Summary

Culture of Isolert Floor Plate Tissue og Produksjon av kondisjonerte medium å vurdere funksjonelle egenskaper gulvplate utgitt Signaler

Published: February 11, 2014
doi:

Summary

En gulvplate er en viktig struktur av utviklingsryggmargen, gir diffusible signaler til stamfedre og differensierende nevroner. Vi beskriver en metode for å produsere gulv-plate kondisjonerte medium, for å bruke den på ny ryggmargsvevet, og for å vurdere konsekvensene av proteiner som er av interesse ved biokjemi.

Abstract

Under utvikling, stamfedre og post-mitotiske nevroner mottar signaler fra tilstøtende områder som regulerer deres skjebne. I gulv-plate er en gruppe av gliaceller lining ependymal kanalen ved ventral stilling. Gulvet-plate uttrykker viktige morphogens bidrar til fordelingen av celle linjene i ryggmargen. Ved senere utviklingsstadier, gulvplate regulerer navigering av axoner i ryggmargen, som fungerer som en barriere for å hindre kryssing av ipsilaterale axoner og kontrollerende midtlinjen krysset ved commissural axons en. Disse funksjoner oppnås ved sekresjon av forskjellige lede signaler. Noen av disse stikkordene fungere som lokkemidler for de voksende axons mens andre regulerer veiledning reseptorer og nedstrøms signal å modulere følsomheten av axoner til de lokale veiledningspekepinner 2,3. Her beskriver vi en fremgangsmåte som gjør det mulig å undersøke egenskapene til gulv-plate avledet signaler i forskjellige utviklopmental sammenhenger, basert på produksjon av gulv-Plate kondisjonerte medium (FP cm) 4-6. Deretter eksemplifiserer bruken av denne FP cm i sammenheng med axon veiledning. Først blir ryggmargs isolert fra mus embryo ved E12.5 og gulv-platen blir dissekert ut og dyrket i et plasma-trombin matriks (figur 1). Andre to dager senere, er commissural vev dissekert ut fra E12.5 embryoer, triturert og utsatt for FP cm. For det tredje er vevet behandles for Western blot analyse av fugedannende markører.

Introduction

Gulvet-plate er et velkjent mønster sentrum av utviklingsryggmargen, som spiller nøkkelroller i spesifikasjonen av stamfedre og postmitotic celle slektslinjer og kontrollerende axon navigasjon 7,8. Den eksperimentelle fremgangsmåte som er beskrevet her for å produsere FP cm kan undersøkere for å vurdere de funksjonelle egenskaper av gulvplate-avledede signaler i en ulike sammenhenger av utviklingsprosesser, fra celle mønster og overlevelse til celle og axon migrasjon.

For å illustrere anvendelsen av en slik FP cm, er ryggryggmargsvev som inneholder commissural neuroner dissekert, dilacerated og stimulert med FP cm. Vevet kan så bli behandlet for Western blot analyse. Dette gjør det mulig å undersøke reguleringer av axon veiledning maskiner av gulv-plate utgitt signaler. Metoden for behandling av dilacerated friskt vev har den store fordelen av å bevare den mikromiljøet av celler innenfor the vev. Dermed konsekvensene av behandlingen av FP cm eller noen typer behandling vurderes i et mer fysiologisk måte enn i celler og vev kultur forhold.

Protocol

DAG 1 En. Disseksjon av ryggmargen gulvplate (FP) fra E12.5 mus embryoer Merk: Hele prosedyren krever bruk av sterile forhold. Det er foretrukket å utføre disseksjon under en disseksjon hette for å unngå forurensning. Overflaten av hetten bør renses med etanol. Alle disseksjon instrumenter må steriliseres og oppbevares i en steril petriskål. Væskene (medium, disseksjon medium) må holdes lukket og satt i et isbad. Hvert embryo skal samles i in…

Representative Results

Fugedannende vev ble behandlet ved FP cm, og prøvene ble bearbeidet for analyse av reseptor-nivåer i Western blot. Anvendelse av FP cm ble vist å øke nivåene av et veilednings reseptor, PlexinA1, som medierer følsomheten av fugedannende axoner til midtlinjen avstøtende Semaphorin3B etter å ha krysset (figur 2). Denne viste at signalene utgitt av FP regulere PlexinA1 nivåer 4,6. <img alt="Figur 1" …

Discussion

Produksjon av gulv-plate kondisjonerte medium gir en effektiv og enkel måte for å vurdere de biologiske egenskapene til gulvplate utgitt signaler.

Plasma-trombin matrise gir utmerket tilstand for vev overlevelse. Likevel kan dette beriket miljø være en begrensning for enkelte typer eksperimenter. Således kan bunnplaten vev også dyrkes i agarose matrise. Kvaliteten på gulvplaten kondisjonerte medium kan vurderes ved påvisning av kjente gulv-plate utgitt signaler, som GDNF (fig…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Karine Kindbeiter, Muriel Bozon, og Florie Reynaud for deres hjelp. Arbeidet er støttet av CNRS, ANR YODA program og LABEX DevWeCan.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
REAGENTS REQUIRED
PBS Invitrogen 14190-094
HBSS, Ca2+/Mg2+– free Invitrogen 14170-088
Glucose Sigma G-7021
Neurobasal Invitrogen 21103-049
Plasma Sigma P-3266 1mg/ml (Reconstitute in H2O and filtrate)
Thrombin Sigma T-4648 10mg/ml(Reconstitute in H2O and filtrate)
B27 Invitrogen 17504-044 50X
Hepes (260g/mol) Sigma H-7006
EDTA Sigma E-5513 0,5M pH8
MgCL2 Euromedex 2189 1M
Glycerol VWR 24388.295
IGEPAL Sigma I-3021
Complete Protease inhibitor Cocktail Tablets Roche 04 693 116 001
Sodium Orthovanadate (Na3VO4) Sigma S-6508
distilled H2O
Table 1. Reagents required
TOOLS AND MATERIAL
Surgical scissors Fine Science Tools 14002-12
Adson forceps Fine Science Tools 11027-12
Dumont #5 Fine Tips forceps Fine Science Tools 11254-20
micro knives Fine Science Tools 10136-14
Table 2. Tools and material
Dissection and FP culture
Ethanol 70%
dissection hood
dissection microscope
Petri dishes
glass coverslips 18mm x 18mm
Bunsen gas burner
24 well plate
tissue culture incubator (37°C, 5% CO2, humidity controlled)
Centrifuge
RECIPES
FP culture media
Neurobasal
B27 1/50e dilution from stock
HBSS – Thrombin
HBSS 1 ml
Thrombin 10mg/ml 30 μl
Lysis Buffer pH7,4
Hepes (260 g/mol) 25mM
EDTA (pH8) 5mM
MgCL2 1mM
Glycerol 10%
IGEPAL (NP40) 0.10%
Protease Inhibitor Cocktail 1X
Sodium Orthovanadate 0,2M
H2O
Laemmli Buffer
Tris 0,5M, pH 6,8 375 mM
SDS 6%
Glycerol 60%
DTT 0,6M
Bromophenol blue
H2O

References

  1. Nawabi, H., Castellani, V. Axonal commissures in the central nervous system: how to cross the midline. Cell. Mol. Life Sci. 68, 2539-2553 (2011).
  2. Placzek, M., Briscoe, J. The floor plate: multiple cells, multiple signals. Nat. Rev. Neurosci. 6, 230-240 (2005).
  3. Chedotal, A. Further tales of the midline. Curr. Opin. Neurobiol. 21, 68-75 (1016).
  4. Nawabi, H., et al. A midline switch of receptor processing regulates commissural axon guidance in vertebrates. Genes Dev. 24, 396-410 (2010).
  5. Ruiz de Almodovar, C., et al. VEGF mediates commissural axon chemoattraction through its receptor Flk1. Neuron. 70, 966-978 (2011).
  6. Charoy, C., et al. gdnf activates midline repulsion by Semaphorin3B via NCAM during commissural axon guidance. Neuron. 75, 1051-1066 (2012).
  7. Kiecker, C., Lumsden, A. The role of organizers in patterning the nervous system. Annu. Rev. Neurosci. 35, 347-367 (2012).
  8. Le Dreau, G., Marti, E. Dorsal-ventral patterning of the neural tube: a tale of three signals. Dev. Neurobiol. 72, 1471-1481 (2012).
  9. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  10. Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. J. Vis. Exp. , (2010).
  11. Salinas, P. C. The morphogen sonic hedgehog collaborates with netrin-1 to guide axons in the spinal cord. Trends Neurosci. 26, 641-643 (2003).
  12. Bechara, A., et al. FAK-MAPK-dependent adhesion disassembly downstream of L1 contributes to semaphorin3A-induced collapse. EMBO J. 27, 1549-1562 (2008).

Play Video

Cite This Article
Charoy, C., Arbeille, E., Thoinet, K., Castellani, V. Culture of Isolated Floor Plate Tissue and Production of Conditioned Medium to Assess Functional Properties of Floor Plate-released Signals. J. Vis. Exp. (84), e50884, doi:10.3791/50884 (2014).

View Video