隔离楼板组织条件培养基和生产，以评估楼板释放信号的功能性质的文化

Summary

底板是脊髓发育，以祖扩散提供信号和分化的神经元的重要结构。我们描述了一种方法，以产生地面板材的条件培养基，将它应用到新鲜脊髓组织，并通过生化，以评估所关注的蛋白质的后果。

Abstract

在开发过程中，祖细胞和有丝分裂后神经元的调节自己的命运毗邻地区接收信号。地板板是一组神经胶质细胞衬里的室管膜运河在腹位置。地板板表示键形态发生素促进细胞谱系的脊髓中的图案形成。发育后期，地板板调节轴突在脊髓导航，作为一个屏障，以防止患侧轴突和控制中线交叉的道口通过合轴突^1。这些功能是通过各种指导线索的分泌来实现。其中一些线索作为引诱和驱避剂的轴突生长，而其他规范指导受体和下游信号的轴突的灵敏度调节到当地指导线索^2,3。这里我们描述了一种方法，它允许调查的地板板衍生的信号中的各种德韦的属性lopmental上下文的基础上，生产地板板条件培养基（FP ^{厘米）4-6。}然后，我们举例说明在轴突导向的情况下使用这种FP ^厘米 。首先，脊髓从小鼠胚胎中分离在E12.5和地板板被解剖出来并培养在血浆凝血酶基质（ 图1）。第二，两天后，连合组织是从E12.5胚胎解剖出来，研碎并暴露在FP ^厘米 。三，组织处理对连合标记Western blot分析。

Introduction

地板板是脊髓发育的一个众所周知的构图中心，祖细胞和有丝分裂后细胞谱系的规范扮演关键角色，并控制轴突导航^7,8。这里描述生产的FP ^厘米的实验程序允许调查评估底板源性信号在发育过程中的各种情况下的功能特性，从 ​​细胞图案和存活细胞及轴突迁移。

为了说明使用这样的FP ^厘米 ，含有合神经元背侧脊髓组织被解剖，dilacerated和与FP ^厘米刺激。组织然后可以处理用于Western印迹分析。这使得调查轴突导向机械按楼层板信号发布规定。治疗dilacerated新鲜组织中的保存方法保存细胞内日微环境的巨大优势Ë组织。因此，通过FP ^厘米治疗或任何类型的治疗的后果被评估的多个生理方式比在细胞和组织培养条件。

Protocol

第1天 1。从E12.5小鼠胚胎脊髓地板板（FP）的解剖 注意：整个程序需要使用的无菌条件。最好是根据解剖罩进行解剖，以避免污染。机罩的表面应该用乙醇进行清洗。所有清扫工具必须消毒，并保持在无菌培养皿中。的液体（介质，夹层介质）必须保持封闭并置于冰浴中。每个胚胎必须被收集在单独的新鲜降。这对于组织保存重要。解剖与杜蒙＃…

Representative Results

连合组织是由FP 厘米处理和对样品进行处理以供在Western印迹受体水平的分析。结果表明，增加的指导受体，PlexinA1，该交叉（ 图2），后介导合轴突的中线斥Semaphorin3B灵敏度水平的FP 厘米的应用。这表明，由FP释放信号调节PlexinA1水平4,6。 <img alt="图1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50884/50884fig1highres.jpg" src=…

Discussion

地板板条件培养基的生产提供了一种有效，简便的方法，以评估底板释放信号的生物学特性。

血浆凝血酶矩阵提供了极好的条件，组织的生存。然而，这种丰富的环境可能对于某些类型的实验的限制。因此，底板的组织，也可以培养在琼脂糖基质。底板的条件培养基的质量可以通过已知的地板板释放信号，如GDNF（ 图2），Shh和netrin诱导¹¹的检测来评估。?…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTS REQUIRED
PBS	Invitrogen	14190-094
HBSS, Ca2+/Mg2+– free	Invitrogen	14170-088
Glucose	Sigma	G-7021
Neurobasal	Invitrogen	21103-049
Plasma	Sigma	P-3266	1mg/ml (Reconstitute in H2O and filtrate)
Thrombin	Sigma	T-4648	10mg/ml(Reconstitute in H2O and filtrate)
B27	Invitrogen	17504-044	50X
Hepes (260g/mol)	Sigma	H-7006
EDTA	Sigma	E-5513	0,5M pH8
MgCL2	Euromedex	2189	1M
Glycerol	VWR	24388.295
IGEPAL	Sigma	I-3021
Complete Protease inhibitor Cocktail Tablets	Roche	04 693 116 001
Sodium Orthovanadate (Na3VO4)	Sigma	S-6508
distilled H2O
			Table 1. Reagents required
			TOOLS AND MATERIAL
Surgical scissors	Fine Science Tools	14002-12
Adson forceps	Fine Science Tools	11027-12
Dumont #5 Fine Tips forceps	Fine Science Tools	11254-20
micro knives	Fine Science Tools	10136-14
			Table 2. Tools and material
			Dissection and FP culture Ethanol 70% dissection hood dissection microscope Petri dishes glass coverslips 18mm x 18mm Bunsen gas burner 24 well plate tissue culture incubator (37°C, 5% CO2, humidity controlled) Centrifuge RECIPES FP culture media Neurobasal B27 1/50e dilution from stock HBSS – Thrombin HBSS 1 ml Thrombin 10mg/ml 30 μl Lysis Buffer pH7,4 Hepes (260 g/mol) 25mM EDTA (pH8) 5mM MgCL2 1mM Glycerol 10% IGEPAL (NP40) 0.10% Protease Inhibitor Cocktail 1X Sodium Orthovanadate 0,2M H2O Laemmli Buffer Tris 0,5M, pH 6,8 375 mM SDS 6% Glycerol 60% DTT 0,6M Bromophenol blue H2O