Kultur Isoleret gulvplade Tissue og produktion af medium til Vurdere funktionelle egenskaber af bundpladen udgivet Signaler

Summary

Bundpladen er en afgørende struktur i udviklingslandene rygmarven, giver diffusible signaler til stamfædre og differentierende neuroner. Vi beskriver en metode til at producere gulv-plade konditioneret medium, at anvende den på frisk rygmarv væv, og at vurdere konsekvenserne på proteiner af interesse ved biokemi.

Abstract

Under udviklingen stamfædre og post-mitotiske neuroner modtage signaler fra tilstødende områder, der regulerer deres skæbne. Gulvpladen er en gruppe af gliaceller foring ependymal kanalen ved ventral position. Gulvpladen udtrykker centrale morfogeners bidrager til mønstret af celleafstamninger i rygmarven. På senere udviklingsstadier, gulvpladen regulerer sejlads af axoner i rygmarven, som en barriere for at forhindre passage af ipsilaterale axoner og kontrollerende midterlinjen passage af kommissurale axoner ^1. Disse funktioner opnås gennem udskillelsen af ​​forskellige vejlednings-signaler. Nogle af disse signaler fungerer som lokkemidler og afskrækningsmidler til de voksende axoner, mens andre regulerer vejledning receptorer og downstream signalering at modulere følsomheden af axoner til de lokale vejlednings ^2,3 signaler. Her beskriver vi en fremgangsmåde, der gør det muligt at undersøge egenskaberne af gulvpladen afledte signaler i en række udviklopmental sammenhænge, ​​baseret på produktion af gulvpladen konditioneret medium (FP ^{cm) 4-6.} Vi eksemplificere så brugen af dette FP ^cm i forbindelse med Axon vejledning. Først rygmarven isoleret fra museembryo på E12.5 og gulvpladen dissekeres ud og dyrkes i plasma-thrombin matrix (figur 1). Second to dage senere, er kommissural væv dissekeres ud fra E12.5 embryoer, findelt og udsat for FP ^cm. For det tredje er det væv behandles til Western blot-analyse af kommissurale markører.

Introduction

Gulvpladen er et velkendt mønster centrum for udvikling af rygmarven, spille centrale roller i specifikationen af stamfædre og postmitotiske celleafstamninger og kontrollere Axon navigation ^7,8. Den eksperimentelle procedure beskrevet her til at producere FP ^cm giver efterforskerne at vurdere de funktionelle egenskaber af gulvplade-afledte signaler i en forskellige sammenhænge udviklingsprocesser, fra celle mønstre og overlevelse til celle og Axon migration.

For at illustrere anvendelsen af sådanne FP ^cm, er dorsale rygmarvsbetændelse indeholder kommissurale neuroner dissekeret, dilacerated og stimuleret med FP ^cm. Vævene kan derefter behandles til Western blot-analyse. Dette gør det muligt at undersøge reglerne i Axon vejledning maskiner ved gulv-plade udgivet signaler. Den fremgangsmåde til behandling af dilacerated friskt væv besidder den store fordel at bevare mikromiljøet af celler i the væv. Således konsekvenserne af behandlingen af FP ^cm eller nogen former for behandling, vurderes i en mere fysiologisk måde end i celler og væv dyrkningsbetingelser.

Protocol

DAG 1 1.. Dissektion af rygmarven bundpladen (FP) fra E12.5 musefostre Bemærk: Hele proceduren kræver brug af sterile forhold. Det er at foretrække at udføre dissektion under en dissektion hætte for at undgå forurening. Overfladen af ​​emhætten bør rengøres med ethanol. Alle Dissektionsinstrumenter skal steriliseres og holdes i en steril petriskål. Væskerne (medium dissektionsmedium) skal holdes lukket og sat i et isbad. Hvert embryon s…

Representative Results

Kommissurale væv blev behandlet af FP cm og prøverne blev forarbejdet til analyse af receptor-niveauer i Western blot. Anvendelsen af FP cm viste sig at øge niveauet af en vejledning receptor PlexinA1, som medierer følsomhed kommissurale axoner med midterlinjen repellent Semaphorin3B efter passage (figur 2). Det fremgik, at signaler, udgivet af FP regulere PlexinA1 niveauerne 4,6. <img alt="Figur 1" fo…

Discussion

Produktionen af ​​gulv-plade medium giver en effektiv og nem måde for at vurdere de biologiske egenskaber af gulv plade udgivet signaler.

Plasma-thrombin matrix giver fremragende betingelse for væv overlevelse. Alligevel kan denne beriget miljø være en begrænsning for nogle typer af eksperimenter. Således kan bundpladen væv også dyrkes i agarosematrix. Kvaliteten af bundpladen konditionerede medium kan vurderes ved påvisning af kendte gulvplade frigivne signaler, såsom GDNF <st…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTS REQUIRED
PBS	Invitrogen	14190-094
HBSS, Ca2+/Mg2+– free	Invitrogen	14170-088
Glucose	Sigma	G-7021
Neurobasal	Invitrogen	21103-049
Plasma	Sigma	P-3266	1mg/ml (Reconstitute in H2O and filtrate)
Thrombin	Sigma	T-4648	10mg/ml(Reconstitute in H2O and filtrate)
B27	Invitrogen	17504-044	50X
Hepes (260g/mol)	Sigma	H-7006
EDTA	Sigma	E-5513	0,5M pH8
MgCL2	Euromedex	2189	1M
Glycerol	VWR	24388.295
IGEPAL	Sigma	I-3021
Complete Protease inhibitor Cocktail Tablets	Roche	04 693 116 001
Sodium Orthovanadate (Na3VO4)	Sigma	S-6508
distilled H2O
			Table 1. Reagents required
			TOOLS AND MATERIAL
Surgical scissors	Fine Science Tools	14002-12
Adson forceps	Fine Science Tools	11027-12
Dumont #5 Fine Tips forceps	Fine Science Tools	11254-20
micro knives	Fine Science Tools	10136-14
			Table 2. Tools and material
			Dissection and FP culture Ethanol 70% dissection hood dissection microscope Petri dishes glass coverslips 18mm x 18mm Bunsen gas burner 24 well plate tissue culture incubator (37°C, 5% CO2, humidity controlled) Centrifuge RECIPES FP culture media Neurobasal B27 1/50e dilution from stock HBSS – Thrombin HBSS 1 ml Thrombin 10mg/ml 30 μl Lysis Buffer pH7,4 Hepes (260 g/mol) 25mM EDTA (pH8) 5mM MgCL2 1mM Glycerol 10% IGEPAL (NP40) 0.10% Protease Inhibitor Cocktail 1X Sodium Orthovanadate 0,2M H2O Laemmli Buffer Tris 0,5M, pH 6,8 375 mM SDS 6% Glycerol 60% DTT 0,6M Bromophenol blue H2O