Cultura de Tecidos isolada Piso Placa e Produção de meio condicionado Para avaliar as propriedades funcionais dos pavimentos Sinais lançado placa

Summary

A placa do piso é uma estrutura fundamental das desenvolvimento da medula espinhal, que fornecem sinais difusíveis para progenitores e diferenciação de neurônios. Nós descrevemos um método para produzir laje meio condicionado, para aplicá-lo ao novo tecido da medula espinhal, e para avaliar as consequências sobre as proteínas de interesse pela bioquímica.

Abstract

Durante o desenvolvimento, progenitores e os neurônios pós-mitóticas receber sinais de territórios adjacentes que regulam o seu destino. A laje é um grupo de células gliais que revestem o canal ependimária na posição ventral. A laje expressa morfogénios fundamentais que contribuem para o padrão de linhagens de células da medula espinhal. Em fases posteriores de desenvolvimento, a laje regula a navegação dos axônios na medula espinhal, agindo como uma barreira para impedir a passagem dos axônios ipsi e cruzamento da linha média de controle por axônios comissurais ^1. Estas funções são conseguidas através da secreção de várias pistas de orientação. Algumas dessas sugestões funcionar como atrativos e repelentes para os axônios em crescimento, enquanto outros regular receptores de orientação e sinalização a jusante para modular a sensibilidade dos axônios para as pistas de orientação locais ^2,3. Aqui, descrevemos um método que permite estudar o comportamento de andar de placa sinais derivados de uma variedade de desencontextos lopmental, com base na produção de médio laje condicionado (FP ^{cm) 4-6.} Em seguida, exemplificam o uso deste FP ^cm no contexto da orientação do axónio. Em primeiro lugar, a espinal medula é isolado de embrião de ratinho em E12.5 e a laje é dissecados e cultivados numa matriz de plasma de trombina (Figura 1). Segundo, dois dias depois, tecidos comissural são dissecados a partir de embriões E12.5, triturado e exposto para o ^cm FP. Em terceiro lugar, o tecido são processadas para análise de Western blot de marcadores comissurais.

Introduction

A laje é um centro de padronização bem conhecido da medula espinhal em desenvolvimento, desempenhando papéis importantes na especificação de progenitores e linhagens de células pós-mitóticas e controlar a navegação axônio ^7,8. O procedimento experimental descrito aqui para produzir FP ^cm permite aos investigadores para avaliar as propriedades funcionais dos sinais provenientes de placas de piso em um de vários contextos de processos de desenvolvimento, a partir de padrões de células e a sobrevivência das células e a migração do axónio.

Para ilustrar o uso de tais ^cm FP, os tecidos da medula espinal dorsal contendo neurónios comissurais são dissecados, dilacerada e estimuladas com o ^cm FP. Os tecidos podem então ser processadas para análise de Western blot. Isto permite investigar os regulamentos da máquina orientação do axônio por sinais liberados laje. O método de tratamento de tecido fresco dilacerada mantém a grande vantagem de preservar o microambiente das células dentro the tecidos. Assim, as conseqüências do tratamento por FP ^cm ou quaisquer tipos de tratamento são avaliados de forma mais fisiológica do que em condições de cultura de tecido celular e.

Protocol

DIA 1 1. Dissecção da medula espinhal Piso Plate (FP) de E12.5 embriões de camundongos Nota: O procedimento completo requer o uso de condições de esterilidade. É preferível realizar o esvaziamento sob uma capa de dissecação para evitar a contaminação. A superfície da capa deverá ser limpa com etanol. Todos os instrumentos de dissecção devem ser esterilizados e mantidos em uma placa de Petri estéril. Os líquidos (médio, médio dissec?…

Representative Results

Comissurais tecidos foram tratados pelo cm PF e as amostras foram processadas para análise de níveis de receptores em Western blot. Aplicação das cm FP foi demonstrado que o aumento dos níveis de um receptor de orientação, PlexinA1, que medeia a sensibilidade de axónios comissurais para o repelente Semaphorin3B linha média depois de atravessar (Figura 2). Isto revelou que os sinais liberados pelo FP regular os níveis de PlexinA1 4,6. <p class="jove_content"…

Discussion

A produção de laje meio condicionado oferece uma maneira fácil e eficiente para avaliar as propriedades biológicas dos sinais liberados placa de fundo.

A matriz de plasma de trombina oferece excelentes condições para a sobrevivência dos tecidos. No entanto, este ambiente enriquecido pode ser uma limitação para alguns tipos de experiências. Assim, o tecido de placa de fundo pode também ser cultivadas em matriz de agarose. A qualidade do meio condicionado placa de piso pode ser aval…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTS REQUIRED
PBS	Invitrogen	14190-094
HBSS, Ca2+/Mg2+– free	Invitrogen	14170-088
Glucose	Sigma	G-7021
Neurobasal	Invitrogen	21103-049
Plasma	Sigma	P-3266	1mg/ml (Reconstitute in H2O and filtrate)
Thrombin	Sigma	T-4648	10mg/ml(Reconstitute in H2O and filtrate)
B27	Invitrogen	17504-044	50X
Hepes (260g/mol)	Sigma	H-7006
EDTA	Sigma	E-5513	0,5M pH8
MgCL2	Euromedex	2189	1M
Glycerol	VWR	24388.295
IGEPAL	Sigma	I-3021
Complete Protease inhibitor Cocktail Tablets	Roche	04 693 116 001
Sodium Orthovanadate (Na3VO4)	Sigma	S-6508
distilled H2O
			Table 1. Reagents required
			TOOLS AND MATERIAL
Surgical scissors	Fine Science Tools	14002-12
Adson forceps	Fine Science Tools	11027-12
Dumont #5 Fine Tips forceps	Fine Science Tools	11254-20
micro knives	Fine Science Tools	10136-14
			Table 2. Tools and material
			Dissection and FP culture Ethanol 70% dissection hood dissection microscope Petri dishes glass coverslips 18mm x 18mm Bunsen gas burner 24 well plate tissue culture incubator (37°C, 5% CO2, humidity controlled) Centrifuge RECIPES FP culture media Neurobasal B27 1/50e dilution from stock HBSS – Thrombin HBSS 1 ml Thrombin 10mg/ml 30 μl Lysis Buffer pH7,4 Hepes (260 g/mol) 25mM EDTA (pH8) 5mM MgCL2 1mM Glycerol 10% IGEPAL (NP40) 0.10% Protease Inhibitor Cocktail 1X Sodium Orthovanadate 0,2M H2O Laemmli Buffer Tris 0,5M, pH 6,8 375 mM SDS 6% Glycerol 60% DTT 0,6M Bromophenol blue H2O