床板リリースされた信号の機能的特性を評価するために馴化培地離さ床板組織と生産の文化

Summary

フロア·プレートは、脊髄を現像前駆細胞への拡散信号を提供し、ニューロン分化の重要な構造である。我々は、床プレート馴化培地を生成するために、新鮮な脊髄組織に適用し、そして生化学ことにより、目的のタンパク質上の影響を評価するための方法を記載している。

Abstract

開発中に、前駆細胞と有糸分裂後のニューロンは、彼らの運命を制御し、隣接する地域からの信号を受信する。床プレートは、腹の位置に上衣運河の内側を覆うグリア細胞のグループです。床プレートは、脊髄内の細胞系譜のパターニングに貢献キーモルフォゲンを表現しています。後期発生段階で、床版は、交連軸索¹により同側軸索と制御正中線交差の交差を防止するためのバリアとして機能し、脊髄内の軸索のナビゲーションを調整する。これらの機能は、様々な指導の手がかりの分泌によって達成される。他の人が地元の指導の手がかりに軸索^2,3の感度を調節するために、ガイダンス受容体と下流のシグナル伝達を制御しながら、これらの手がかりの中には、成長している軸索のための誘引と忌避剤として機能します。ここでは、DEVE様々なフロアプレート由来シグナルの性質を調査可能にする方法を説明フロアプレート調整培地（FP ^{センチ）4-6}の生産に基づいてlopmentalコンテキスト。次に、軸索ガイダンスのコンテキストでこのFP cm ^の使用を例示。まず、脊髄をE12.5でのマウス胚から単離され、フロアプレートを解剖し、血漿トロンビンマトリックス（ 図1）で培養される。第2日後に、交連組織は、E12.5胚から摘出粉砕し、FPの^CMにさらされている。第三に、組織は、交連のマーカーのウェスタンブロット分析のために処理される。

Introduction

床プレートは、前駆細胞と分裂後の細胞系譜と制御軸索ナビゲーション^7,8の仕様で重要な役割を果たして、開発脊髄のよく知られたパターンニングセンターです。 FP ^CMを作るためにここに記載の実験方法は、細胞のパターニングと生存の細胞と軸索の移行のために、研究者は発生過程の様々な文脈でのフロアプレート由来のシグナルの機能的特性を評価することができます。

このようなFP ^cmの使用を例示するために、交連ニューロンを含む背側脊髄組織は、解剖dilaceratedおよびFP ^{センチメートル}で刺激する。組織は、次いで、ウェスタンブロット分析のために処理することができる。これは、床版リリースされた信号により、軸索誘導機構の規制を調査できます。 dilacerated新鮮な組織の治療方法は、目の中の細胞の微小環境を保存する大きな利点を保持しているE組織。従ってFP ^センチによる治療または治療のいずれかのタイプの結果は、細胞及び組織培養条件におけるよりもより生理学的な方法で評価する。

Protocol

1日目 1。 E12.5マウス胚からの脊髄床板（FP）の解剖 注意：全体の手順は、無菌状態を使用する必要があります。これは、汚染を避けるために切開フード下で切開を行うことが好ましい。フードの表面をエタノールで洗浄する必要があります。すべての解剖器具は、滅菌シャーレに滅菌され、維持されなければならない。液体（媒体、切開媒?…

Representative Results

交連組織はFP センチにより処理し、試料を、ウェスタンブロットにおける受容体レベルの分析のために処理した。 FP cm のアプリケーションは、ガイダンス受容体のレベルを増加させる（ 図2）を横切った後正中線忌避Semaphorin3Bに交連軸索の感受性を媒介するPlexinA1を示した。これは、FPが発表した信号がPlexinA1レベル4,6を制御することを明らかにした。 …

Discussion

フロアプレート馴化培地の生産は床板にリリース信号の生物学的特性を評価するための効率的かつ簡単な方法を提供します。

プラズマトロンビンマトリックスは、組織の生存のための優れた条件を提供しています。それにもかかわらず、この豊かな環境は、実験の種類によっては制限がある可能性があります。このように、底板組織はまた、アガロースマトリックスで?…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTS REQUIRED
PBS	Invitrogen	14190-094
HBSS, Ca2+/Mg2+– free	Invitrogen	14170-088
Glucose	Sigma	G-7021
Neurobasal	Invitrogen	21103-049
Plasma	Sigma	P-3266	1mg/ml (Reconstitute in H2O and filtrate)
Thrombin	Sigma	T-4648	10mg/ml(Reconstitute in H2O and filtrate)
B27	Invitrogen	17504-044	50X
Hepes (260g/mol)	Sigma	H-7006
EDTA	Sigma	E-5513	0,5M pH8
MgCL2	Euromedex	2189	1M
Glycerol	VWR	24388.295
IGEPAL	Sigma	I-3021
Complete Protease inhibitor Cocktail Tablets	Roche	04 693 116 001
Sodium Orthovanadate (Na3VO4)	Sigma	S-6508
distilled H2O
			Table 1. Reagents required
			TOOLS AND MATERIAL
Surgical scissors	Fine Science Tools	14002-12
Adson forceps	Fine Science Tools	11027-12
Dumont #5 Fine Tips forceps	Fine Science Tools	11254-20
micro knives	Fine Science Tools	10136-14
			Table 2. Tools and material
			Dissection and FP culture Ethanol 70% dissection hood dissection microscope Petri dishes glass coverslips 18mm x 18mm Bunsen gas burner 24 well plate tissue culture incubator (37°C, 5% CO2, humidity controlled) Centrifuge RECIPES FP culture media Neurobasal B27 1/50e dilution from stock HBSS – Thrombin HBSS 1 ml Thrombin 10mg/ml 30 μl Lysis Buffer pH7,4 Hepes (260 g/mol) 25mM EDTA (pH8) 5mM MgCL2 1mM Glycerol 10% IGEPAL (NP40) 0.10% Protease Inhibitor Cocktail 1X Sodium Orthovanadate 0,2M H2O Laemmli Buffer Tris 0,5M, pH 6,8 375 mM SDS 6% Glycerol 60% DTT 0,6M Bromophenol blue H2O