Summary

床板リリースされた信号の機能的特性を評価するために馴化培地離さ床板組織と生産の文化

Published: February 11, 2014
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Summary

フロア·プレートは、脊髄を現像前駆細胞への拡散信号を提供し、ニューロン分化の重要な構造である。我々は、床プレート馴化培地を生成するために、新鮮な脊髄組織に適用し、そして生化学ことにより、目的のタンパク質上の影響を評価するための方法を記載している。

Abstract

開発中に、前駆細胞と有糸分裂後のニューロンは、彼らの運命を制御し、隣接する地域からの信号を受信する。床プレートは、腹の位置に上衣運河の内側を覆うグリア細胞のグループです。床プレートは、脊髄内の細胞系譜のパターニングに貢献キーモルフォゲンを表現しています。後期発生段階で、床版は、交連軸索1により同側軸索と制御正中線交差の交差を防止するためのバリアとして機能し、脊髄内の軸索のナビゲーションを調整する。これらの機能は、様々な指導の手がかりの分泌によって達成される。他の人が地元の指導の手がかりに軸索2,3の感度を調節するために、ガイダンス受容体と下流のシグナル伝達を制御しながら、これらの手がかりの中には、成長している軸索のための誘引と忌避剤として機能します。ここでは、DEVE様々なフロアプレート由来シグナルの性質を調査可能にする方法を説明フロアプレート調整培地(FP センチ)4-6の生産に基づいてlopmentalコンテキスト。次に、軸索ガイダンスのコンテキストでこのFP cm 使用を例示。まず、脊髄をE12.5でのマウス胚から単離され、フロアプレートを解剖し、血漿トロンビンマトリックス( 図1)で培養される。第2日後に、交連組織は、E12.5胚から摘出粉砕し、FPのCMにさらされている。第三に、組織は、交連のマーカーのウェスタンブロット分析のために処理される。

Introduction

床プレートは、前駆細胞と分裂後の細胞系譜と制御軸索ナビゲーション7,8の仕様で重要な役割を果たして、開発脊髄のよく知られたパターンニングセンターです。 FP CMを作るためにここに記載の実験方法は、細胞のパターニングと生存の細胞と軸索の移行のために、研究者は発生過程の様々な文脈でのフロアプレート由来のシグナルの機能的特性を評価することができます。

このようなFP cmの使用を例示するために、交連ニューロンを含む背側脊髄組織は、解剖dilaceratedおよびFP センチメートルで刺激する。組織は、次いで、ウェスタンブロット分析のために処理することができる。これは、床版リリースされた信号により、軸索誘導機構の規制を調査できます。 dilacerated新鮮な組織の治療方法は、目の中の細胞の微小環境を保存する大きな利点を保持しているE組織。従ってFP センチによる治療または治療のいずれかのタイプの結果は、細胞及び組織培養条件におけるよりもより生理学的な方法で評価する。

Protocol

1日目 1。 E12.5マウス胚からの脊髄床板(FP)の解剖 注意:全体の手順は、無菌状態を使用する必要があります。これは、汚染を避けるために切開フード下で切開を行うことが好ましい。フードの表面をエタノールで洗浄する必要があります。すべての解剖器具は、滅菌シャーレに滅菌され、維持されなければならない。液体(媒体、切開媒?…

Representative Results

交連組織はFP センチにより処理し、試料を、ウェスタンブロットにおける受容体レベルの分析のために処理した。 FP cm のアプリケーションは、ガイダンス受容体のレベルを増加させる( 図2)を横切った後正中線忌避Semaphorin3Bに交連軸索の感受性を媒介するPlexinA1を示した。これは、FPが発表した信号がPlexinA1レベル4,6を制御することを明らかにした。 …

Discussion

フロアプレート馴化培地の生産は床板にリリース信号の生物学的特性を評価するための効率的かつ簡単な方法を提供します。

プラズマトロンビンマトリックスは、組織の生存のための優れた条件を提供しています。それにもかかわらず、この豊かな環境は、実験の種類によっては制限がある可能性があります。このように、底板組織はまた、アガロースマトリックスで?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我々は彼らの助けをカリーヌKindbeiter、ミュリエルBozon、およびFlorieレイノーに感謝します。仕事はCNRS、ANR依田プログラムとLabex DevWeCanでサポートされています。

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
REAGENTS REQUIRED
PBS Invitrogen 14190-094
HBSS, Ca2+/Mg2+– free Invitrogen 14170-088
Glucose Sigma G-7021
Neurobasal Invitrogen 21103-049
Plasma Sigma P-3266 1mg/ml (Reconstitute in H2O and filtrate)
Thrombin Sigma T-4648 10mg/ml(Reconstitute in H2O and filtrate)
B27 Invitrogen 17504-044 50X
Hepes (260g/mol) Sigma H-7006
EDTA Sigma E-5513 0,5M pH8
MgCL2 Euromedex 2189 1M
Glycerol VWR 24388.295
IGEPAL Sigma I-3021
Complete Protease inhibitor Cocktail Tablets Roche 04 693 116 001
Sodium Orthovanadate (Na3VO4) Sigma S-6508
distilled H2O
Table 1. Reagents required
TOOLS AND MATERIAL
Surgical scissors Fine Science Tools 14002-12
Adson forceps Fine Science Tools 11027-12
Dumont #5 Fine Tips forceps Fine Science Tools 11254-20
micro knives Fine Science Tools 10136-14
Table 2. Tools and material
Dissection and FP culture
Ethanol 70%
dissection hood
dissection microscope
Petri dishes
glass coverslips 18mm x 18mm
Bunsen gas burner
24 well plate
tissue culture incubator (37°C, 5% CO2, humidity controlled)
Centrifuge
RECIPES
FP culture media
Neurobasal
B27 1/50e dilution from stock
HBSS – Thrombin
HBSS 1 ml
Thrombin 10mg/ml 30 μl
Lysis Buffer pH7,4
Hepes (260 g/mol) 25mM
EDTA (pH8) 5mM
MgCL2 1mM
Glycerol 10%
IGEPAL (NP40) 0.10%
Protease Inhibitor Cocktail 1X
Sodium Orthovanadate 0,2M
H2O
Laemmli Buffer
Tris 0,5M, pH 6,8 375 mM
SDS 6%
Glycerol 60%
DTT 0,6M
Bromophenol blue
H2O

References

  1. Nawabi, H., Castellani, V. Axonal commissures in the central nervous system: how to cross the midline. Cell. Mol. Life Sci. 68, 2539-2553 (2011).
  2. Placzek, M., Briscoe, J. The floor plate: multiple cells, multiple signals. Nat. Rev. Neurosci. 6, 230-240 (2005).
  3. Chedotal, A. Further tales of the midline. Curr. Opin. Neurobiol. 21, 68-75 (1016).
  4. Nawabi, H., et al. A midline switch of receptor processing regulates commissural axon guidance in vertebrates. Genes Dev. 24, 396-410 (2010).
  5. Ruiz de Almodovar, C., et al. VEGF mediates commissural axon chemoattraction through its receptor Flk1. Neuron. 70, 966-978 (2011).
  6. Charoy, C., et al. gdnf activates midline repulsion by Semaphorin3B via NCAM during commissural axon guidance. Neuron. 75, 1051-1066 (2012).
  7. Kiecker, C., Lumsden, A. The role of organizers in patterning the nervous system. Annu. Rev. Neurosci. 35, 347-367 (2012).
  8. Le Dreau, G., Marti, E. Dorsal-ventral patterning of the neural tube: a tale of three signals. Dev. Neurobiol. 72, 1471-1481 (2012).
  9. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  10. Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. J. Vis. Exp. , (2010).
  11. Salinas, P. C. The morphogen sonic hedgehog collaborates with netrin-1 to guide axons in the spinal cord. Trends Neurosci. 26, 641-643 (2003).
  12. Bechara, A., et al. FAK-MAPK-dependent adhesion disassembly downstream of L1 contributes to semaphorin3A-induced collapse. EMBO J. 27, 1549-1562 (2008).

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Cite This Article
Charoy, C., Arbeille, E., Thoinet, K., Castellani, V. Culture of Isolated Floor Plate Tissue and Production of Conditioned Medium to Assess Functional Properties of Floor Plate-released Signals. J. Vis. Exp. (84), e50884, doi:10.3791/50884 (2014).

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