Summary
底板是脊髓发育，以祖扩散提供信号和分化的神经元的重要结构。我们描述了一种方法，以产生地面板材的条件培养基，将它应用到新鲜脊髓组织，并通过生化，以评估所关注的蛋白质的后果。
Abstract
在开发过程中，祖细胞和有丝分裂后神经元的调节自己的命运毗邻地区接收信号。地板板是一组神经胶质细胞衬里的室管膜运河在腹位置。地板板表示键形态发生素促进细胞谱系的脊髓中的图案形成。发育后期，地板板调节轴突在脊髓导航，作为一个屏障，以防止患侧轴突和控制中线交叉的道口通过合轴突1。这些功能是通过各种指导线索的分泌来实现。其中一些线索作为引诱和驱避剂的轴突生长，而其他规范指导受体和下游信号的轴突的灵敏度调节到当地指导线索2,3。这里我们描述了一种方法，它允许调查的地板板衍生的信号中的各种德韦的属性lopmental上下文的基础上，生产地板板条件培养基（FP 厘米）4-6。然后，我们举例说明在轴突导向的情况下使用这种FP 厘米 。首先，脊髓从小鼠胚胎中分离在E12.5和地板板被解剖出来并培养在血浆凝血酶基质（ 图1）。第二，两天后，连合组织是从E12.5胚胎解剖出来，研碎并暴露在FP 厘米 。三，组织处理对连合标记Western blot分析。
Introduction
地板板是脊髓发育的一个众所周知的构图中心，祖细胞和有丝分裂后细胞谱系的规范扮演关键角色，并控制轴突导航7,8。这里描述生产的FP 厘米的实验程序允许调查评估底板源性信号在发育过程中的各种情况下的功能特性，从 细胞图案和存活细胞及轴突迁移。
为了说明使用这样的FP 厘米 ，含有合神经元背侧脊髓组织被解剖，dilacerated和与FP 厘米刺激。组织然后可以处理用于Western印迹分析。这使得调查轴突导向机械按楼层板信号发布规定。治疗dilacerated新鲜组织中的保存方法保存细胞内日微环境的巨大优势Ë组织。因此，通过FP 厘米治疗或任何类型的治疗的后果被评估的多个生理方式比在细胞和组织培养条件。
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Protocol
第1天
1。从E12.5小鼠胚胎脊髓地板板（FP）的解剖
注意：整个程序需要使用的无菌条件。最好是根据解剖罩进行解剖，以避免污染。机罩的表面应该用乙醇进行清洗。所有清扫工具必须消毒，并保持在无菌培养皿中。的液体（介质，夹层介质）必须保持封闭并置于冰浴中。每个胚胎必须被收集在单独的新鲜降。这对于组织保存重要。解剖与杜蒙＃5镊子进行。要传输的菜肴，握脐带或头部不至后脑的任何损害之间的胚胎。这一点非常重要，不要损坏脊髓顺利完成清扫。制备冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，冰冷Hank平衡盐溶液（HBSS） -6.5％的葡萄糖和室温Neurobasal培养基。
1.1脊髓解剖
动物是根据中心法国国家科学研究的以下欧洲指令动物保健指导治疗。安乐死的方法是颈椎脱位，它包括将压力施加到颈脱臼和从脑中的脊柱。被推荐用于小鼠动物模型中这种方法，并且可以在一个快速和有效的方式来进行。
- 安乐死怀孕小鼠在妊娠期（E0.5 =第一天以下的消光）的E12.5。将鼠标腹侧。
- 浸泡腹部用70％乙醇。捏用阿德森镊子腹部的皮肤和切断通过皮肤和腹膜层用手术剪。做一个切口，并用它来切断对小鼠的两侧，以暴露腹腔。
- 一个字符串，胚胎的存在于鼠标的每一侧。抓住UTE的一角RUS在两个胚胎，并剖析它从外观开始部分之间的组织。完整子宫转移到冰100毫米培养皿用冷PBS。
- 提取胚外组织的胚胎。掌握胎盘组织（暗红色）与两对镊子和轻轻拉扯撕裂组织，并从子宫囊取出胚胎。
注：为了更好的保护，收集他们的子宫囊逐个胚胎。
- 接下来的步骤是根据双目放大镜和解剖罩完成。将一个胚胎在下拉冷的HBSS-6.5％的葡萄糖。
- 使用镊子，杀头的胚胎。
注：切下颌和后脑之间，后脑的后部是下一个重要的步骤。
- 将胚胎腹面朝下面向实验者的前部。
- 捏皮肤用一对镊子，并与另一对胚胎的抽离皮肤。
注意：该步骤必须重复，直到皮肤完全从胚胎的前部移除。
- 把胚胎前侧到左侧。在的前部有一个镊子“牵制”胚胎。与其他钳子抓住皮肤和拉向胚胎的喙侧。脊髓是再访问。
- 使用镊子的一侧切割仍然包裹脊髓脊膜。脊髓现已开放。
- 把胚胎前侧到右边。
- 从脊髓从胚胎的颈椎侧开始拆下组织。滑动脊髓（镊子应保持关闭，以避免脊髓损伤）下的镊子。镊子必须脊髓下可见。脊髓小下旋转动作都足以分离周围组织和背根神经节（DRG）。
注意：如果保持附着周围组织添加重量至脊髓，从而增加了在下一步骤打破它的概率。
- 将分离的脊髓冷的HBSS-6.5％葡萄糖的新鲜滴。
- 将脊髓在平坦的位置，在顶部和前侧离实验者脑膜。
- “牵制”使用剩余的后脑与一个钳脊髓，并与第2钳子抓住脑膜。撕下脊髓延髓身边做起脑膜。
注意：该运动应该是缓慢和恒定，以避免对脊髓的任何断裂。振动运动可以促进脑膜支队。
1.2 FP解剖
- 掐后脑有一个镊子。
- 该FP是中央TRA组织的nsparent一部分。用手术刀切出的底板。
注意：要切断两侧具有相同的质量，从嘴侧端开始，并交替地切右侧和所述底板的左侧。
- 保育解剖FP的Neurobasal培养基中于室温下进行。
2。 FP文化
注意：应在无菌条件下在组织培养罩中执行的所有步骤。用新鲜培养基和刚解冻的补充和试剂。制备无菌的玻璃盖玻片上，温暖的Neurobasal + B27，血浆和HBSS-凝血酶。
2.1 FP文化
- 将几个无菌盖玻片在一个100毫米的培养皿并在每个盖玻片的中心移液管20微升血浆。
- 转让两到四个FP在每个等离子下降，并添加20微升的HBSS凝血酶旁边的血浆滴，仔细混匀。保持盖玻片最少10分钟在室温下，使血浆凝固。
注：将两个心室肌的情况下，在部分情况下，夹层的完整解剖和更多。用枪头混匀缓慢，避免与计划生育外植体接触。
血浆凝块回缩几微米的凝结的迹象。凝固不能过早地停止，以避免血浆凝块脱落。
- 将每个盖玻片的24孔板中，加入500μl的Neurobasal + B27的。孵育48小时，在37°C
第3天
3。 FP条件培养基（FP 厘米 ）收获
注：收获应在无菌条件下在组织培养橱中进行。如果上清液中的文化近郊污染或者如果楼板是浮动的（这意味着他们可能已经死了OD），那么不从这个收获的FP 厘米很好。
3.1 FP 厘米收获
- 从每口井仔细收获的媒介。
注意：不要吸取聚合血浆凝血酶混合或任何FP片段。
- 存储100μL分装于-80°C。
第四天
4。脊髓合神经元从E12.5小鼠胚胎解剖
注意：该制剂不需要在无菌条件下将被执行。请遵循上述收集胚胎的过程。准备冷PBS，冷的HBSS-6.5％葡萄糖和寒冷的neurobasal。
4.1脊髓解剖
- 使用镊子，杀头的胚胎。
注意：切下钳口和后脑之间，后脑的后部是重要接下来的步骤。
- 将胚胎腹面朝下在一个新的下降与面临的实验者的前部。
- 捏胚胎的皮肤有一个镊子，并与另一个绝尘而去的皮肤。
注意：该步骤必须重复，直到皮肤完全从胚胎的前部移除。
- 把胚胎前侧到左侧。在的前部有一个镊子“牵制”胚胎。与其他镊子，把握皮肤和拉向胚胎的喙侧，以暴露脊髓。
- 使用镊子的一侧切割仍然包裹脊髓脊膜。脊髓现在已经公开和开放。
- 胚胎前侧姿势要正确。
- 从脊髓从胚胎的颈椎侧开始拆下组织。滑动脊髓（保持钳闭）下的镊子。为CEPS必须脊髓下可见。脊髓小下旋转动作都足以取下邻近组织和背根神经节（DRG）。
- 在冷的HBSS，6.5％葡萄糖的新降转孤立脊髓。
- 将脊髓在平坦的位置，在顶部和前侧离实验者脑膜。
- “牵制”利用剩余的后脑有一个镊子脊髓，与第二钳抓住脑膜。撕下脊髓延髓身边做起脑膜。
4.2连合神经解剖
- 掐后脑有一个镊子。
- 在连合神经元位于脊髓（背侧）的最外侧部分。切出这部分外侧用细手术刀。
注意：在脊髓的背侧部分可以从腹侧部分由单元d的差异区分密度，腹侧部分更加不透明。
注意：要切断两侧具有相同的质量，从嘴侧端开始，并交替地切一小长度的左侧的右侧和。
- 节约冰上立即使用的Neurobasal培养基的解剖组织。
5。连合组织与计划生育厘米治疗
注意：此过程不要求无菌条件。该组织必须被收集在各个1.5毫升管。冰冻FP 厘米应该只能使用一次。避免多次重新冻结。准备温暖的FP 厘米 （37℃）。
5.1治疗方法连合神经元
- Dilacerate连合组织用小剪刀。
注意：切组织尽可能地小，以使可能的单元的可访问性。
- 公平地分配不同的实验条件的控制处理和FP 厘米治疗之间的组织。
- 离心分离的组织片段，在800×g离心1分钟，在4℃下
- 检查管之间的再分配。
注意：如果需要，摇匀，离心，直到再次片段均匀分布。
- 除去上清液。
- 添加温暖的FP 厘米和控制处理的组织。
注意：音量必须调整到颗粒的量，并应至少两倍的颗粒的体积。
- 在37°C为30分钟。
注：轻轻摇动每次10-15分钟
- 离心机在800×g离心1分钟，取出处理。
- 加入裂解缓冲液
注意：该卷必须被调整到一个粒料的安装和应至少两倍的颗粒的体积。
- 吸管上下悬浮颗粒。
注意：一个涡流也可以使用。
- 在冰上孵育15分钟。
- 离心机以14,000×g离心15分钟，在4℃下
- 保留上清液，并测量用Bradford测定法9的蛋白质的量。
- 添加6X Laemmli缓冲液。
- 孵育在95℃下5分钟以变性蛋白含量。
注意：样品可以立即使用，或者可以保存在-80℃。
- 评估通过Western印迹10的治疗效果。
注：至少50总蛋白的微克应该为每个车道被加载。
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Representative Results
连合组织是由FP 厘米处理和对样品进行处理以供在Western印迹受体水平的分析。结果表明，增加的指导受体，PlexinA1，该交叉（ 图2），后介导合轴突的中线斥Semaphorin3B灵敏度水平的FP 厘米的应用。这表明，由FP释放信号调节PlexinA1水平4,6。
图1。解剖过程隔离底板的计划。被说明的不同步骤的解剖和文化过程。 1）切断胚胎头; 2-3）去除角质; 4）打开脑膜; 5-6）移除胚胎脊髓; 7）去除人inges; 8-9）解剖出了底板; 10）加凝血酶与FP-血浆混合，并等待10至15分钟，在室温下加入培养基中之前。 11-12）剖析了背神经元; 13）dilacerate组织。答：胚胎的前极。病人：胚胎后极部。箭头描绘运动的方向。 点击这里查看大图 。
图2。代表性的结果。 A）背脊髓组织收集，dilacerated并与底板条件培养基和对照培养基刺激。对样品进行裂解和处理用于Western印迹。蛋白用探针的抗体抗PlexinA1，和β-肌动蛋白。在pHOTO示PlexinA1水平的刺激与地板板条件培养基B）的点印迹显示了在FP GDNF的表达厘米相比，它的对照培养基样品中的增加。
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Discussion
地板板条件培养基的生产提供了一种有效，简便的方法，以评估底板释放信号的生物学特性。
血浆凝血酶矩阵提供了极好的条件，组织的生存。然而，这种丰富的环境可能对于某些类型的实验的限制。因此，底板的组织，也可以培养在琼脂糖基质。底板的条件培养基的质量可以通过已知的地板板释放信号，如GDNF（ 图2），Shh和netrin诱导11的检测来评估。其在条件培养基中的存在可以通过蛋白质印迹或斑点印迹法进行评估。
在此过程中的细胞进行了研究以其天然的微环境。这可以防止在细胞中该反应以治疗所述组织的类型的进一步信息。由于底板是不是一个均匀的结构，行为的浓度香港专业教育学院的组件如Wnts可能取决于沿rostro，尾椎轴的解剖区域文化之间的不同。
生物化学新鲜dilacerated组织保持优势，以研究细胞在家乡的微环境。因此，细胞的行为进行调查的，作为密切概括尽可能他们的母语语境12的条件。脊髓背侧不包含只合神经元使FP 厘米的效果，也可以在培养合神经元进行评估。
该介质可以被应用于各种类型的细胞和组织培养物。一个大范围的参数进行评估，从小区标识，细胞存活，细胞死亡和细胞分化。样品可以加工用于蛋白质组学。
该dilacerated新鲜组织编制的一个重要参数是组织的控制和试验性治疗的重新分配。它是进口蚂蚁到第一收集组织在一个单一的管，并dilacerate组织来分离样品统称之前。这就限制了样品之间的裂解之后检测蛋白浓度的差异。
注意，HBSS-葡萄糖可以被存储在4℃最多一个月。的Neurobasal也可以保持一个月，在4℃下B27的等分试样可被储存在-20℃下长期并在4℃下最多一周。血浆等分应储存在-20°C和在使用后可再次冷冻。凝血酶等分，也可以存储在-20℃下，不能再冷冻。
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Disclosures
作者没有透露
Acknowledgments
我们感谢卡琳Kindbeiter，穆里尔Bozon和FLORIE雷诺的帮助。这项工作是由法国国家科学研究中心，ANR YODA程序和Labex DevWeCan支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Reagents Required | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PBS | Invitrogen | 14190-094 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| HBSS, Ca2+/Mg2+- free | Invitrogen | 14170-088 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Glucose | Sigma | G-7021 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Neurobasal | Invitrogen | 21103-049 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Plasma | Sigma | P-3266 | 1 mg/ml (Reconstitute in H2O and filtrate) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Thrombin | Sigma | T-4648 | 10 mg/ml(Reconstitute in H2O and filtrate) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | 50x | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| HEPES (260 g/mol) | Sigma | H-7006 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| EDTA | Sigma | E-5513 | 0.5 M, pH 8 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| MgCl2 | Euromedex | 2189 | 1M | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Glycerol | VWR | 24388.295 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| IGEPAL | Sigma | I-3021 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04 693 116 001 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Sigma | S-6508 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Distilled H2O | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Table 1.Reagents required. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Tools and Materials | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14002-12 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Dumont #5 Fine Tips forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Microknives | Fine Science Tools | 10136-14 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Table 2. Tools and materials. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
References
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