Culture of Isolert Floor Plate Tissue og Produksjon av kondisjonerte medium å vurdere funksjonelle egenskaper gulvplate utgitt Signaler

Summary

En gulvplate er en viktig struktur av utviklingsryggmargen, gir diffusible signaler til stamfedre og differensierende nevroner. Vi beskriver en metode for å produsere gulv-plate kondisjonerte medium, for å bruke den på ny ryggmargsvevet, og for å vurdere konsekvensene av proteiner som er av interesse ved biokjemi.

Abstract

Under utvikling, stamfedre og post-mitotiske nevroner mottar signaler fra tilstøtende områder som regulerer deres skjebne. I gulv-plate er en gruppe av gliaceller lining ependymal kanalen ved ventral stilling. Gulvet-plate uttrykker viktige morphogens bidrar til fordelingen av celle linjene i ryggmargen. Ved senere utviklingsstadier, gulvplate regulerer navigering av axoner i ryggmargen, som fungerer som en barriere for å hindre kryssing av ipsilaterale axoner og kontrollerende midtlinjen krysset ved commissural axons ^en. Disse funksjoner oppnås ved sekresjon av forskjellige lede signaler. Noen av disse stikkordene fungere som lokkemidler for de voksende axons mens andre regulerer veiledning reseptorer og nedstrøms signal å modulere følsomheten av axoner til de lokale veiledningspekepinner ^2,3. Her beskriver vi en fremgangsmåte som gjør det mulig å undersøke egenskapene til gulv-plate avledet signaler i forskjellige utviklopmental sammenhenger, basert på produksjon av gulv-Plate kondisjonerte medium (FP ^{cm) 4-6.} Deretter eksemplifiserer bruken av denne FP ^cm i sammenheng med axon veiledning. Først blir ryggmargs isolert fra mus embryo ved E12.5 og gulv-platen blir dissekert ut og dyrket i et plasma-trombin matriks (figur 1). Andre to dager senere, er commissural vev dissekert ut fra E12.5 embryoer, triturert og utsatt for FP ^cm. For det tredje er vevet behandles for Western blot analyse av fugedannende markører.

Introduction

Gulvet-plate er et velkjent mønster sentrum av utviklingsryggmargen, som spiller nøkkelroller i spesifikasjonen av stamfedre og postmitotic celle slektslinjer og kontrollerende axon navigasjon ^7,8. Den eksperimentelle fremgangsmåte som er beskrevet her for å produsere FP ^cm kan undersøkere for å vurdere de funksjonelle egenskaper av gulvplate-avledede signaler i en ulike sammenhenger av utviklingsprosesser, fra celle mønster og overlevelse til celle og axon migrasjon.

For å illustrere anvendelsen av en slik FP ^cm, er ryggryggmargsvev som inneholder commissural neuroner dissekert, dilacerated og stimulert med FP ^cm. Vevet kan så bli behandlet for Western blot analyse. Dette gjør det mulig å undersøke reguleringer av axon veiledning maskiner av gulv-plate utgitt signaler. Metoden for behandling av dilacerated friskt vev har den store fordelen av å bevare den mikromiljøet av celler innenfor the vev. Dermed konsekvensene av behandlingen av FP ^cm eller noen typer behandling vurderes i et mer fysiologisk måte enn i celler og vev kultur forhold.

Protocol

DAG 1 En. Disseksjon av ryggmargen gulvplate (FP) fra E12.5 mus embryoer Merk: Hele prosedyren krever bruk av sterile forhold. Det er foretrukket å utføre disseksjon under en disseksjon hette for å unngå forurensning. Overflaten av hetten bør renses med etanol. Alle disseksjon instrumenter må steriliseres og oppbevares i en steril petriskål. Væskene (medium, disseksjon medium) må holdes lukket og satt i et isbad. Hvert embryo skal samles i in…

Representative Results

Fugedannende vev ble behandlet ved FP cm, og prøvene ble bearbeidet for analyse av reseptor-nivåer i Western blot. Anvendelse av FP cm ble vist å øke nivåene av et veilednings reseptor, PlexinA1, som medierer følsomheten av fugedannende axoner til midtlinjen avstøtende Semaphorin3B etter å ha krysset (figur 2). Denne viste at signalene utgitt av FP regulere PlexinA1 nivåer 4,6. <img alt="Figur 1" …

Discussion

Produksjon av gulv-plate kondisjonerte medium gir en effektiv og enkel måte for å vurdere de biologiske egenskapene til gulvplate utgitt signaler.

Plasma-trombin matrise gir utmerket tilstand for vev overlevelse. Likevel kan dette beriket miljø være en begrensning for enkelte typer eksperimenter. Således kan bunnplaten vev også dyrkes i agarose matrise. Kvaliteten på gulvplaten kondisjonerte medium kan vurderes ved påvisning av kjente gulv-plate utgitt signaler, som GDNF (fig…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTS REQUIRED
PBS	Invitrogen	14190-094
HBSS, Ca2+/Mg2+– free	Invitrogen	14170-088
Glucose	Sigma	G-7021
Neurobasal	Invitrogen	21103-049
Plasma	Sigma	P-3266	1mg/ml (Reconstitute in H2O and filtrate)
Thrombin	Sigma	T-4648	10mg/ml(Reconstitute in H2O and filtrate)
B27	Invitrogen	17504-044	50X
Hepes (260g/mol)	Sigma	H-7006
EDTA	Sigma	E-5513	0,5M pH8
MgCL2	Euromedex	2189	1M
Glycerol	VWR	24388.295
IGEPAL	Sigma	I-3021
Complete Protease inhibitor Cocktail Tablets	Roche	04 693 116 001
Sodium Orthovanadate (Na3VO4)	Sigma	S-6508
distilled H2O
			Table 1. Reagents required
			TOOLS AND MATERIAL
Surgical scissors	Fine Science Tools	14002-12
Adson forceps	Fine Science Tools	11027-12
Dumont #5 Fine Tips forceps	Fine Science Tools	11254-20
micro knives	Fine Science Tools	10136-14
			Table 2. Tools and material
			Dissection and FP culture Ethanol 70% dissection hood dissection microscope Petri dishes glass coverslips 18mm x 18mm Bunsen gas burner 24 well plate tissue culture incubator (37°C, 5% CO2, humidity controlled) Centrifuge RECIPES FP culture media Neurobasal B27 1/50e dilution from stock HBSS – Thrombin HBSS 1 ml Thrombin 10mg/ml 30 μl Lysis Buffer pH7,4 Hepes (260 g/mol) 25mM EDTA (pH8) 5mM MgCL2 1mM Glycerol 10% IGEPAL (NP40) 0.10% Protease Inhibitor Cocktail 1X Sodium Orthovanadate 0,2M H2O Laemmli Buffer Tris 0,5M, pH 6,8 375 mM SDS 6% Glycerol 60% DTT 0,6M Bromophenol blue H2O