底板是脊髓发育,以祖扩散提供信号和分化的神经元的重要结构。我们描述了一种方法,以产生地面板材的条件培养基,将它应用到新鲜脊髓组织,并通过生化,以评估所关注的蛋白质的后果。
在开发过程中,祖细胞和有丝分裂后神经元的调节自己的命运毗邻地区接收信号。地板板是一组神经胶质细胞衬里的室管膜运河在腹位置。地板板表示键形态发生素促进细胞谱系的脊髓中的图案形成。发育后期,地板板调节轴突在脊髓导航,作为一个屏障,以防止患侧轴突和控制中线交叉的道口通过合轴突1。这些功能是通过各种指导线索的分泌来实现。其中一些线索作为引诱和驱避剂的轴突生长,而其他规范指导受体和下游信号的轴突的灵敏度调节到当地指导线索2,3。这里我们描述了一种方法,它允许调查的地板板衍生的信号中的各种德韦的属性lopmental上下文的基础上,生产地板板条件培养基(FP 厘米)4-6。然后,我们举例说明在轴突导向的情况下使用这种FP 厘米 。首先,脊髓从小鼠胚胎中分离在E12.5和地板板被解剖出来并培养在血浆凝血酶基质( 图1)。第二,两天后,连合组织是从E12.5胚胎解剖出来,研碎并暴露在FP 厘米 。三,组织处理对连合标记Western blot分析。
地板板是脊髓发育的一个众所周知的构图中心,祖细胞和有丝分裂后细胞谱系的规范扮演关键角色,并控制轴突导航7,8。这里描述生产的FP 厘米的实验程序允许调查评估底板源性信号在发育过程中的各种情况下的功能特性,从 细胞图案和存活细胞及轴突迁移。
为了说明使用这样的FP 厘米 ,含有合神经元背侧脊髓组织被解剖,dilacerated和与FP 厘米刺激。组织然后可以处理用于Western印迹分析。这使得调查轴突导向机械按楼层板信号发布规定。治疗dilacerated新鲜组织中的保存方法保存细胞内日微环境的巨大优势Ë组织。因此,通过FP 厘米治疗或任何类型的治疗的后果被评估的多个生理方式比在细胞和组织培养条件。
地板板条件培养基的生产提供了一种有效,简便的方法,以评估底板释放信号的生物学特性。
血浆凝血酶矩阵提供了极好的条件,组织的生存。然而,这种丰富的环境可能对于某些类型的实验的限制。因此,底板的组织,也可以培养在琼脂糖基质。底板的条件培养基的质量可以通过已知的地板板释放信号,如GDNF( 图2),Shh和netrin诱导11的检测来评估。?…
The authors have nothing to disclose.
我们感谢卡琳Kindbeiter,穆里尔Bozon和FLORIE雷诺的帮助。这项工作是由法国国家科学研究中心,ANR YODA程序和Labex DevWeCan支持。
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
REAGENTS REQUIRED | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
PBS | Invitrogen | 14190-094 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
HBSS, Ca2+/Mg2+– free | Invitrogen | 14170-088 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Glucose | Sigma | G-7021 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Neurobasal | Invitrogen | 21103-049 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Plasma | Sigma | P-3266 | 1mg/ml (Reconstitute in H2O and filtrate) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Thrombin | Sigma | T-4648 | 10mg/ml(Reconstitute in H2O and filtrate) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
B27 | Invitrogen | 17504-044 | 50X | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Hepes (260g/mol) | Sigma | H-7006 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
EDTA | Sigma | E-5513 | 0,5M pH8 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
MgCL2 | Euromedex | 2189 | 1M | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Glycerol | VWR | 24388.295 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
IGEPAL | Sigma | I-3021 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Complete Protease inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04 693 116 001 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Sigma | S-6508 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
distilled H2O | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table 1. Reagents required | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TOOLS AND MATERIAL | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Surgical scissors | Fine Science Tools | 14002-12 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Adson forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Dumont #5 Fine Tips forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
micro knives | Fine Science Tools | 10136-14 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table 2. Tools and material | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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