Cultura della Isolato Piastra di tessuti e la produzione di mezzo condizionato per valutare le proprietà funzionali del pavimento segnali piastra rilasciato

Summary

La piastra è una struttura fondamentale delle sviluppo del midollo spinale, che forniscono segnali diffusibili di progenitori e differenziazione dei neuroni. Descriviamo un metodo per produrre pavimento piatto mezzo condizionato, per applicarla al tessuto del midollo spinale fresco, e di valutare le conseguenze sulle proteine ​​di interesse da biochimica.

Abstract

Durante lo sviluppo, progenitori e neuroni post-mitotici ricevono segnali da territori adiacenti che regolano il loro destino. Il pavimento piatto è un gruppo di cellule gliali di rivestimento del canale ependimale in posizione ventrale. Il piano piastra esprime morphogens chiave che contribuiscono al patterning di linee cellulari nel midollo spinale. Nelle fasi successive dello sviluppo, al piano piastra regola la navigazione degli assoni nel midollo spinale, agendo come barriera per impedire il passaggio degli assoni ipsilaterali e controllo attraversamento linea mediana da assoni commissurali ^1. Queste funzioni sono raggiunti attraverso la secrezione di vari segnali di orientamento. Alcuni di questi segnali agiscono come attrattivi e repellenti per gli assoni crescenti mentre altri regolano recettori di orientamento e di segnalazione a valle di modulare la sensibilità degli assoni ai segnali locali di orientamento ^2,3. Qui si descrive un metodo che consente di studiare le proprietà del pavimento piastra segnali derivati ​​in una varietà di svicontesti lopmental, basate sulla produzione di medio Floor-Plate condizionata (FP ^{cm) 4-6.} Abbiamo poi esemplificare l'uso di questo FP ^cm nel contesto di guida degli assoni. In primo luogo, il midollo spinale è isolato da embrione di topo a E12.5 e il pavimento piastra è sezionato fuori e coltivato in una matrice plasma-trombina (Figura 1). Seconda due giorni dopo, il tessuto commissurali vengono sezionati fuori da embrioni E12.5, triturato ed esposto al ^cm FP. In terzo luogo, il tessuto vengono elaborati per l'analisi Western Blot dei marcatori commissurali.

Introduction

Il pavimento piastra è un centro patterning ben noto della sviluppo midollo spinale, che gioca un ruolo chiave nella specificazione dei progenitori e linee cellulari postmitotici e controllare la navigazione assone ^7,8. La procedura sperimentale descritta qui di produrre FP ^cm consente agli investigatori di valutare le proprietà funzionali dei segnali piatto di derivazione piano di un diversi contesti di processi di sviluppo, di patterning cellulare e la sopravvivenza delle cellule e la migrazione degli assoni.

Per illustrare l'uso di tale FP ^cm, i tessuti del midollo spinale dorsale che contengono neuroni commissurali sono sezionati, dilacerated e stimolate con la FP ^cm. I tessuti possono poi essere elaborati per l'analisi Western Blot. Questo permette di indagare disposizioni della macchinari guida degli assoni dal pavimento piatto segnali rilasciati. Il metodo di trattamento di tessuto fresco dilacerated detiene il grande vantaggio di preservare il microambiente delle cellule all'interno the tessuto. Così le conseguenze del trattamento da FP ^cm o qualsiasi tipo di trattamento sono valutate in modo più fisiologico che in cellule e condizioni di coltura tissutale.

Protocol

GIORNO 1 1. La dissezione del midollo spinale Piastra (FP) da E12.5 embrioni di topo Nota: L'intera procedura richiede l'uso di condizioni di sterilità. È preferibile effettuare la dissezione sotto una cappa dissezione per evitare la contaminazione. La superficie della cappa deve essere pulito con etanolo. Tutti gli strumenti di dissezione devono essere sterilizzati e tenuti in una piastra di Petri sterile. I liquidi (medio, medio dissezione…

Representative Results

Commessurali tessuti sono stati trattati dal cm FP ed i campioni sono stati processati per l'analisi dei livelli di recettore in Western blot. Applicazione delle cm FP ha mostrato di aumentare i livelli di un recettore orientamento, PlexinA1, che media la sensibilità degli assoni commessurali alla linea mediana repellente Semaphorin3B dopo aver attraversato (Figura 2). Ciò ha rivelato che i segnali diffusi dalla FP regolare i livelli di PlexinA1 4,6. <p class="…

Discussion

La produzione di pavimento-plate mezzo condizionato fornisce un modo efficace e semplice per valutare le proprietà biologiche del piatto piano segnali rilasciati.

La matrice di plasma-trombina offre ottime condizioni per la sopravvivenza del tessuto. Tuttavia, questo ambiente arricchito potrebbe essere una limitazione per alcuni tipi di esperimenti. Pertanto, il tessuto piastra può essere coltivato in matrice di agarosio. La qualità del mezzo piastra condizionata può essere valutato dall…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTS REQUIRED
PBS	Invitrogen	14190-094
HBSS, Ca2+/Mg2+– free	Invitrogen	14170-088
Glucose	Sigma	G-7021
Neurobasal	Invitrogen	21103-049
Plasma	Sigma	P-3266	1mg/ml (Reconstitute in H2O and filtrate)
Thrombin	Sigma	T-4648	10mg/ml(Reconstitute in H2O and filtrate)
B27	Invitrogen	17504-044	50X
Hepes (260g/mol)	Sigma	H-7006
EDTA	Sigma	E-5513	0,5M pH8
MgCL2	Euromedex	2189	1M
Glycerol	VWR	24388.295
IGEPAL	Sigma	I-3021
Complete Protease inhibitor Cocktail Tablets	Roche	04 693 116 001
Sodium Orthovanadate (Na3VO4)	Sigma	S-6508
distilled H2O
			Table 1. Reagents required
			TOOLS AND MATERIAL
Surgical scissors	Fine Science Tools	14002-12
Adson forceps	Fine Science Tools	11027-12
Dumont #5 Fine Tips forceps	Fine Science Tools	11254-20
micro knives	Fine Science Tools	10136-14
			Table 2. Tools and material
			Dissection and FP culture Ethanol 70% dissection hood dissection microscope Petri dishes glass coverslips 18mm x 18mm Bunsen gas burner 24 well plate tissue culture incubator (37°C, 5% CO2, humidity controlled) Centrifuge RECIPES FP culture media Neurobasal B27 1/50e dilution from stock HBSS – Thrombin HBSS 1 ml Thrombin 10mg/ml 30 μl Lysis Buffer pH7,4 Hepes (260 g/mol) 25mM EDTA (pH8) 5mM MgCL2 1mM Glycerol 10% IGEPAL (NP40) 0.10% Protease Inhibitor Cocktail 1X Sodium Orthovanadate 0,2M H2O Laemmli Buffer Tris 0,5M, pH 6,8 375 mM SDS 6% Glycerol 60% DTT 0,6M Bromophenol blue H2O