Incubar a 95 ° C durante 5 minutos para desnaturalizar el contenido de proteína.
Nota: Las muestras se pueden utilizar inmediatamente o se pueden almacenar a -80 ° C.
- Evaluar los efectos del tratamiento mediante Western blot 10.
Nota: Por lo menos 50 g de proteínas totales deben cargarse para cada carril.
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Representative Results
Commissural tejidos fueron tratados por el CM FP y las muestras se procesaron para el análisis de los niveles del receptor en Western blot. Aplicación de la cm FP ha demostrado aumentar los niveles de un receptor de orientación, PlexinA1, que media en la sensibilidad de los axones comisurales para el repelente Semaphorin3B después de cruzar la línea media (Figura 2). Esto reveló que las señales dadas a conocer por la FP regular los niveles PlexinA1 4,6.
Figura 1. Esquemas del procedimiento de disección para aislar la placa de piso. Se ilustran los diferentes pasos de la disección y el procedimiento de cultivo. 1) cortar la cabeza del embrión; 2-3) quitar la piel, y 4) abra las meninges; 5-6) eliminar la médula espinal del embrión; 7) quitar los hombresingestión; 8-9) diseccionan la placa del suelo; 10) añadir la trombina a la mezcla FP-plasma y espere de 10 a 15 minutos a temperatura ambiente antes de añadir el medio de cultivo. 11-12) diseccionar las neuronas dorsales; 13) dilacerate el tejido. A: polo anterior del embrión. P: polo posterior del embrión. Las flechas muestran la dirección del movimiento. Haga clic aquí para ver más grande la figura .
Figura 2. Resultado Representante. A) tejido de la médula dorsal se recogieron, dilacerada y estimulado con el medio condicionado de placa de piso y medio de control. Las muestras se lisaron y se procesaron para transferencia de Western. Las proteínas se sondaron con anticuerpos anti-PlexinA1, y β-actina. El poto ilustra el aumento de los niveles de PlexinA1 en la muestra estimulada con el suelo-placa de medio acondicionado. B) La transferencia de puntos muestra la expresión de GDNF en FP cm en comparación con el mismo de medio de control.
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Discussion
La producción de suelo-placa de medio acondicionado proporciona una manera fácil y eficiente para la evaluación de las propiedades biológicas de las señales liberadas placa planta.
La matriz-trombina de plasma ofrece excelentes condiciones para la supervivencia del tejido. Sin embargo, este ambiente enriquecido podría ser una limitación para algunos tipos de experimentos. Por lo tanto, el tejido placa de suelo también se puede cultivar en la matriz de agarosa. La calidad del medio de placa de piso acondicionado puede ser evaluada por la detección de señales conocidos liberados suelo de placa, tales como el GDNF (Figura 2), de Shh y Netrina 11. Su presencia en el medio acondicionado puede ser evaluada por Western blot o dot blot.
En este procedimiento las células se estudian en su microambiente nativo. Esto evita más información sobre el tipo de células en el tejido que reaccionan al tratamiento. Como la placa de piso no es una estructura homogénea, la concentración de la Leycomponentes inco como Wnts pueden ser diferentes entre las culturas dependiendo de la zona disecada lo largo del eje rostro-caudal.
Bioquímica en el tejido dilacerada fresca tiene la ventaja de estudiar las células en su microambiente nativo. Por lo tanto, los comportamientos celulares se investigan en condiciones que recapitular lo más cerca posible de su contexto nativo 12. El dorsal de la médula espinal no contiene sólo las neuronas comisurales por lo que los efectos de la FP cm también se pueden evaluar en las neuronas comisurales cultivadas.
El medio se puede aplicar a diversos tipos de cultivos de células y tejidos. Una amplia gama de parámetros puede ser evaluada, de identidad de la célula, la supervivencia celular, la muerte celular, y la diferenciación celular. Las muestras pueden ser procesadas para la proteómica.
Un parámetro importante de la preparación del tejido fresco dilacerada es el reparto del tejido para el control y los tratamientos experimentales. Se trata de la importaciónhormiga para recoger los tejidos primero en un solo tubo y para dilacerate el tejido colectivamente antes de separar las muestras. Esto limita la diferencia de la concentración de proteína detectada después de la lisis entre las muestras.
Tenga en cuenta que HBSS-glucosa se puede almacenar a 4 ° C durante hasta un mes. Neurobasal también se puede mantener durante un mes a 4 ° C. B27 alícuotas pueden ser almacenadas a -20 ° C para el largo plazo y a 4 ° C durante un máximo de una semana. Alícuotas de plasma deben ser almacenar a -20 ° C y se puede volver a congelar después de su uso. Alícuotas La trombina también se pueden almacenar a -20 ° C y no se pueden volver a congelar.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar
Acknowledgments
Agradecemos a Karine Kindbeiter, Muriel Bozon y Florie Reynaud por su ayuda. El trabajo es apoyado por el CNRS, el programa ANR YODA y Labex DevWeCan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Reagents Required | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PBS | Invitrogen | 14190-094 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| HBSS, Ca2+/Mg2+- free | Invitrogen | 14170-088 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Glucose | Sigma | G-7021 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Neurobasal | Invitrogen | 21103-049 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Plasma | Sigma | P-3266 | 1 mg/ml (Reconstitute in H2O and filtrate) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Thrombin | Sigma | T-4648 | 10 mg/ml(Reconstitute in H2O and filtrate) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | 50x | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| HEPES (260 g/mol) | Sigma | H-7006 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| EDTA | Sigma | E-5513 | 0.5 M, pH 8 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| MgCl2 | Euromedex | 2189 | 1M | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Glycerol | VWR | 24388.295 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| IGEPAL | Sigma | I-3021 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04 693 116 001 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Sigma | S-6508 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Distilled H2O | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Table 1.Reagents required. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Tools and Materials | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14002-12 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Dumont #5 Fine Tips forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Microknives | Fine Science Tools | 10136-14 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Table 2. Tools and materials. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
References
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