मंजिल थाली में जारी सिग्नल के कार्यात्मक संपत्तियों का आकलन करने के लिए वातानुकूलित माध्यम से पृथक मंजिल थाली ऊतक और उत्पादन की संस्कृति

Summary

मंजिल की थाली, रीढ़ की हड्डी के विकास progenitors के लिए प्रसारण संकेतों प्रदान करने और फर्क न्यूरॉन्स की एक महत्वपूर्ण संरचना है. हम मंजिल प्लेट वातानुकूलित माध्यम के उत्पादन के लिए नए सिरे से रीढ़ की हड्डी के ऊतकों को लागू करने, और जैव रसायन से ब्याज की प्रोटीन पर परिणामों का आकलन करने के लिए एक विधि का वर्णन.

Abstract

विकास के दौरान, progenitors और बाद mitotic न्यूरॉन्स उनके भाग्य को नियंत्रित करने वाले सटे प्रदेशों से संकेत प्राप्त करते हैं. मंजिल प्लेट उदर स्थिति में ependymal नहर अस्तर glial कोशिकाओं का एक समूह है. मंजिल प्लेट रीढ़ की हड्डी में सेल प्रजातियों के patterning के लिए योगदान कुंजी morphogens व्यक्त करता है. बाद में विकास के चरणों में, मंजिल प्लेट जोड़ संबंधी axons ¹ से ipsilateral axons और नियंत्रित midline क्रासिंग को पार करने से रोकने के लिए एक बाधा के रूप में अभिनय, रीढ़ की हड्डी में axons की नेविगेशन नियंत्रित करता है. इन कार्यों के विभिन्न मार्गदर्शन cues के स्राव के माध्यम से प्राप्त कर रहे हैं. दूसरों स्थानीय मार्गदर्शन cues ^2,3 करने axons की संवेदनशीलता को व्यवस्थित करना मार्गदर्शन रिसेप्टर्स और बहाव के संकेत विनियमित जबकि इन संकेतों के कुछ बढ़ते axons के लिए attractants और भगाने के रूप में कार्य. यहाँ हम विकास के उद्देश्यों की एक किस्म में फर्श प्लेट निकाली गई संकेतों की संपत्तियों की जांच की अनुमति देता है कि एक विधि का वर्णनमंजिल प्लेट वातानुकूलित मध्यम (एफपी ^{सेमी) 4-6} के उत्पादन पर आधारित lopmental संदर्भों,. हम तो अक्षतंतु मार्गदर्शन के संदर्भ में इस एफपी ^सेमी का उपयोग उदाहरण देना. सबसे पहले, रीढ़ की हड्डी E12.5 पर माउस भ्रूण से अलग है और मंजिल की थाली बाहर विच्छेदित और एक प्लाज्मा थ्रोम्बिन मैट्रिक्स (चित्रा 1) में खेती की जाती है. दूसरा दो दिन बाद, जोड़ संबंधी ऊतक, E12.5 भ्रूण से बाहर विच्छेदित triturated और एफपी ^सेमी के संपर्क में हैं. तीसरा, ऊतक जोड़ संबंधी मार्करों के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए कार्रवाई कर रहे हैं.

Introduction

मंजिल प्लेट progenitors और postmitotic सेल प्रजातियों के विनिर्देशन में महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा है और अक्षतंतु नेविगेशन ^7,8 को नियंत्रित करने, विकासशील रीढ़ की हड्डी के एक प्रसिद्ध patterning केंद्र है. एफपी ^सेमी का उत्पादन करने के लिए यहाँ वर्णित प्रयोगात्मक प्रक्रिया जांचकर्ताओं सेल patterning और अस्तित्व से सेल और अक्षतंतु प्रवास करने के लिए, विकास की प्रक्रिया का एक विभिन्न संदर्भों में मंजिल थाली व्युत्पन्न संकेतों के कार्यात्मक संपत्तियों का आकलन करने के लिए अनुमति देता है.

ऐसे एफपी ^सेमी का उपयोग का वर्णन करने के लिए, जोड़ संबंधी न्यूरॉन्स युक्त पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी के ऊतकों, विच्छेदित dilacerated और एफपी ^{मुख्यमंत्री के} साथ प्रेरित कर रहे हैं. ऊतकों तो पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए कार्रवाई की जा सकती. इस मंजिल प्लेट जारी किया संकेतों से अक्षतंतु मार्गदर्शन मशीनरी के नियमों की जांच की अनुमति देता है. dilacerated ताजा ऊतक के उपचार की विधि वें भीतर कोशिकाओं के microenvironment के संरक्षण के महान लाभ रखती हैई ऊतक. इस प्रकार एफपी ^सेमी द्वारा इलाज या उपचार के किसी भी प्रकार के परिणामों सेल और टिशू कल्चर शर्तों में से एक अधिक शारीरिक तरह से मूल्यांकन कर रहे हैं.

Protocol

DAY 1 1. E12.5 माउस भ्रूण से रीढ़ की हड्डी मंजिल थाली (एफपी) के विच्छेदन नोट: इस पूरी प्रक्रिया में बाँझ शर्तों के उपयोग की आवश्यकता है. यह संक्रमण से बचने के लिए एक विच्छेदन हुड के नीचे …

Representative Results

जोड़ संबंधी ऊतकों एफपी सेमी द्वारा इलाज किया गया और नमूने पश्चिमी धब्बा में रिसेप्टर के स्तर के विश्लेषण के लिए प्रोसेस किया गया. एफपी सेमी का आवेदन (चित्रा 2) पार करने के बाद midline विकर्षक Sema…

Discussion

मंजिल प्लेट वातानुकूलित माध्यम से उत्पादन मंजिल प्लेट जारी किया संकेतों के जैविक गुणों का आकलन करने के लिए एक कुशल और आसान तरीका प्रदान करता है.

प्लाज्मा थ्रोम्बिन मैट्रिक्स ऊतक अस्तित्व ?…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTS REQUIRED
PBS	Invitrogen	14190-094
HBSS, Ca2+/Mg2+– free	Invitrogen	14170-088
Glucose	Sigma	G-7021
Neurobasal	Invitrogen	21103-049
Plasma	Sigma	P-3266	1mg/ml (Reconstitute in H2O and filtrate)
Thrombin	Sigma	T-4648	10mg/ml(Reconstitute in H2O and filtrate)
B27	Invitrogen	17504-044	50X
Hepes (260g/mol)	Sigma	H-7006
EDTA	Sigma	E-5513	0,5M pH8
MgCL2	Euromedex	2189	1M
Glycerol	VWR	24388.295
IGEPAL	Sigma	I-3021
Complete Protease inhibitor Cocktail Tablets	Roche	04 693 116 001
Sodium Orthovanadate (Na3VO4)	Sigma	S-6508
distilled H2O
			Table 1. Reagents required
			TOOLS AND MATERIAL
Surgical scissors	Fine Science Tools	14002-12
Adson forceps	Fine Science Tools	11027-12
Dumont #5 Fine Tips forceps	Fine Science Tools	11254-20
micro knives	Fine Science Tools	10136-14
			Table 2. Tools and material
			Dissection and FP culture Ethanol 70% dissection hood dissection microscope Petri dishes glass coverslips 18mm x 18mm Bunsen gas burner 24 well plate tissue culture incubator (37°C, 5% CO2, humidity controlled) Centrifuge RECIPES FP culture media Neurobasal B27 1/50e dilution from stock HBSS – Thrombin HBSS 1 ml Thrombin 10mg/ml 30 μl Lysis Buffer pH7,4 Hepes (260 g/mol) 25mM EDTA (pH8) 5mM MgCL2 1mM Glycerol 10% IGEPAL (NP40) 0.10% Protease Inhibitor Cocktail 1X Sodium Orthovanadate 0,2M H2O Laemmli Buffer Tris 0,5M, pH 6,8 375 mM SDS 6% Glycerol 60% DTT 0,6M Bromophenol blue H2O