Summary

תרבות של רקמות מבודדות פלייט מקיר לקיר וייצור בינוני אוויר כדי להעריך את התכונות פונקציונליות של איתותים שפורסם פלייט מקיר לקיר

Published: February 11, 2014
doi:

Summary

צלחת הרצפה היא מבנה חיוני של תאי העצב מתפתח בעמוד השדרה, ומספקים אותות diffusible לאבות ומבדל. אנו מתארים שיטה להפקה בינונית מותנים בקומת צלחת, כדי להחיל אותו על רקמת חוט השדרה טרי, ועל מנת להעריך את ההשלכות על חלבונים של עניין על ידי ביוכימיה.

Abstract

במהלך פיתוח, אבות ונוירונים לאחר mitotic לקבל אותות משטחים סמוכים המסדירים את גורלם. רצפת הצלחת היא קבוצה של תאים המצפה את תעלת גליה ependymal בעמדת הגחון. רצפת הצלחת מבטאת morphogens מפתח תורם לדפוסים של שושלות תאים בחוט השדרה. בשלבי התפתחותיים מאוחרים יותר, בקומת הצלחת מסדירה את הניווט של אקסונים בחוט השדרה, הפועל כמחסום כדי למנוע את מעבר של אקסונים ipsilateral וחציית קו האמצע שליטה על ידי אקסונים commissural 1. פונקציות אלה מושגות באמצעות הפרשת אותות הנחיה שונות. חלק מרמזים אלה לפעול כמשיכה ודוחים לאקסונים גדל בעוד שאחרים להסדיר קולטנים הדרכה ואיתות במורד הזרם כדי לווסת את הרגישות של האקסונים לאותות הנחיה המקומיים 2,3. כאן אנו מתארים שיטה המאפשרת לחקור את תכונותיהם של אותות הנגזרים מהרצפה צלחת במגוון deveהקשרי lopmental, המבוססים על הייצור של מדיום לקיר-פלייט מותנה (סנטימטר FP) 4-6. לאחר מכן, אנו מדגימים את השימוש בסנטימטר FP זה בהקשר של הדרכה האקסון. ראשית, בחוט השדרה מבודד מעובר של העכבר בE12.5 ורצפת הצלחת גזור החוצה וטיפחה במטריצת הפלזמה תרומבין (איור 1). שני ימים שני לאחר מכן, רקמות commissural הם גזורים החוצה מעוברי E12.5, triturated ונחשפו לסנטימטר FP. שלישית, הרקמה מעובדות לניתוח כתם מערבי של סמני commissural.

Introduction

רצפת הצלחת היא מרכז דפוסים ידוע של חוט השדרה המתפתח, ממלא תפקידי מפתח במפרט של אבות ושושלות תאי postmitotic ושליטה ניווט האקסון 7,8. הליך הניסוי שתואר כאן כדי לייצר סנטימטר FP מאפשר לחוקרים להעריך את המאפיינים הפונקציונליים של אותות המופק מצלחת רצפה בהקשרים שונים של תהליכים התפתחותיים, מדפוסי תא והישרדות לתא וההגירה האקסון.

כדי להדגים את השימוש בסנטימטר FP כגון, רקמות חוט השדרה הגבי מכילות נוירונים commissural הם גזורים, dilacerated ומגורה עם סנטימטר FP. הרקמות אז יכולות להיות מעובד לניתוח כתם מערבי. זה מאפשר לחקור את התקנות של מכונות האקסון הדרכה על ידי אותות שוחררו מהרצפה צלחת. שיטת הטיפול של רקמה טרי dilacerated מחזיקה את היתרון הגדול של שימור microenvironment של תאים בתוך הדואר רקמות. לכן ההשלכות של הטיפול על ידי סנטימטר FP או כל סוגים של טיפול מוערכים באופן פיסיולוגי יותר מאשר בתא ותנאים בתרבית רקמה.

Protocol

יום 1 1. Dissection של פלייט בחוט השדרה מקיר לקיר (FP) מE12.5 עוברי עכברים הערה: כל ההליך מחייב השימוש בתנאים סטריליים. עדיף לבצע את הנתיחה מתחת למכסת מנוע לנתיחה, כדי למנוע זיהום. פני השטח של מכסה ?…

Representative Results

טופלו רקמות Commissural ידי סנטימטר FP והדגימות עובדו לניתוח של רמות הקולטן בכתם מערבי. יישום של סנטימטר FP הוצג כדי להגדיל את הרמות של הקולטן הדרכה, PlexinA1, אשר מתווך את הרגישות של האקסונים commissural לSemaphorin3B דוחה קו האמצע לאחר החצייה (איור 2). זה גילה כי אותות ?…

Discussion

הייצור של מדיום מותנה בקומת צלחת מספק דרך יעילה וקלה להערכת המאפיינים הביולוגיים של אותות שוחררו צלחת רצפה.

מטריקס הפלזמה תרומבין מספק מצב מצוין להישרדות רקמות. עם זאת, סביבה מועשרת זה עשויה להיות מגבלה עבור סוגים מסוימים של ניס?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לקרין Kindbeiter, מיוריאל Bozon, ופלורי ריינו לעזרתם. העבודה נתמכת על ידי CNRS, תכנית ANR יודה וLabex DevWeCan.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
REAGENTS REQUIRED
PBS Invitrogen 14190-094
HBSS, Ca2+/Mg2+– free Invitrogen 14170-088
Glucose Sigma G-7021
Neurobasal Invitrogen 21103-049
Plasma Sigma P-3266 1mg/ml (Reconstitute in H2O and filtrate)
Thrombin Sigma T-4648 10mg/ml(Reconstitute in H2O and filtrate)
B27 Invitrogen 17504-044 50X
Hepes (260g/mol) Sigma H-7006
EDTA Sigma E-5513 0,5M pH8
MgCL2 Euromedex 2189 1M
Glycerol VWR 24388.295
IGEPAL Sigma I-3021
Complete Protease inhibitor Cocktail Tablets Roche 04 693 116 001
Sodium Orthovanadate (Na3VO4) Sigma S-6508
distilled H2O
Table 1. Reagents required
TOOLS AND MATERIAL
Surgical scissors Fine Science Tools 14002-12
Adson forceps Fine Science Tools 11027-12
Dumont #5 Fine Tips forceps Fine Science Tools 11254-20
micro knives Fine Science Tools 10136-14
Table 2. Tools and material
Dissection and FP culture
Ethanol 70%
dissection hood
dissection microscope
Petri dishes
glass coverslips 18mm x 18mm
Bunsen gas burner
24 well plate
tissue culture incubator (37°C, 5% CO2, humidity controlled)
Centrifuge
RECIPES
FP culture media
Neurobasal
B27 1/50e dilution from stock
HBSS – Thrombin
HBSS 1 ml
Thrombin 10mg/ml 30 μl
Lysis Buffer pH7,4
Hepes (260 g/mol) 25mM
EDTA (pH8) 5mM
MgCL2 1mM
Glycerol 10%
IGEPAL (NP40) 0.10%
Protease Inhibitor Cocktail 1X
Sodium Orthovanadate 0,2M
H2O
Laemmli Buffer
Tris 0,5M, pH 6,8 375 mM
SDS 6%
Glycerol 60%
DTT 0,6M
Bromophenol blue
H2O

References

  1. Nawabi, H., Castellani, V. Axonal commissures in the central nervous system: how to cross the midline. Cell. Mol. Life Sci. 68, 2539-2553 (2011).
  2. Placzek, M., Briscoe, J. The floor plate: multiple cells, multiple signals. Nat. Rev. Neurosci. 6, 230-240 (2005).
  3. Chedotal, A. Further tales of the midline. Curr. Opin. Neurobiol. 21, 68-75 (1016).
  4. Nawabi, H., et al. A midline switch of receptor processing regulates commissural axon guidance in vertebrates. Genes Dev. 24, 396-410 (2010).
  5. Ruiz de Almodovar, C., et al. VEGF mediates commissural axon chemoattraction through its receptor Flk1. Neuron. 70, 966-978 (2011).
  6. Charoy, C., et al. gdnf activates midline repulsion by Semaphorin3B via NCAM during commissural axon guidance. Neuron. 75, 1051-1066 (2012).
  7. Kiecker, C., Lumsden, A. The role of organizers in patterning the nervous system. Annu. Rev. Neurosci. 35, 347-367 (2012).
  8. Le Dreau, G., Marti, E. Dorsal-ventral patterning of the neural tube: a tale of three signals. Dev. Neurobiol. 72, 1471-1481 (2012).
  9. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  10. Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. J. Vis. Exp. , (2010).
  11. Salinas, P. C. The morphogen sonic hedgehog collaborates with netrin-1 to guide axons in the spinal cord. Trends Neurosci. 26, 641-643 (2003).
  12. Bechara, A., et al. FAK-MAPK-dependent adhesion disassembly downstream of L1 contributes to semaphorin3A-induced collapse. EMBO J. 27, 1549-1562 (2008).

Play Video

Cite This Article
Charoy, C., Arbeille, E., Thoinet, K., Castellani, V. Culture of Isolated Floor Plate Tissue and Production of Conditioned Medium to Assess Functional Properties of Floor Plate-released Signals. J. Vis. Exp. (84), e50884, doi:10.3791/50884 (2014).

View Video