צלחת הרצפה היא מבנה חיוני של תאי העצב מתפתח בעמוד השדרה, ומספקים אותות diffusible לאבות ומבדל. אנו מתארים שיטה להפקה בינונית מותנים בקומת צלחת, כדי להחיל אותו על רקמת חוט השדרה טרי, ועל מנת להעריך את ההשלכות על חלבונים של עניין על ידי ביוכימיה.
במהלך פיתוח, אבות ונוירונים לאחר mitotic לקבל אותות משטחים סמוכים המסדירים את גורלם. רצפת הצלחת היא קבוצה של תאים המצפה את תעלת גליה ependymal בעמדת הגחון. רצפת הצלחת מבטאת morphogens מפתח תורם לדפוסים של שושלות תאים בחוט השדרה. בשלבי התפתחותיים מאוחרים יותר, בקומת הצלחת מסדירה את הניווט של אקסונים בחוט השדרה, הפועל כמחסום כדי למנוע את מעבר של אקסונים ipsilateral וחציית קו האמצע שליטה על ידי אקסונים commissural 1. פונקציות אלה מושגות באמצעות הפרשת אותות הנחיה שונות. חלק מרמזים אלה לפעול כמשיכה ודוחים לאקסונים גדל בעוד שאחרים להסדיר קולטנים הדרכה ואיתות במורד הזרם כדי לווסת את הרגישות של האקסונים לאותות הנחיה המקומיים 2,3. כאן אנו מתארים שיטה המאפשרת לחקור את תכונותיהם של אותות הנגזרים מהרצפה צלחת במגוון deveהקשרי lopmental, המבוססים על הייצור של מדיום לקיר-פלייט מותנה (סנטימטר FP) 4-6. לאחר מכן, אנו מדגימים את השימוש בסנטימטר FP זה בהקשר של הדרכה האקסון. ראשית, בחוט השדרה מבודד מעובר של העכבר בE12.5 ורצפת הצלחת גזור החוצה וטיפחה במטריצת הפלזמה תרומבין (איור 1). שני ימים שני לאחר מכן, רקמות commissural הם גזורים החוצה מעוברי E12.5, triturated ונחשפו לסנטימטר FP. שלישית, הרקמה מעובדות לניתוח כתם מערבי של סמני commissural.
רצפת הצלחת היא מרכז דפוסים ידוע של חוט השדרה המתפתח, ממלא תפקידי מפתח במפרט של אבות ושושלות תאי postmitotic ושליטה ניווט האקסון 7,8. הליך הניסוי שתואר כאן כדי לייצר סנטימטר FP מאפשר לחוקרים להעריך את המאפיינים הפונקציונליים של אותות המופק מצלחת רצפה בהקשרים שונים של תהליכים התפתחותיים, מדפוסי תא והישרדות לתא וההגירה האקסון.
כדי להדגים את השימוש בסנטימטר FP כגון, רקמות חוט השדרה הגבי מכילות נוירונים commissural הם גזורים, dilacerated ומגורה עם סנטימטר FP. הרקמות אז יכולות להיות מעובד לניתוח כתם מערבי. זה מאפשר לחקור את התקנות של מכונות האקסון הדרכה על ידי אותות שוחררו מהרצפה צלחת. שיטת הטיפול של רקמה טרי dilacerated מחזיקה את היתרון הגדול של שימור microenvironment של תאים בתוך הדואר רקמות. לכן ההשלכות של הטיפול על ידי סנטימטר FP או כל סוגים של טיפול מוערכים באופן פיסיולוגי יותר מאשר בתא ותנאים בתרבית רקמה.
הייצור של מדיום מותנה בקומת צלחת מספק דרך יעילה וקלה להערכת המאפיינים הביולוגיים של אותות שוחררו צלחת רצפה.
מטריקס הפלזמה תרומבין מספק מצב מצוין להישרדות רקמות. עם זאת, סביבה מועשרת זה עשויה להיות מגבלה עבור סוגים מסוימים של ניס?…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לקרין Kindbeiter, מיוריאל Bozon, ופלורי ריינו לעזרתם. העבודה נתמכת על ידי CNRS, תכנית ANR יודה וLabex DevWeCan.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
REAGENTS REQUIRED | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
PBS | Invitrogen | 14190-094 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
HBSS, Ca2+/Mg2+– free | Invitrogen | 14170-088 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Glucose | Sigma | G-7021 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Neurobasal | Invitrogen | 21103-049 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Plasma | Sigma | P-3266 | 1mg/ml (Reconstitute in H2O and filtrate) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Thrombin | Sigma | T-4648 | 10mg/ml(Reconstitute in H2O and filtrate) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
B27 | Invitrogen | 17504-044 | 50X | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Hepes (260g/mol) | Sigma | H-7006 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
EDTA | Sigma | E-5513 | 0,5M pH8 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
MgCL2 | Euromedex | 2189 | 1M | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Glycerol | VWR | 24388.295 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
IGEPAL | Sigma | I-3021 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Complete Protease inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04 693 116 001 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Sigma | S-6508 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
distilled H2O | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table 1. Reagents required | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TOOLS AND MATERIAL | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Surgical scissors | Fine Science Tools | 14002-12 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Adson forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Dumont #5 Fine Tips forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
micro knives | Fine Science Tools | 10136-14 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table 2. Tools and material | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|