Cultura de tejido aislado de la placa de piso y Producción de medio acondicionado para evaluar las propiedades funcionales de piso Señales Plate-lanzado

Summary

La placa de piso es una estructura fundamental de las neuronas en desarrollo de la médula espinal, que proporcionan señales difusibles a progenitores y diferenciadoras. Se describe un método para producir suelo-placa de medio condicionado, para aplicarlo al tejido de la médula espinal fresco, y para evaluar las consecuencias de las proteínas de interés por la bioquímica.

Abstract

Durante el desarrollo, los progenitores y neuronas post-mitóticas reciben señales de los territorios adyacentes que regulan su destino. La placa de suelo-es un grupo de células gliales que revisten el canal ependimal en la posición ventral. La placa de suelo-expresa morfógenos clave que contribuyen al patrón de linajes de células en la médula espinal. En etapas posteriores del desarrollo, la placa de suelo regula la navegación de los axones en la médula espinal, actuando como una barrera para prevenir el cruce de los axones ipsilaterales y cruzando la línea media de control por los axones comisurales ^1. Estas funciones se logran a través de la secreción de varias señales de orientación. Algunas de estas señales actúan como atrayentes y repelentes para los axones en crecimiento, mientras que otros regulan los receptores de orientación y de señalización aguas abajo para modular la sensibilidad de los axones a las señales de orientación locales ^2,3. Aquí se describe un método que permite la investigación de las propiedades de las señales derivadas piso de placa en una variedad de desacontextos lopmental, basadas en la producción de medio piso-Plate acondicionado (FP ^{cm) 4-6.} A continuación, ejemplifican el uso de esta FP ^cm en el contexto de la guía de axones. En primer lugar, la médula espinal está aislada de embrión de ratón en E12.5 y la placa de piso se diseccionó y se cultiva en una matriz de plasma-trombina (Figura 1). Segunda dos días más tarde, el tejido comisural se disecan a cabo a partir de embriones E12.5, trituró y se expone a la ^cm FP. En tercer lugar, el tejido se procesan para el análisis de transferencia de Western de marcadores comisurales.

Introduction

La placa de piso es un centro patrón bien conocido de la médula espinal en desarrollo, juega un papel clave en la especificación de los progenitores y los linajes de células postnatales y el control de navegación de los axones ^7,8. El procedimiento experimental descrito aquí para producir FP ^cm permite a los investigadores para evaluar las propiedades funcionales de las señales de derivados de chapa piso en un diversos contextos de los procesos de desarrollo, a partir del patrón celular y la supervivencia celular y la migración a axón.

Para ilustrar el uso de tales FP ^cm, los tejidos de la médula espinal dorsal que contienen neuronas comisurales se diseccionan, dilacerada y se estimularon con el ^CM FP. Los tejidos se pueden procesar para el análisis de transferencia de Western. Esto permite que la investigación de las regulaciones de la maquinaria de guiado de los axones por las señales liberadas piso de placa. El método de tratamiento de tejido fresco dilacerada tiene la gran ventaja de conservar el microambiente de las células dentro ªe tejido. Así, las consecuencias del tratamiento por FP ^cm o cualquier tipo de tratamiento se evalúan de una manera más fisiológica que en células y condiciones de cultivo de tejidos.

Protocol

DÍA 1 1. La disección de la médula espinal Placa del piso (FP) de E12.5 embriones de ratón Nota: Todo el procedimiento requiere el uso de condiciones estériles. Es preferible llevar a cabo la disección bajo una campana de disección para evitar la contaminación. La superficie de la campana debe ser limpiada con etanol. Todos los instrumentos de disección deben ser esterilizados y se mantienen en una placa de Petri estéril. Los líquidos (medi…

Representative Results

Commissural tejidos fueron tratados por el CM FP y las muestras se procesaron para el análisis de los niveles del receptor en Western blot. Aplicación de la cm FP ha demostrado aumentar los niveles de un receptor de orientación, PlexinA1, que media en la sensibilidad de los axones comisurales para el repelente Semaphorin3B después de cruzar la línea media (Figura 2). Esto reveló que las señales dadas a conocer por la FP regular los niveles PlexinA1 4,6. <p cla…

Discussion

La producción de suelo-placa de medio acondicionado proporciona una manera fácil y eficiente para la evaluación de las propiedades biológicas de las señales liberadas placa planta.

La matriz-trombina de plasma ofrece excelentes condiciones para la supervivencia del tejido. Sin embargo, este ambiente enriquecido podría ser una limitación para algunos tipos de experimentos. Por lo tanto, el tejido placa de suelo también se puede cultivar en la matriz de agarosa. La calidad del medio de…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTS REQUIRED
PBS	Invitrogen	14190-094
HBSS, Ca2+/Mg2+– free	Invitrogen	14170-088
Glucose	Sigma	G-7021
Neurobasal	Invitrogen	21103-049
Plasma	Sigma	P-3266	1mg/ml (Reconstitute in H2O and filtrate)
Thrombin	Sigma	T-4648	10mg/ml(Reconstitute in H2O and filtrate)
B27	Invitrogen	17504-044	50X
Hepes (260g/mol)	Sigma	H-7006
EDTA	Sigma	E-5513	0,5M pH8
MgCL2	Euromedex	2189	1M
Glycerol	VWR	24388.295
IGEPAL	Sigma	I-3021
Complete Protease inhibitor Cocktail Tablets	Roche	04 693 116 001
Sodium Orthovanadate (Na3VO4)	Sigma	S-6508
distilled H2O
			Table 1. Reagents required
			TOOLS AND MATERIAL
Surgical scissors	Fine Science Tools	14002-12
Adson forceps	Fine Science Tools	11027-12
Dumont #5 Fine Tips forceps	Fine Science Tools	11254-20
micro knives	Fine Science Tools	10136-14
			Table 2. Tools and material
			Dissection and FP culture Ethanol 70% dissection hood dissection microscope Petri dishes glass coverslips 18mm x 18mm Bunsen gas burner 24 well plate tissue culture incubator (37°C, 5% CO2, humidity controlled) Centrifuge RECIPES FP culture media Neurobasal B27 1/50e dilution from stock HBSS – Thrombin HBSS 1 ml Thrombin 10mg/ml 30 μl Lysis Buffer pH7,4 Hepes (260 g/mol) 25mM EDTA (pH8) 5mM MgCL2 1mM Glycerol 10% IGEPAL (NP40) 0.10% Protease Inhibitor Cocktail 1X Sodium Orthovanadate 0,2M H2O Laemmli Buffer Tris 0,5M, pH 6,8 375 mM SDS 6% Glycerol 60% DTT 0,6M Bromophenol blue H2O