Summary

Culture de tissus isolement de la plaque au sol et la production de milieu conditionné à évaluer les propriétés fonctionnelles des signaux plancher Plate-publié

Published: February 11, 2014
doi:

Summary

Le plancher est une structure essentielle des neurones de la moelle épinière en développement, fournissant des signaux diffusibles de progéniteurs et la différenciation. Nous décrivons une méthode pour produire des varangues milieu conditionné, à appliquer au tissu de la moelle épinière frais, et d'évaluer les conséquences sur les protéines d'intérêt par la biochimie.

Abstract

Au cours du développement, les progéniteurs et les neurones post-mitotiques reçoivent des signaux de territoires adjacents qui régulent leur sort. La plaque de sol est un groupe de cellules gliales tapissant le canal épendymaire en position ventrale. La plaque de sol exprime morphogènes clés contribuant à la structuration de lignées de cellules dans la moelle épinière. À des stades de développement plus tard, la plaque de sol réglemente la navigation des axones de la moelle épinière, agissant comme une barrière pour empêcher le passage des axones homolatéraux et franchissement de la ligne médiane de contrôle par les axones commissure 1. Ces fonctions sont réalisées grâce à la sécrétion de diverses signaux de guidage. Certains de ces indices agir comme attractifs et répulsifs pour les axones en croissance tandis que d'autres réglementent les récepteurs d'orientation et de signalisation en aval de moduler la sensibilité des axones aux 2,3 signaux de guidage locales. Nous décrivons ici une méthode qui permet l'étude des propriétés des signaux provenant du sol plaque dans une variété de dévecontextes lopmental, sur la base de la production de support de plancher Plate conditionné (FP cm) 4-6. Nous illustrons ensuite l'utilisation de ce FP cm dans le cadre de guidage axonal. Tout d'abord, la moelle épinière est isolé à partir d'embryons de souris à E12.5 et de la plaque de fond est disséqué et cultivées dans une matrice plasma-thrombine (figure 1). Deuxième deux jours plus tard, le tissu commissure sont disséqués à partir d'embryons E12.5, trituré et exposé à la FP cm. Troisièmement, le tissu est traité pour analyse par Western blot de marqueurs commissure.

Introduction

La plaque de sol est un centre de formation de motif bien connu de la moelle épinière en développement, jouent un rôle clé dans la spécification des progéniteurs et les lignées de cellules post-mitotiques et contrôler la navigation des axones 7,8. La procédure expérimentale décrite ici pour produire FP cm permet aux enquêteurs d'évaluer les propriétés fonctionnelles des signaux de plaque dérivé étage dans un des contextes différents des processus de développement, de la structuration et la survie cellulaire à cellulaire et la migration des axones.

Pour illustrer l'utilisation de tels FP cm, les tissus de la moelle épinière dorsale contenant des neurones commissurales sont disséqués, dilacérées et stimulées avec du FP cm. Les tissus peuvent ensuite être traitées pour l'analyse Western blot. Cela permet d'instruction des règlements de la machine de guidage axonal par des signaux libérés plancher plat. Procédé de traitement de tissu frais dilacérées maintient le grand avantage de conserver le micro-environnement des cellules au sein de ee tissu. Ainsi, les conséquences du traitement par FP cm ou n'importe quels types de traitement sont évaluées de façon plus physiologique que dans des conditions de culture cellulaire et tissulaire.

Protocol

JOUR 1 Une. Dissection de la moelle épinière étage Plate (FP) de E12.5 embryons de souris Remarque: L'ensemble de la procédure nécessite l'utilisation de conditions stériles. Il est préférable d'effectuer la dissection sous une hotte à dissection pour éviter la contamination. La surface de la hotte doit être nettoyé avec de l'éthanol. Tous les instruments de dissection doivent être stérilisés et conservés dans une boî…

Representative Results

Commissurales tissus ont été traités par le FP cm et les échantillons ont été traités pour l'analyse des niveaux des récepteurs de Western blot. Application de la FP cm a été montré pour augmenter les niveaux d'un récepteur d'orientation, PlexinA1, qui médiatise la sensibilité des axones commissure de la ligne médiane répulsif Semaphorin3B après avoir traversé (Figure 2). Cette étude a révélé que les signaux libérés par la FP régulent les niveau…

Discussion

La production de plaque de sol milieu conditionné fournit un moyen simple et efficace pour évaluer les propriétés biologiques des signaux libérés de la plaque de sol.

La matrice de plasma-thrombine offre une excellente condition de la survie de tissu. Néanmoins, cet environnement enrichi pourrait être une limitation pour certains types d'expériences. Ainsi, le tissu de la plaque de fond peut également être cultivé dans une matrice d'agarose. La qualité de la plaque de so…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Karine Kindbeiter, Muriel Bozon, et Florie Reynaud pour leur aide. Le travail est soutenu par le CNRS, le programme ANR YODA et Labex DevWeCan.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
REAGENTS REQUIRED
PBS Invitrogen 14190-094
HBSS, Ca2+/Mg2+– free Invitrogen 14170-088
Glucose Sigma G-7021
Neurobasal Invitrogen 21103-049
Plasma Sigma P-3266 1mg/ml (Reconstitute in H2O and filtrate)
Thrombin Sigma T-4648 10mg/ml(Reconstitute in H2O and filtrate)
B27 Invitrogen 17504-044 50X
Hepes (260g/mol) Sigma H-7006
EDTA Sigma E-5513 0,5M pH8
MgCL2 Euromedex 2189 1M
Glycerol VWR 24388.295
IGEPAL Sigma I-3021
Complete Protease inhibitor Cocktail Tablets Roche 04 693 116 001
Sodium Orthovanadate (Na3VO4) Sigma S-6508
distilled H2O
Table 1. Reagents required
TOOLS AND MATERIAL
Surgical scissors Fine Science Tools 14002-12
Adson forceps Fine Science Tools 11027-12
Dumont #5 Fine Tips forceps Fine Science Tools 11254-20
micro knives Fine Science Tools 10136-14
Table 2. Tools and material
Dissection and FP culture
Ethanol 70%
dissection hood
dissection microscope
Petri dishes
glass coverslips 18mm x 18mm
Bunsen gas burner
24 well plate
tissue culture incubator (37°C, 5% CO2, humidity controlled)
Centrifuge
RECIPES
FP culture media
Neurobasal
B27 1/50e dilution from stock
HBSS – Thrombin
HBSS 1 ml
Thrombin 10mg/ml 30 μl
Lysis Buffer pH7,4
Hepes (260 g/mol) 25mM
EDTA (pH8) 5mM
MgCL2 1mM
Glycerol 10%
IGEPAL (NP40) 0.10%
Protease Inhibitor Cocktail 1X
Sodium Orthovanadate 0,2M
H2O
Laemmli Buffer
Tris 0,5M, pH 6,8 375 mM
SDS 6%
Glycerol 60%
DTT 0,6M
Bromophenol blue
H2O

References

  1. Nawabi, H., Castellani, V. Axonal commissures in the central nervous system: how to cross the midline. Cell. Mol. Life Sci. 68, 2539-2553 (2011).
  2. Placzek, M., Briscoe, J. The floor plate: multiple cells, multiple signals. Nat. Rev. Neurosci. 6, 230-240 (2005).
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  4. Nawabi, H., et al. A midline switch of receptor processing regulates commissural axon guidance in vertebrates. Genes Dev. 24, 396-410 (2010).
  5. Ruiz de Almodovar, C., et al. VEGF mediates commissural axon chemoattraction through its receptor Flk1. Neuron. 70, 966-978 (2011).
  6. Charoy, C., et al. gdnf activates midline repulsion by Semaphorin3B via NCAM during commissural axon guidance. Neuron. 75, 1051-1066 (2012).
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Cite This Article
Charoy, C., Arbeille, E., Thoinet, K., Castellani, V. Culture of Isolated Floor Plate Tissue and Production of Conditioned Medium to Assess Functional Properties of Floor Plate-released Signals. J. Vis. Exp. (84), e50884, doi:10.3791/50884 (2014).

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