Culture de tissus isolement de la plaque au sol et la production de milieu conditionné à évaluer les propriétés fonctionnelles des signaux plancher Plate-publié

Summary

Le plancher est une structure essentielle des neurones de la moelle épinière en développement, fournissant des signaux diffusibles de progéniteurs et la différenciation. Nous décrivons une méthode pour produire des varangues milieu conditionné, à appliquer au tissu de la moelle épinière frais, et d'évaluer les conséquences sur les protéines d'intérêt par la biochimie.

Abstract

Au cours du développement, les progéniteurs et les neurones post-mitotiques reçoivent des signaux de territoires adjacents qui régulent leur sort. La plaque de sol est un groupe de cellules gliales tapissant le canal épendymaire en position ventrale. La plaque de sol exprime morphogènes clés contribuant à la structuration de lignées de cellules dans la moelle épinière. À des stades de développement plus tard, la plaque de sol réglemente la navigation des axones de la moelle épinière, agissant comme une barrière pour empêcher le passage des axones homolatéraux et franchissement de la ligne médiane de contrôle par les axones commissure ^1. Ces fonctions sont réalisées grâce à la sécrétion de diverses signaux de guidage. Certains de ces indices agir comme attractifs et répulsifs pour les axones en croissance tandis que d'autres réglementent les récepteurs d'orientation et de signalisation en aval de moduler la sensibilité des axones aux ^2,3 signaux de guidage locales. Nous décrivons ici une méthode qui permet l'étude des propriétés des signaux provenant du sol plaque dans une variété de dévecontextes lopmental, sur la base de la production de support de plancher Plate conditionné (FP ^{cm) 4-6.} Nous illustrons ensuite l'utilisation de ce FP ^cm dans le cadre de guidage axonal. Tout d'abord, la moelle épinière est isolé à partir d'embryons de souris à E12.5 et de la plaque de fond est disséqué et cultivées dans une matrice plasma-thrombine (figure 1). Deuxième deux jours plus tard, le tissu commissure sont disséqués à partir d'embryons E12.5, trituré et exposé à la FP ^cm. Troisièmement, le tissu est traité pour analyse par Western blot de marqueurs commissure.

Introduction

La plaque de sol est un centre de formation de motif bien connu de la moelle épinière en développement, jouent un rôle clé dans la spécification des progéniteurs et les lignées de cellules post-mitotiques et contrôler la navigation des axones ^7,8. La procédure expérimentale décrite ici pour produire FP ^cm permet aux enquêteurs d'évaluer les propriétés fonctionnelles des signaux de plaque dérivé étage dans un des contextes différents des processus de développement, de la structuration et la survie cellulaire à cellulaire et la migration des axones.

Pour illustrer l'utilisation de tels FP ^cm, les tissus de la moelle épinière dorsale contenant des neurones commissurales sont disséqués, dilacérées et stimulées avec du FP ^cm. Les tissus peuvent ensuite être traitées pour l'analyse Western blot. Cela permet d'instruction des règlements de la machine de guidage axonal par des signaux libérés plancher plat. Procédé de traitement de tissu frais dilacérées maintient le grand avantage de conserver le micro-environnement des cellules au sein de ee tissu. Ainsi, les conséquences du traitement par FP ^cm ou n'importe quels types de traitement sont évaluées de façon plus physiologique que dans des conditions de culture cellulaire et tissulaire.

Protocol

JOUR 1 Une. Dissection de la moelle épinière étage Plate (FP) de E12.5 embryons de souris Remarque: L'ensemble de la procédure nécessite l'utilisation de conditions stériles. Il est préférable d'effectuer la dissection sous une hotte à dissection pour éviter la contamination. La surface de la hotte doit être nettoyé avec de l'éthanol. Tous les instruments de dissection doivent être stérilisés et conservés dans une boî…

Representative Results

Commissurales tissus ont été traités par le FP cm et les échantillons ont été traités pour l'analyse des niveaux des récepteurs de Western blot. Application de la FP cm a été montré pour augmenter les niveaux d'un récepteur d'orientation, PlexinA1, qui médiatise la sensibilité des axones commissure de la ligne médiane répulsif Semaphorin3B après avoir traversé (Figure 2). Cette étude a révélé que les signaux libérés par la FP régulent les niveau…

Discussion

La production de plaque de sol milieu conditionné fournit un moyen simple et efficace pour évaluer les propriétés biologiques des signaux libérés de la plaque de sol.

La matrice de plasma-thrombine offre une excellente condition de la survie de tissu. Néanmoins, cet environnement enrichi pourrait être une limitation pour certains types d'expériences. Ainsi, le tissu de la plaque de fond peut également être cultivé dans une matrice d'agarose. La qualité de la plaque de so…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTS REQUIRED
PBS	Invitrogen	14190-094
HBSS, Ca2+/Mg2+– free	Invitrogen	14170-088
Glucose	Sigma	G-7021
Neurobasal	Invitrogen	21103-049
Plasma	Sigma	P-3266	1mg/ml (Reconstitute in H2O and filtrate)
Thrombin	Sigma	T-4648	10mg/ml(Reconstitute in H2O and filtrate)
B27	Invitrogen	17504-044	50X
Hepes (260g/mol)	Sigma	H-7006
EDTA	Sigma	E-5513	0,5M pH8
MgCL2	Euromedex	2189	1M
Glycerol	VWR	24388.295
IGEPAL	Sigma	I-3021
Complete Protease inhibitor Cocktail Tablets	Roche	04 693 116 001
Sodium Orthovanadate (Na3VO4)	Sigma	S-6508
distilled H2O
			Table 1. Reagents required
			TOOLS AND MATERIAL
Surgical scissors	Fine Science Tools	14002-12
Adson forceps	Fine Science Tools	11027-12
Dumont #5 Fine Tips forceps	Fine Science Tools	11254-20
micro knives	Fine Science Tools	10136-14
			Table 2. Tools and material
			Dissection and FP culture Ethanol 70% dissection hood dissection microscope Petri dishes glass coverslips 18mm x 18mm Bunsen gas burner 24 well plate tissue culture incubator (37°C, 5% CO2, humidity controlled) Centrifuge RECIPES FP culture media Neurobasal B27 1/50e dilution from stock HBSS – Thrombin HBSS 1 ml Thrombin 10mg/ml 30 μl Lysis Buffer pH7,4 Hepes (260 g/mol) 25mM EDTA (pH8) 5mM MgCL2 1mM Glycerol 10% IGEPAL (NP40) 0.10% Protease Inhibitor Cocktail 1X Sodium Orthovanadate 0,2M H2O Laemmli Buffer Tris 0,5M, pH 6,8 375 mM SDS 6% Glycerol 60% DTT 0,6M Bromophenol blue H2O